专利名称：一种防病促生长植物内生多粘类芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防病促生长植物内生多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)及其在生物防治领域的应用，属于农作物防病控病技术领域。
背景技术：
植物内生菌是指能够生活在植物体内，但不造成明显症状的正常微生物。这类微生物能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合的关系。自上个世纪初，人们就开始了对内生细菌的研究，近年来的研究结果表明植物内生细菌不仅将寄主植物作为其栖息的场所，而且对寄主植物具有促生、防病、固氮等生物学作用，同时内生细菌还是将外源基因导入植物体内的良好载体。因此，植物内生细菌是植物病虫害生物防治的天然资源菌，具有十分广泛的理论研究和开发应用价值。植物内生细菌与从土壤中分离到的拮抗细菌相比，具有不易受环境条件的影响，在植物体内具有稳定的生存空间，可以在植物体内独立的分裂繁殖和传递等优势，筛选有益的内生细菌有可能成为生物防治中最具潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用。利用内生细菌对土传维管束病害进行生物防治的优势更为突出，由于土传维管束病害的病原菌侵染后，就在寄主植物维管束中生长、繁殖、为害，造成化学药剂防治困难，效果不理想又污染环境，而内生细菌可以通过在植物体内定殖，与病原菌争夺生存空间，产生拮抗物质直接对病原菌作用等达到防病控病的目的。
随着现代科技的发展，农业机械化程度提高，导致农田耕作方式单一化，化肥、农药的大量使用，造成环境污染致使农业生态系统中生物多样性下降，甚至生态平衡的破坏。而植物内生细菌在与宿主植物长期协同进化过程中形成密切的相互关系，且生存微环境稳定，是化肥、农药和其他微生物制剂的最佳竞争者，它的合理使用将减少化学农药造成的环境污染，提高农业生态系统中的生物多样性，有利于保护生态平衡实现可持续性发展。生活水平的提高和科技的发展使人们对限制使用化学农药和环境保护的要求越来越高，利用内生细菌进行生物防治适合我国无公害农产品生产的要求。具有抗病促生长作用的植物内生细菌的报道虽已经有一些，但多为枯草芽孢杆菌，如何红等从辣椒体内分离到2株枯草芽孢杆菌BS-1和BS-2。目前，国内对于多粘类芽孢杆菌的研究多集中在联合固氮作用方面，还没有具有防病促生长作用的内生多粘类芽孢杆菌的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够在植物体内定殖、对多种病原菌具有拮抗作用，并能促进植物生长的植物内生多粘类芽孢杆菌，从而能开发出新型的生防菌剂，满足无公害农产品生产的要求。
本发明所提供的植物内生细菌是1995年从中国江苏省南京市的棉花组织中分离获得的，在2003-2005年期间，对该菌株进行了菌种鉴定，结果为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。2004年将该菌株命名为Jaas cd，并于2005年3月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1325。该菌株具有下述性质1.菌落形态特征该菌株在NA培养基上生长良好，单个菌落呈半玻璃珠状，边缘整齐，表面湿润光滑，菌落淡乳黄色，无光泽，隆起，不透明。
2.菌体形态特征菌体细胞杆状，形成荚膜，产生芽孢，中生，孢囊膨大。
3.主要生理生化特征革兰氏反应阳性；过氧化氢酶反应阳性；利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇产酸，葡萄糖产气；V.P反应阳性，水解明胶、酪素、淀粉。
4.遗传学特征用968 f-gc和1401r为引物进行PCR扩增出的该菌株的16S rRNA基因的部分序列423bp，并向GenBank提交，登录号为AY942618。该菌株的16S rRNA基因的部分序列为1 AGAACCTTAC CAGGTCTTGA CATCCCTCTG ATCGGTCTAG AGATAGATCT TTCCTTCGGG61 ACAGAGGAGA CAGGTGGTGC ATGGTTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG121 TCCCGCAACG AGCGCAACCC TTATGCTTAG TTGCCAGCAG GTCAAGCTGG GCACTCTAAG181 CAGACTGCCG GTGACAAACC GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAATCATC ATGCCCCTTA241 TGACCTGGGC TACACACGTA CTACAATGGC CGGTACAACG GGAAGCGAAA TCGCGAGGTG301 GAGCCAATCC TAGAAAAGCC GGTCTCAGTT CGGATTGTAG GCTGCAACTC GCCTACATGA361 AGTCGGAATT GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC CCGGGTCTTG421 TAC将该序列在www.ncbi.nlm.nih.gov网站上用BLAST工具与GenBank中已登录的部分菌株的16S rRNA基因序列进行相似性比较，结果表明与多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的相似性达99％。另外，根据中国农业微生物菌种保藏管理中心对该菌株进行的形态特征、生理生化以及Biolog自动细菌鉴定仪的鉴定结果，本发明所述的植物内生细菌属于(Paenibacillus polymyxa)。
通过常规的微生物发酵方法可以培养本发明所述的植物内生细菌，并制得以本发明所述的植物内生细菌为有效成分的生防菌剂。该菌的最适pH为6.0-8.0，最适培养温度为25-30℃，可用一般发酵工业中的通用发酵罐进行培养。在制造以本发明所述的植物内生细菌为生防菌剂时，可同样使用该技术领域中已知生防菌剂通用的培养基，配制成水剂、粉剂等任意的剂型。
本发明的所述的植物内生多粘类芽孢杆菌及制得的以其为有效成分的生防菌剂与现有技术相比具有如下优点。
1、可以在植株体内定殖传导。
将本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌用抗利福平与拮抗病原真菌双标记进行内生测定，几天后从植株体内回收分离。结果表明该菌株可以在多种作物体内定殖，并且可以在植株体内向上和向下传导。
2、可以促进植株生长、提高产量。
用本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌菌液泼浇催芽后的棉种以及茄子苗，可显著提高植株的苗高和鲜重。用本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌菌液对棉花进行灌根，可以显著提高棉花的产量。
3、对土传维管束病害具有突出的防治效果。
用本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌菌液对植株进行灌根对棉花黄萎病、茄子黄萎病等土传维管束病害具有突出的防治效果。
4、具有诱导植物抗病的作用。
将本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌接种植株，几天后测定植株体内的过氧化物酶、超氧化物歧化酶、酯酶的同工酶酶谱，结果表明这些酶谱都不同程度的出现酶带增多、加宽和加深的现象；对过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性的测定也表明这两种酶的活性明显增强。说明该菌株可以通过诱导植物体内这些与抗病性相关酶的活性来诱导植株抗病。
5、对多种作物病原真菌具有拮抗活性。
室内拮抗活性测定结果表明本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌具有较广的抑菌谱，对棉花黄萎病菌、茄子黄萎病菌、棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌等多种病原真菌都具有明显的拮抗活性。
6、可以与肥料一起使用。
本发明所述的内生细菌在黄腐酸绿源宝等多种肥料中可以存活。
具体实施例方式下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1 液体制剂将植物内生多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)Jaas cd菌株接种到试管斜面上，培养基为NA，25℃恒温培养2-4天，获得试管种。
将试管种接种到NB培养基中，28℃恒温振荡培养过夜后，按0.1％的接种量转接于NB培养基中，28℃恒温振荡培养14小时后的培养液即可为制剂。也可转接至发酵培养基为豆饼粉培养基的发酵罐中进行发酵生产。
配方一、普通细菌NA培养基(重量％)牛肉浸膏0.3％，酵母膏0.1％，蛋白胨0.5％， 葡萄糖1.0％，琼脂1.5-2.0％，pH 6.8-7.0。
配方二、普通细菌NB培养基(重量％)牛肉浸膏0.3％，酵母膏0.1％，蛋白胨0.5％， 葡萄糖1.0％，pH 6.8-7.0。
配方三、豆饼粉培养基(重量％)豆饼粉2.5％，淀粉1.0％实施例2 对棉花的增产试验在棉花品种、密度、肥料用量、栽培管理措施相同的前提下，设用稀释后的Jaas cd菌液灌根和用水灌根2个处理，随机区组设计，每个处理重复4次，小区面积不小于20m2。灌根用药时间分别为7月13日和7月22日。9月10日调查大铃数、小铃数和吐絮数。结果表明用本发明采用的植物内生多粘类芽孢杆菌菌液灌根比用水灌根的对照组增产8.22％。
实施例3 对棉苗的促生长作用将催芽的棉花种子播种于温室盆钵中，同时将稀释后的Jaas cd菌液泼浇于棉种及盆钵土壤中，60天后测量苗高并称鲜重，试验结果表明该菌株对棉苗具有明显的促生长作用，株高比对照增长29.9％，鲜重比对照增长45.2％。
实施例4 对棉花黄萎病的防治作用温室盆钵中的棉苗长至2片真叶期，在棉花主茎距土层2cm处接种经NB液体培养的本发明所述的内生细菌，5天后在距细菌接种点下约1cm处同样用针刺接种棉花黄萎病菌，以不接种本发明所述的内生细菌为对照，连续调查黄萎病的病情。本发明所述的内生细菌对棉花黄萎病的生防效果为67.21％。
在棉花品种、密度、肥料用量、栽培管理措施相同的前提下，设用稀释后的Jaas cd菌液灌根和用水灌根2个处理，随机区组设计，每个处理重复4次，小区面积不小于20m2。在7月13日棉花黄萎病发病初期第一次用药，7月22日第二次用药。第1次用药前调查病情基数，7月31日、9月10日调查病情指数。结果表明用本发明采用的植物内生多粘类芽孢杆菌菌液灌根后，7月31日的防治效果为51.2％，9月10日的防治效果为49.9％，具有较长的持效期。
实施例5 对茄子防病促生长作用温室盆钵中的茄子苗长至4-5片真叶期时，用稀释后的Jaas cd菌液灌根，3天后接种茄子黄萎病菌，7天后再用稀释后的Jaas cd菌液灌根。以不接种本发明所述的内生细菌为对照，连续调查黄萎病的病情，40天后调查茄苗的株高和鲜重。结果表明本发明所述的内生细菌对茄子具有明显的促生长作用，对茄子黄萎病具有良好的防治效果。
实施例6 对多种病原真菌的拮抗作用在PDA平板中心处接直径为5mm病原真菌菌饼，25℃，培养1-3天后，在菌落边缘1.5cm处接活化好的Jaas cd，6-7d后测量抑菌圈。结果表明本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌具有较广的抑菌谱，对棉花黄萎病菌、茄子黄萎病菌、棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌等多种病原真菌都具有明显的拮抗活性。
权利要求
1.一种具有防病促生长作用的植物内生细菌，其特征在于该菌是一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，已于2005年3月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1325。
2.根据权利要求1所述的一种植物内生细菌，其特征在于，该菌株细胞杆状，形成荚膜，产生芽孢，中生，孢囊膨大；菌落无光泽。革兰氏反应阳性；过氧化氢酶反应阳性；利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇产酸，葡萄糖产气；V.P反应阳性，水解明胶、酪素、淀粉。用抗利福平与拮抗病原真菌双标记进行内生测定，从植株体内回收分离的菌株，在含利福平培养基上出现相同的菌落。
3.以权利要求1或2所述植物内生多粘类芽孢杆菌为生产菌株生产制剂。
4.以权利要求1或2所述植物内生多粘类芽孢杆菌为有效成分的制剂在农业上应用。
全文摘要
本发明涉及一种防病促生长植物内生多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)及其应用，属于农作物防病控病技术领域。本发明采用的菌株Jaas cd已于2005年3月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1325。该菌株可在较低的菌液浓度下进入植物体内，并能在植物体内定殖、繁殖和传导；对植物同时具有促进生长、提高产量和防病的作用，特别是对于土传维管束病害具有良好的防治效果。该菌株抑菌谱广，用于制剂生产成本低廉，操作简单，有利于保护农田生态环境，减少农药残留，适合于我国无公害农产品生产的要求。
文档编号C12N1/20GK1687399SQ20051003875
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月8日 优先权日2005年4月8日
发明者林玲, 顾本康, 夏正俊 申请人:江苏省农业科学院