专利名称：一种植物内生菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于水稻微量元素生物强化技术领域，尤其涉及一种植物内生菌及其应用。
背景技术：
锌与人类生产及生命活动密切相关，锌是植物生长必不可少的微量营养元素，也是人体必需的重要营养元素。锌对人体来说有重要的生理功能和营养价值。正常人一般情况下体内有近200种酶的活性与锌有关，故人体内缺锌时很多酶活性受到影响，导致多种代谢紊乱，进而影响人体健康。研究表明，缺锌会引起身材矮小、皮肤紊乱等，尤其对孕妇和儿童的影响最为明显。粮食作物可食部的锌是人体获取锌的主要途径，由于摄入量不足，数十亿的人口遭遇锌缺乏现象。水稻是我国主要的粮食作物，我国居民70%的热量、65%的蛋白质和大部分微量元素均来自水稻等谷物。水稻锌缺乏不仅是其产量下降的重要影响因子之一，更是导致我国居民微量元素缺乏的重要原因。目前，生物强化是帮助发展中国家摆脱锌营养危机困境的唯一方法，即通过育种和栽培途径提高作物可食用部分微量养分含量。植物育种和施肥是锌生物强化的最主要的方法，但植物育种周期长、费时费力；锌肥价格高且在土壤中利用率低。植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌。内生菌可通过固氮作用、产生植物生长激素、防治病害等增加作物产量，在农业生产和环境科学上的应用潜力已经引起了国内外研究者的广泛关注。有些内生菌可产生铁载体、小分子有机酸等，与重金属螯合等，进而促进根系对土壤中锌、铁等微量元素的吸收。因此，植物内生菌不仅能够促进植物生长、增加产量、提高作物品质，而且还可增加可食部 微量元素含量。综上所述，分离、纯化和筛选有利于微量元素锌吸收的有益内生菌，并将内生菌接种到农业作物上，可利用内生菌提高作物产量，并提高作物对土壤中微量元素锌的吸收及籽粒对锌的积累。然而目前这方面的研究还很少，在农业生产实际中，可考虑将植物内生细菌制成菌剂或无土混合菌剂进行拌种而加以应用，提高农作物的产量和品质。
发明内容
本发明提供了一种植物内生菌及其应用，可促进水稻生长、增加水稻根际土有效锌含量以及籽粒锌富集。—种植物内生菌,分类命名为肠杆菌(Enterobacter sp.),完整命名为肠杆菌(Enterobacter sp.) SaCS20,该菌株已于2013年3月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO:7381。本发明菌株在培养基上的菌落特征为:大小2_5mm ;圆形、边缘整齐；表面光滑、隆起、不透明。
所述培养基的成分为:胰蛋白胨IOg L'酵母提取物5g L'氯化钠IOg L'琼脂15g ΛρΗ 值 7.2。本发明的菌株为革兰氏阴性菌；能产生铁载体、ΙΑΑ，具有溶磷的能力。该菌株从锌超积累植物东南景天中分离得到，并能成功定殖于水稻根系体内，对微量元素锌具有吸收作用，可促进水稻生长、增加根际土有效锌含量以及籽粒锌富集。本发明还提供了所述的植物内生菌在促进水稻生长、提高水稻产量或促进微量元素锌在水稻体内积累中的应用。利用肠杆菌CGMCC7381对水稻的培养可在营养液或土壤中进行。当采用营养液培养水稻时，具体过程为:将灭菌后的水稻幼苗根系放入肠杆菌CGMCC7381的菌液中浸泡I 4h，再将所述水稻幼苗根系放入营养液中培养，每2 5d更
换一次培养液。通过对水稻幼苗根系进行肠杆菌CGMCC7381的菌液浸染，可促进水稻的生长和对营养液中锌的吸收。为了保证营养液中肠杆菌CGMCC7381的定殖量，可在培养过程中往所述营养液中补充肠杆菌CGMCC7381的菌液2 5次。当采用土壤培养水稻时，具体过程为:将灭菌后的水稻幼苗根系放入肠杆菌CGMCC7381的菌液中浸泡I 4h，再将所述水稻幼苗根系种植于土壤中。通过对水稻幼苗根系进行肠杆菌CGMCC7381的菌液浸染，可促进水稻的生长和对土壤中锌的吸收。
为了确保肠杆菌CGMCC7381定殖于水稻的整个生长期，分别于水稻生长的分蘖期、拔节期、开花期往水稻根际土壤中补充肠杆菌CGMCC7381的菌液。水稻幼苗根系的灭菌方法为:将水稻幼苗根系浸泡于I 5%次氯酸钠溶液I IOmin,用无菌水冲洗3 10次。所述肠杆菌CGMCC7381的菌液OD6tltl为0.8 1.0，该OD6tltl范围内的菌液具有良好的生物活性，有利于促进水稻生长及对锌的积累。所述肠杆菌CGMCC7381的菌液的制备方法为:将肠杆菌CGMCC7381活化后接入LB液体培养基，扩繁后离心去上清液，再加入磷酸缓冲液制得菌悬液。与现有技术相比，本发明的有益效果为:本发明提供的肠杆菌CGMCC7381从锌超积累植物东南景天根系内分离得到，不仅对水稻无致病性，还能成功定殖到水稻根系体内，促进水稻生长、增加根际土有效锌含量以及籽粒锌富集。本发明操作简单、安全、经济，即能减少土壤微肥的投入，又能增加作物产量。
图1为实施例4中接种肠杆菌CGMCC7381对水稻生长的影响；图2为实施例4中接种肠杆菌CGMCC7381对水稻地上部生物量(干重)的影响；图3为实施例4中接种肠杆菌CGMCC7381对水稻根系生物量(干重)的影响；图4为实施例5中接种肠杆菌CGMCC7381对水稻根际土壤有效锌含量的影响。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。试验中的检测方法如下:OD600的检测方法:紫外分光光度法；植株锌含量的检测方法:ICP-MS ;土壤锌含量的检测方法:OES-MS。实施例1肠杆菌CGMCC7381的分离(I)培养基DF 培养基:每升培养液中含有 KH2P044g，Na2HP046g, MgSO4.7H200.2g，葡萄糖 2g，葡萄糖酸钠2g，柠檬酸2g，(NH4)2S042g，组分1、组分2溶液各0.lmL，琼脂15g，溶剂为水，pH值7.2,高压蒸汽灭菌(121°C,20min)。其中，组分1:H3B0310mg，MnSO4.H2Oll.19mg, ZnSO4.7Η20124.6mg,CuSO4.5H2078.22mg, MoO3IOmg 溶于 IOOmL 灭菌蒸馏水中，_4°C保存；组分2:FeS04.7H20100mg溶于IOmL灭菌蒸懼水中，_4°C保存。DF+ACC培养基:每升DF培养基中加入3mM的ACC。
LB液体培养基:每升培养液中含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC110g，溶剂为水，pH7.0,高压蒸汽灭菌(121°C,20min)。(2)菌株的分离纯化用无菌剪刀在东南景天根基部将根系剪下，与植物地上部分开。地上部用自来水冲洗30min，用蒸馏水洗3次，每次3min。用吸水纸吸去植物表面水分，将地上部用70%酒精浸2min，无菌水洗3次，3 % NaClO浸泡2次，每次lmin，然后用无菌水冲洗3次，每次2min。植株地上部表面灭菌后称重，加入10倍体积的磷酸盐缓冲液在无菌研钵中研磨，匀浆后静置5min，取悬液进行10倍系列稀释，分别取不同稀释度的悬液100 μ I涂布于DF平板上，在30°C暗培养。从不同稀释倍数的DF平板上选择在形态、色泽和生长速率上不同的菌落在DF-ACC培养基上划线，置于37°C恒温培养箱中培养。多次划线，直至菌株纯化，将该菌株命名为SaCS20，将纯化后的单菌落接种于5mlLB液体培养基，在30°C，180rpm培养。将长好的菌液0.7mL与50%灭菌甘油0.3ml混合分装于冻存管在-80°C保存。实施例2SaCS20菌株的鉴定(I) SaCS20菌株的菌落、菌体形态观察菌体形态学研究:对菌体进行革兰氏染色，在光学显微镜16X100油镜下进行观察。菌体内部结构研究:对菌体进行超薄切片，用透射电子显微镜观察菌体内部结构。在固体LB培养基上，SaCS20菌株的大小为2_5mm ;圆形、边缘整齐；表面光滑、隆起、不透明。(2) SaCS20菌株的分子生物学鉴定 将保存的SaCS20菌株接种到LB液体培养基中，30 °C，180r/min恒温摇床上培养过夜培养，所得菌液用上海生工生物细菌DNA提取试剂盒进行提取，扩增该菌株的16S rDNA,将获得的PCR产物纯化后委托华大基因进行测序。PCR扩增引物为通用引物:27F:5/ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1492R:5/ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR扩增体系采用25 μ I反应体系，如表I所示。表IPCR扩增体系
权利要求
1.一种植物内生菌，其特征在于，命名为肠杆菌(Enterobacter sp.) SaCS20,保藏编号为 CGMCC NO:7381o
2.如权利要求1所述的植物内生菌在促进水稻生长、提高水稻产量或促进微量元素锌在水稻体内积累中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括:将灭菌后的水稻幼苗根系放入肠杆菌CGMCC7381的菌液中浸泡I 4h，再将所述水稻幼苗根系放入营养液中培养，每2 5d更换一次培养液。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，还包括:在培养过程中往所述营养液中补充肠杆菌CGMCC7381的菌液2 5次。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括:将灭菌后的水稻幼苗根系放入肠杆菌CGMCC7381的菌液中浸泡I 4h，再将所述水稻幼苗根系种植于土壤中。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，还包括:分别于水稻生长的分蘖期、拔节期、开花期往水稻根际土壤中补充肠杆菌CGMCC7381的菌液。
7.如权利要求3 6任一所述的应用，其特征在于，水稻幼苗根系的灭菌方法为:将水稻幼苗根系浸泡于I 5%次氯酸钠溶液I IOmin,用无菌水冲洗3 10次。
8.如权利要求3 6任一所述的应用，其特征在于，所述肠杆菌CGMCC7381的菌液0D_为 0.8 1.0。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肠杆菌CGMCC7381的菌液的制备方法为:将肠杆菌CGMCC7381活化后接入LB液体培养基，扩繁后离心去上清液，再加入磷酸缓冲液制得菌悬液。
全文摘要
本发明公开了一种植物内生菌，分类命名为肠杆菌(Enterobacter sp.)，完整命名为肠杆菌(Enterobacter sp.)SaCS20，该菌株已于2013年3月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO7381。本发明还公开了所述的植物内生菌在促进水稻生长、提高水稻产量或促进微量元素锌在水稻体内积累中的应用。本发明提供的肠杆菌CGMCC7381从锌超积累植物东南景天根系内分离得到，不仅对水稻无致病性，还能成功定殖到水稻根系体内，促进水稻生长、增加根际土有效锌含量以及籽粒锌富集。本发明操作简单、安全、经济，即能减少土壤微肥的投入，又能增加作物产量。
文档编号A01P21/00GK103224900SQ20131015172
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年4月26日
发明者杨肖娥, 王玉艳, 张新成, 董兰学, 冯英, 韦燕燕, 高俊 申请人:浙江大学