专利名称：草莓防褐变专用初代培养基及其生产组培草莓苗的方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种防止草莓组织培养过程中褐变的培养基及利用其组培繁育草莓苗的方法。
背景技术：
草莓是蔷薇科草莓属多年生草本植物，是世界七大水果之一，营养丰富，有“水果皇后”的美称。另外食用草莓对肠胃病和贫血病有一定的疗效，对促进智力发育有重要作用。深受国内外消费者的喜爱。草莓是一种栽培周期短、结果早、见效快的经济作物，但是草莓的病毒害严重影 响草莓的生产。作为高级浆果的草莓，在我国目前的生产栽培上多沿用无性繁殖种苗主要方法是匍匐茎繁殖和分株繁殖，但这两种方法效率低、种苗易退化、易造成病毒蔓延。王国平(1988)等调查，我国栽培草莓带病毒植株率过80%以上，戴子林(1995)等调查，我国长江流域感染大面积植株感染率在50%以上，感染了病毒病的草莓结果会存在变小、畸形、品质差、生长缓慢等问题，一般减产30%-80%，并逐年加重；严重影响草莓的长势、品质和产量，对病毒病目前还没有药剂可以防治。目前，解决草莓病毒病的主要方法是通过草莓脱毒组培技术来扩繁草莓脱毒苗，使草莓种苗回复品种的优良性状以达到优质、高产的目的。目前，常见草莓外植体组织培养类型包括草莓茎尖组织培养、草莓叶片和叶柄组织培养、草莓茎段组织培养、草莓花药培养。草莓组织培养程序一般可分为外植体准备、苗诱导、增殖培养、生根培养、移植驯化等几个阶段，其中在每个阶段的培养基选用、温室条件等对组培苗的繁育系数、脱毒效果、再生率等关键参数有着重要影响。其中MS培养基是草莓组培过程中最常用的培养基，即Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的具备较高无机盐和离子浓度的稳定培养基，其硝酸盐含量高、养分的数量和比例合适，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长，是目前被广泛应用于植物组织培养快速繁殖的基本培养基。但是，在草莓组织培养中，褐变是影响初代培养褐化和限制初代培养再生率的重要原因，即外植体或培养材料接种后在组织培养过程中，由于切割造成机械损伤，伤口处分泌出酚类化合物，在有氧的条件下，切面细胞中的酚类物质为多酚氧化酶催化，氧化为醌，醌再通过非酶促反应产生有色物质而导致组织褐变，变成棕褐色或暗褐色，并逐渐扩散到培养基中，抑制细胞内其它酶的活性，影响细胞的正常代谢，毒害整个组织，甚至导致组织死亡。中国发明专利(申请号201010252871. 4)公开了一套草莓茎尖组培专用的初代培养基、继代培养基和生根培养基以及用该系列培养基培养草莓茎尖组织生产脱毒苗的方法。其所述的初代培养基是以MS培养基为基本培养基，并在其中添加浓度为O. 2-0. 5 mg/L的6-苄氨基嘌呤(BA)和O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)，并在初代培养时进行暗培养预防褐化，但其防止褐变的主要手段还是在于减少光照以抑制PPO的活性，防止多酚类物质的氧化，从而减少被培养的组织褐变。但这种技术手段下初代培养的成活率仅从普通的40%左右提升到50-65%，还有提升的空间。王栋等在《植物组织培养中的褐化现象及其防止措施》(黑龙江农业科学2008(1)7 10)中分析了植物组织培养过程中出现褐变的若干因素，并公开了利用吸附剂(有聚乙烯吡咯烷酮、活性炭等)和抗氧化剂(抗坏血酸、硫代硫酸钠、柠檬酸、L 一半胱氨酸、谷胱甘肽、芸香苷、二硫苏糖醇、酪氨酸、巯基乙醇、卵清蛋白、维生素B、维生素E、有机酸、蛋白质水解产物、氨基酸、亚硫氢酸钠、氰化钾、多胺)等用来减少植物组织培养中的褐变现象。其主要原理在于通过吸附组织培养过程中由于切割造成机械损伤处分泌的酚类化合物，或者通过上述抗氧化剂防止扩散到培养基中的酚类化合物被氧化成褐色的醌类物质，从而达到防止褐变的作用。但是，这种方法的不足之处在于只能被动解决扩散到培养基质中的酚类化合物，在实际生产过程中还是会存在较高的褐变现象
发明内容
本发明的目的在于提供一种相对于现有防褐变技术能更有效预防草莓组织培养过程中发生褐变的专用初代培养基。 本发明的另一目的在于提供一种再生率高的组培草莓苗生产方法。本发明的技术方案是一种能有效预防草莓组织培养过程中发生褐变的专用初代培养基，以O. 2-0. 5 mg/L的6-苄氨基嘌呤(BA)和O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培养基为基本培养基，并在其中添加浓度为5-15 mg/L的抗坏血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素内酯(BR)，其中pH值保持在5. 7-5. 8 ；
上述的草莓防褐变专用初代培养基，其中的抗坏血酸(VC)的浓度为8-12 mg/L,油菜素内酯(BR)的浓度为O. 05-0. 3 mg/L。上述的草莓防褐变专用初代培养基，其中的抗坏血酸(VC)的浓度为10 mg/L，油菜素内酯(BR)的浓度为O.1 mg/L。上述的草莓防褐变专用初代培养基还可以包含有O. 02 mg/L的赤霉素(GA3)和
O.3mg/L的激动素(KT)；
上述的草莓防褐变专用初代培养基中O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)可以用O. 2mg/L的口引哚乙酸(IAA)来代替。本发明的生产方法的技术方案是一种再生率高的组培草莓苗生产方法，其步骤包括1、取材。每年的6-8月，选择植株生长健壮，匍匐茎充实，尖端生长良好，无病虫害的优良植株取其茎尖或花药，作为组织培养的外植体。2、消毒。材料取来修整后用纱布包好放在自来水龙头下冲洗2-4小时(以茎尖为例)，然后进行表面消毒。先用70%酒精漂洗半分钟，然后用O. 1%的新洁尔灭浸泡15-20分钟，再用O. 1%的升汞(氯化汞)消毒5-8分钟，最后用1-2%的过氧乙酸消毒I分钟。每次都要用无菌水冲洗3-4次后再进行下一次消毒。整个消毒过程都应在超净工作台内完成。3、接种。接种在超净工作台内进行，接种前要先用酒精灯对接种用具(镊子、接种针、接种架等)消毒自然放凉。先用镊子一层层的剥去茎尖外的幼叶和鳞片，然后在解剖镜下找到生长点(可带1-2个叶原基)用接种针挑出生长点(小于O. 5毫米)，放入盛有上述草莓防褐变专用初代培养基的培养瓶内，封好瓶口，置于培养室内培养成小植株。
4、室内培养。培养室要求干净清洁，室内装有紫外线杀菌灯，每天要对室内进行消毒，以防污染。培养温度20-28°C，最适温度25°C，相对湿度70%，光照强度1000-2000勒克斯，每日光照10小时左右。5、继代培养。每培养25-30天，培养瓶内的小植株就会分出3_5个小植株，把这些小植株分出放于由含有O. 2-0. 5 mg/L的6-苄氨基嘌呤(BA)的MS培养基组成的继代培养基内培养；过20-30天后又会长出小植株，如此反复进行继代培养，增加繁殖系数。6、诱导生根。根据生产需要可在1-2月份集中一批苗子生根。草莓试管苗生根很容易，有的在继代培养基上便可生根。或者在培养基中加入O. 5毫克/升的LBAj^ 30天左右便可长出6-10条长约2-3厘米的小根。7、温室驯化。把生好根的小苗经光照锻炼7-10天，从试管内取出，洗净根部培养基，移栽入土质疏松的沙土掺入少量有机质的营养土内，移栽后要浇透水，支小拱棚覆盖塑
料薄膜保湿。驯化温度以15-20°C，前两周空气相对湿度80-100%，第三周开始短时间放风，放风强度逐渐加大，至移栽后第四周可去掉覆盖物。根据情况每天或隔天喷水一次，保持土壤湿润而不积水为宜。时间为2-3个月以小苗发出5-6片新叶为宜。8、病毒鉴定和检验。利用电子显微镜检测草莓病毒，即利用负染色法及超薄切片法处理待测叶片，然后在电子显微镜下观察，如果被测叶片中含有较多病毒颗粒子，可被直接观察到。经检验确认无毒的草莓苗移入网纱大棚进行繁殖。9、网纱大棚内繁殖。草莓病毒的传播主要靠蚜虫、飞虱等虫媒传播。把无病毒苗放入网纱内繁殖可防止蚜虫等传播病毒。网纱大棚内土壤要经过严格消毒，并注意定期喷施杀蚜虫药，网纱大棚内育苗与苗圃育苗大体一致。本发明的有益效果在于1、利用本发明提供的初代培养基，即以含有O. 2-0. 5 mg/L的6-苄氨基嘌呤(BA)和O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培养基为基本培养基，再添加浓度为5-15 mg/L的抗坏血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素内酯而组成的初代培养基，在进行初代培育过程中，其中的抗坏血酸和油菜素内酯可以发挥防褐变方面的协同作用，一方面通过发挥抗坏血酸对渗入到培养基中酚类物质的抗氧化作用体现直接还原作用，另一方面油菜素内酯在外植体内部能增强草莓组织内部抗氧化酶的活性，减少褐变根本因素醌类物质的产生和扩展；两者的结合能有效防止草莓初代培养中褐变现象的产生，将褐变率从常规的30%以上降低到20%以下。2、褐变率的降低和初代培养草莓组织中的抗氧化情况的改善，萌发率从40-60%提升至70%以上。
具体实施例方式实施例
在6-8月选择植株生长健壮，匍匐茎充实，尖端生长良好，无病虫害的优良草莓植株取其茎尖组织培养的外植体。将茎尖组织修整后用纱布包好放在自来水龙头下冲洗2-4小时，然后进行表面消毒。先用70%酒精漂洗半分钟，然后用O. 1%的新洁尔灭浸泡15-20分钟，再用O. 1%的升汞(氯化汞)消毒5-8分钟，最后用1-2%的过氧乙酸消毒I分钟。每次都要用无菌水冲洗3-4次后再进行下一次消毒。整个消毒过程都应在超净工作台内完成。
对接种用具(镊子、接种针、接种架等)消毒自然放凉后用镊子一层层的剥去茎尖外的幼叶和鳞片，然后在解剖镜下找到生长点(可带1-2个叶原基)用接种针挑出生长点(小于0.5毫米)，放入盛有不同激素配比的草莓防褐变专用初代培养基的培养瓶内，封好瓶口，培养温度20-28°C，最适温度25°C，相对湿度70%，光照强度1000-2000勒克斯，每日光照10小时左右，置于培养室内培养成小植株。在MS培养基中添加不同浓度激素和配方组成的草莓防褐变专用初代培养基的具体组成和初代培养效果如下表所示
权利要求
1.一种草莓防褐变专用初代培养基，以含有O. 2-0. 5 mg/L的6-苄氨基嘌呤(BA)和O.1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培养基为基本培养基，其特征在于还含有浓度为5_15 mg/L的抗坏血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素内酯(BR)。
2.根据权利要求1所述的草莓防褐变专用初代培养基，其特征在于所述的基本培养基还可以含有浓度为O. 02 mg/L的赤霉素(GA3)和O. 3mg/L的激动素(KT)。
3.根据权利要求1所述的草莓防褐变专用初代培养基，其特征在于所述的O.1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)可以用O. 2mg/L的吲哚乙酸(IAA)来代替。
4.根据权利要求1所述的草莓防褐变专用初代培养基，其特征在于所述的基本培养基的pH控制在5. 7-5.8。
5.根据权利要求1所述的草莓防褐变专用初代培养基，其特征在于所述的抗坏血酸 (VC)的浓度为8-12 mg/L，油菜素内酯(BR)的浓度为O. 05-0. 3 mg/L。
6.根据权利要求1所述的草莓防褐变专用初代培养基，其特征在于所述的抗坏血酸 (VC)的浓度为10 mg/L，油菜素内酯(BR)的浓度为O.1 mg/L。
7.—种生产组培草莓苗的方法，其特征在于其步骤包括，(1)取材；每年的6-8月，选择植株生长健壮，匍匐茎充实，尖端生长良好，无病虫害的优良植株取其茎尖或花药，作为组织培养的外植体；(2)消毒;(3)配制草莓防褐变专用初代培养基，完成接种后封好瓶口，置于培养室内培养成小植株；所述草莓防褐变专用初代培养基，以含有O. 2-0. 5 mg/L的6-苄氨基嘌呤(BA)和O.1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培养基为基本培养基，还含有浓度为5-15 mg/L的抗坏血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素内酯(BR)；(4)室内培养和继代培育；当培养瓶内的小植株分出3-5个小植株时，把这些小植株分出放于含有O. 2-0. 5 mg/L的6-苄氨基嘌呤(BA)的MS培养基组成的继代培养基内培养并反复进行继代培养；(5)温室驯化及病毒鉴定；把生好根的小苗经光照锻炼7-10天后移栽入土质疏松的沙土掺入少量有机质的营养土内，进行驯化并利用电子显微镜检测草莓病毒；(6)网纱大棚内繁殖；将网纱大棚内土壤严格消毒后，把无病毒苗放入网纱内繁殖。
8.根据权利要求7所述的生产组培草莓苗的方法，其特征在于所述步骤(2)消毒中， 采用70%酒精、O. 1%的新洁尔灭、O. 1%的升汞(氯化汞)、1-2%的过氧乙酸等对植物组织进行消毒。
9.根据权利要求7所述的生产组培草莓苗的方法，其特征在于所述步骤(4)室内培养和继代培育中，其室内培养的培养温度20-28°C，相对湿度70%，光照强度1000-2000勒克斯，每日光照10小时左右。
10.根据权利要求9所述的生产组培草莓苗的方法，其特征在于所述室内培养的培养温度的最适温度为25V。
全文摘要
本发明公开了一种草莓防褐变专用初代培养基。其以含有0.2-0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤(BA)和0.1-0.2mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培养基为基本培养基，并加入了浓度为5-15mg/L的抗坏血酸(VC)和0.001-0.5mg/L的油菜素内酯(BR)，可大幅度降低草莓组织初代培养过程中的褐变率并提高萌发率。本发明还公开了利用上述培养基培养草莓茎尖组织生产组培草莓苗的方法，包括草莓苗的取材、消毒、接种和初代培育、继代培养、驯化及病毒鉴定、网纱大棚内繁殖等步骤。本发明能有效防止草莓初代培养中褐变现象的产生，初代培养草莓组织中的抗氧化情况有效改善，萌发率从40-60%提升至70%以上。
文档编号A01H4/00GK102986534SQ201210540779
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者毕德 申请人:苏州和美生物科技有限公司