专利名称：：一株植物根际促生细菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一株植物根际促生细菌，可广谱防治多种植物土传真菌病害，在植物根际可大量定殖，对植物的生长发育有明显的促进作用，属于农用微生物
技术领域：
，也属于植物生物防治
技术领域：
。技术背景从20世纪60年代末期以来，随着大量化学农药长期的不合理使用，植物病虫害的化学防治严重威胁着农业经济的发展和人类的健康，已成为人类社会进入21世纪的严重挑战。随着科学技术的发展，面对环境的日趋恶化，人们对有害生物的认识和农作物保护策略发生了转变，从对有害生物的"斩尽杀绝"转变为"适度容忍"。农业部于2002年启动实施了"无公害食品行动计划"，这标志着我国农业结构调整已进入新的发展阶段。展望今后食品安全的发展需要，生物防治将成为病虫害防治的重要措施，有着广阔的发展前景。但生物防治从整体上看仍存在一些不足一是被用来筛选的样品材料主要集中在根际土壤、被感染的病体组织、易感植株的内生菌等处，限制了微生物资源的多样性；二是筛选的生防菌常常是针对某一种或某一类病原菌有较好的抑菌效果，缺乏抑菌的广谱性；三是外界条件的变化会直接影响生防菌剂的生防机制和生防效果，即防效不稳定；四是生防菌的生产和使用技术不够完善等等。为全面贯彻落实"预防为主，科学防控，依法治理，促进健康"的生物防治方针，指导各地安全、科学、合理的使用农药和综合防治，进一步促进农林业有害生物的无公害防治，保护生态环境和生物多样性，结合目前我国农作物的防治结构，提出了一系列新的防治技术。生物防治的新技术之一就是分离和筛选植物根际促生菌(plantgrowth—promotingrhizobacteria,PGPR)，其能够高密度地在植物根际定殖，兼有抑制植物病原菌、根际有害微生物，以及促进植物生长并增加作物产量的作用，更重要的是有些PGPR还能诱导植物产生系统抗性(Inducedsystemicresistance,ISR)，从而提高植物整体的抗病能力。故PGPR的深入研究和发展，将为解决植物土传病害防治这一难题展现诱人的前景。番茄早疫病(TomatoEarlyBlight)又称为"轮纹病"或"夏疫病"，在番茄的整个生长期间可随时随地普遍发生，是危害较严重的真菌病害之一。此病原的寄主范围广泛，除危害番茄外，还可危害茄子、辣椒和马铃薯等茄科蔬菜作物。目前番茄早疫病害的防治主要依赖于化学药剂。国外虽然获得了一些有较好防治效果的拮抗菌，但没有专门进行以番茄早疫病菌为防治对象的拮抗微生物的筛选工作，国内目前也仅仅局限于简单的实验室筛选工作，拮抗微生物以酵母为主。
发明内容技术问题本发明的目的正是为了克服上述现有技术的不足，提供一株能有效防治番茄早疫病害、能有效促进植物生长、能有效定殖于植物根际、具有拮抗广谱性的、有益的植物根际促生细菌菌株。技术方案本发明的目的是通过如下技术方案实现的。本发明新型植物根际促生细菌菌株为枯草芽孢杆菌(5ac///^^"fc)QM34，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其单位简称为CGMCC，保藏日2008年09月22日，保藏编号CGMCCNo.2669。(下面简称及>s"^7&QM34)。本发明的及wZ^'foQM34菌株是首次从青海牦牛粪中分离得到了广谱拮抗微生物。寻找不同地理环境的微生物群落，从青海牦牛粪中开发和利用有益微生物资源，在生防领域将是一个重大的突破。本发明及ra6"fcQM34菌株的形态特征为QM34菌落不透明，表面有皱褶，边缘缺刻状；菌体形态杆状、革兰氏阳性，产生中生芽孢，芽孢椭圆。与已有的枯草芽孢生防菌株相比，孢囊稍有膨大。本发明及w^/fcQM34菌株，对12种土传性植物真菌病原菌均有拮抗作用，特别是对番茄早疫病菌有明显的抑制效果。因此，是一株具有广谱拮抗性的生防菌株。本发明5.犯6"&QM34菌株，对番茄早疫病害有明显的防治效果；对番茄植株的生长有明显的促进作用；可在番茄植株根际大量定殖。因此是一株有潜在应用价值的植物根际促生细菌。本发明5.w^/foQM34菌株，是首次选育的番茄早疫病害的广谱拮抗性生防菌株，是首次选育的以番茄早疫病害为主要防治对象，且兼有促生、防病等多功能的一株植物根际促生细菌菌株。图1为经不同稀释度的QM34菌株发酵液处理后，3个品种的番茄植株根际土壤总芽孢杆菌数量的变化趋势。具体实施方式实施例lQM34菌株的分离筛选试验经梯度稀释法从青海牦牛粪中分离，经平板对峙生长法筛选得到一株植物根际促生细菌，5.w&船QM34菌株。具体实施过程包括称青海牦牛粪样品10.0g，研碎，于无菌条件下加入到90ml无菌水中摇动均匀，取其上清液稀释成合适(l(T5、l(T6、10'7)的浓度梯度，将梯度液在IO(TC水浴加热IO分钟，用常规稀释法涂布接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37'C培养1天,挑选细菌菌落形态差异比较明显的菌落，重复划线接种于相应的琼脂平板上，纯化得到单菌落；采用PDA平板对峙生长法初筛以12种病原真菌为指示菌，在平板中央点接病原菌，待病原菌生长到菌落直径约l-1.5cm时，将接入初筛的菌株，接种点距平板中央2.5ctn处，点接6角点上，以不点接初筛菌株为对照，置于28'C培养箱培养3-5天，观察记录病原真菌的生长情况。选出对病原菌生长有相对较强抑制作用的菌株进入复筛。复筛的具体操作同初筛，以12种病原菌分别为指示菌，拮抗平板培养5天或10天后，分别测量相关数据，并记录R值(R^病原菌与拮抗菌的菌丝边缘距/拮抗菌中心到病原菌菌丝边缘的距离)，根据R值的大小，筛选得到具有广谱拮抗作用的、抑菌效果好的、拮抗作用持久的丑w^/toQM34菌株(见表l)，每处理3个观察值，试验重复2次。QM34菌落不透明，表面有皱褶，边缘缺刻状；菌体形态杆状、革兰氏阳性，产生中生芽孢，孢囊有膨大，芽孢椭圆。表15.w6"'fcQM34菌株对12种土传植物真菌病菌的拮抗作用病原菌名学名抑菌效果R'番茄早疫病菌so/an/0.921灰霉病菌0週番茄叶霉病菌0.446赤霉病菌0.891刺盘孢菌0.596黄瓜枯萎病菌i^"r/zwo平;or/w附f邻，w've,0.778未鉴定病原真菌Unidentification0扁棉枯萎病菌0.890小麦白粉病菌grflw/w/sDC.f.sp.7>zY/c/0.672苹果白粉病菌/Was//zaera/ewc^Wcte(Ell.etEv.)Salm.0.459苹果干腐菌0.721烟草赤星菌0.5卯R':病原菌与拮抗菌的菌丝边缘距/拮抗菌中心到病原菌菌丝边缘的距离实施例2QM34菌株对番茄早疫病的盆栽防效试验试验分别用QM34菌株的发酵液和无菌液防治番茄早疫病，每一种防治液各设2个处理，即在接种番茄早疫病病原菌的前一天和后一天分别进行防治液的接种(分别记为前、后)。以接种无菌水为对照。所有处理同时在三个番茄品种中实施。整个试验设2次重复，随机排列。5.犯6"fcQM34菌株，接种于YPF-Ca液体培养基，35°C，摇瓶培养4d，浓度约为109cfWml，稀释10倍即为QM34菌株的发酵液；将QM34菌株的发酵液10000rpm离心20分钟，去除沉淀，将上清液用微孔滤膜(0.22um)过滤除菌，稀释3倍后即为QM34菌株无菌液。番茄品种分别为l号，大红合作903，上海番茄研究所；2号，红果王大民601，大民农业科学研究院；3号，秦丰大红保冠(抗病)，西安临潼区秦丰蔬菜研究所。三种番茄种子发芽率均大于85%。番茄早疫病菌C4//emaA7'fl在PDA培养基上培养一周后，皿内注入4。C冷水，刮除气生菌丝，紫外线照射2min，25。C下恒温培养2d，然后与早疫病菌的查氏液体培养液混合，即为病原菌液，病原菌液孢子数为106cfii/ml。供试番茄苗长至5-6片叶时，开始接种试验。同时用针剌涂抹和灌根法接种番茄早疫病菌，接种2次；用涂抹接种QM34菌株发酵液和QM34菌株无菌液后，再灌根接种10ml/每株。盆栽防治试验得出(见表2)，各处理均有一定的防治效果，且存在着显著差异。三个品种都是先于病原菌之前接种QM34菌株发酵液的防治效果明显强于之后接种的；对3号品种的试验结果显示，用QM34菌株无菌液的防治效果也是先于接种病原菌之前较好；对于3号番茄，直接接种QM34发酵液的防治效果强于接种无菌液的防治效果。实施例3菌株QM34对番茄植株生长的促进试验用稀释倍数为l、10、20倍的QM34发酵液分别接种三种番茄植株，以接无菌水为对照，从接种当天开始测定叶片数和株高，每隔7天记录一次数据。28天后随机选取每处理组平均株高的植株各2株，调査其叶片大小、根部发育、叶片间距离、地茎直径等生理指标指标(见表3)。取根的方法将植株和苗钵体一起浸泡水中，然后换水冲洗干净，得到根的样品并照相；将根放入一个透明的托盘内，并注入35mm深的tK，直接测定并记录总根长;将根放在105'C的烘箱中杀青1h后置于55'C恒温下烘48h，冷却后取出计算根系干重。经不同稀释倍数的QM34发酵液处理后，发现三种番茄品种的平均叶片数和平均株高的变化情况不同，平均叶片数和株高都在随时间的延长而增加，平均叶片数和平均株高均增加(除2号番茄)，并没有对植株产生抑制作用(见表3)。对1号、2号和3号番茄品种最适宜的QM34发酵液稀释倍数分别是20、10和1倍。在整个试验过程中，2号番茄品种从发芽率的大小、发芽的快慢和长势上均优于1号和3号品种，所以在加入QM34发酵液后叶片数仍在增加，而株高相对于对照增加较慢，这正说明QM34发酵液可以促进植株有效的生长，而避免植株出现徒长现象。另外发现三种QM34发酵液的浓度倍数处理植株后，叶片大小、叶间距、地茎直径等特征指标与对照间均有不同程度的增加(见表3)。1号番茄品种中的10倍稀释液和2号番茄对照组的叶片间距离明显大于其他处理组，且茎直径也较其他处理组细，其他处理组的基茎都已经木质化，茎颜色也已经变成红褐色；l号番茄品种中的20倍稀释液处理组的叶片面积和根总长明显大于其他处理组，可见虽然平均株高的变化小，但其叶片数目等其他特征指标增加，在育苗管理上这种状态是非常理想的，是真正的壮苗。这说明QM34菌株发酵液对三种番茄品种的生长均有一定的促进作用。表2QM34菌株对番茄早疫病的防病效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3经QM34菌株发酵液处理后各番茄植株的生理指标<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例4菌株QM34在番茄植株根际的定殖试验以接种无菌水为对照，对3个番茄品种经接种不同浓度的QM34发酵液的根际土壤，用平板稀释法进行了总芽孢杆菌数量的动态检测(见图l)。每7天取样一次，试验重复3次。试验发现各处理番茄植株根际土壤总芽孢杆菌的数量变化随着时间的延长都在增加，比没有灌根接种的数量明显增加(2.8X106cfu/g)(p<0.01)，说明QM34菌株具有很强的竞争力，能够在植物的根际土壤中定殖并大量繁殖。权利要求1、一株植物根际促生细菌，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其单位简称为CGMCC，保藏名枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)QM34，保藏日2008年09月22日，保藏编号CGMCCNo.2669。2、根据权利要求1所述的一株植物根际促生细菌菌株，其特征在于，从青海牦牛粪中分离得到。QM34菌落不透明，表面有皱褶，边缘缺刻状；菌体形态杆状、革兰氏阳性，产生中生芽孢，孢囊稍有膨大，芽孢椭圆。3、根据权利要求1和2所述的一株植物根际促生细菌菌株，其特征在于，对12种土传性植物真菌病原菌均有拮抗作用，特别是对番茄早疫病菌有明显的抑制效果。4、根据权利要求3所述的一株植物根际促生细菌菌株，其特征在于，对番茄早疫病害有明显的防治效果。5、根据权利要求3所述的一株植物根际促生细菌菌株，其特征在于，对番茄植株的生长有明显的促进作用。6、根据权利要求3所述的一株植物根际促生细菌菌株，其特征在于，可在番茄植株根际大量定殖。全文摘要本发明公开了一株植物根际促生细菌。菌株从青海牦牛粪中分离，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名为BacillussubtilisQM34，保藏日2008年09月22日，保藏号CGMCCNo.2669；本发明QM34菌株对12种土传性植物真菌病原菌均有拮抗作用；菌株QM34发酵液和QM34发酵液的无细胞培养液对番茄早疫病有明显的防治效果，对番茄植株的生长有明显的促进作用，且能在番茄植株根际大量定殖。故本发明是用于番茄早疫病害生物防治的一株广谱性根际促生细菌，定会倍受人们青睐。文档编号C12R1/125GK101402930SQ20081018129公开日2009年4月8日申请日期2008年11月15日优先权日2008年11月15日发明者徐建国,胡青平申请人:山西师范大学