专利名称：一种钾离子通道蛋白基因、其编码的蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种钾离子通道蛋白基因、其编码的蛋白及该基因在植物钾高效利用和耐盐性方面的应用。
背景技术：
钾是植物生长所必需的大量营养元素之一，广泛分布于植物的各组织和器官，是植物细胞内含量最丰富的一价阳离子。钾在植物众多生理功能中发挥着重要的作用，如维持细胞离子平衡、调节细胞膨压、调节各种酶的活性以及参与蛋白质合成等，维持高并且相对稳定的钾含量对植物生长至关重要。植物缺钾会出现明显的缺钾症状，表现为易倒伏，叶片易失水，耐旱耐盐性降低，叶片发黄和组织坏死等。耕地土壤缺钾会导致农作物产量和品质大幅下降。因此，维持植物生长过程中钾营养供给十分重要。我国的大部分耕地供钾不足，其中严重缺钾土地约2000万公顷，占耕地总面积的20%以上。并且，我国钾矿资源匮乏，钾肥的年产量十分有限，缺钾状况严重影响着我国农业的发展。同时，土壤盐溃化是一个全球性的生态问题。过量的钠离子对植物的成长具有毒害作用，大部分农作物在盐胁迫状态下不能正常生长，表现为发育迟缓，发芽率降低，器官生长和分化受到抑制，新陈代谢减缓等症状。土壤盐溃化不仅会造成粮食减产，也是土地荒漠化和耕地退化的主要原因之一，严重制约着农业生产。研究表明，不同种类的植物或同种植物的不同品种对土壤缺钾和盐胁迫的生理反应及对钾的吸收利用效率存在明显差异，并且这种差异性是可以遗传的，说明植物这种性状是由遗传基因控制的。在高盐环境下仍具有钾吸收能力，进而维持高的K+/Na+比是决定植物的耐盐性的关键因素。因此，植物钾吸收能力与其耐盐性息息相关。自从20世纪90年代以来，许多负责植物钾吸收及转运的钾离子通道基因和钾离子转运蛋白基因被相继克隆和鉴定。其中，钾离子通道在植物钾吸收中起着重要的作用，研究钾离子通道基因，为我们深入认识和理解作物体内钾的吸收及利用机制，进而提高钾的有效利用率具有积极的作用。目前，已有一些植物的钾离子通道被克隆并鉴定出来，如OsAKTl (水稻)，AKTl (拟南芥)，ZMK1 (玉米)，MIRK(甜瓜)和MKTl (冰叶日中花)等。然而这些基因大部分来自甜土植物，并且多数对Na+敏感，其中包括来自盐生植物的MKTl。在土壤既缺钾又有盐溃化的情况下，只有对Na+不敏感的钾转运蛋白才能正常发挥功能，使转基因作物既耐低钾又耐盐，因此考虑从真盐生植物盐角草中分离对Na+不敏感的钾转运蛋白基因。所以，本专利采用双子叶盐生植物盐角草为实验材料。 盐角草(Salicornia europaea): —年生双子叶草本植物,藜科盐角草属，一般生于盐碱地、盐湖旁及海边。盐角草属植物是迄今为止报道过的地球上最耐盐的陆生高等植物类群之一，其在600mM盐浓度条件下也能吸收钾离子，维持植物正常生长。(盐角草种子采于大连市营城子海边的盐碱地，并于实验室中种植，用含300mM NaCl的l/2Hoagland营养液定期灌溉。自然条件下培养)。
发明内容
为了解决上述问题，本发明公开一种钾离子通道蛋白基因、其编码蛋白及该基因在植物钾吸收及耐盐性方面的应用。该基因是从盐角草中分离出来的，具有K+吸收功能，是一种双亲和性钾通道蛋白。这预示着它在农作物钾高效利用方面的应用价值，可减少钾肥的施用，从而降低生产成本。该基因能提高转基因拟南芥在缺钾及盐胁迫条件的K+吸收能力，同时减少对Na的摄入，提闻了 K /Na ,从而提闻了植物的耐盐性。这种提闻转基因植物的耐土壤低钾和耐盐的特性，可通过转基因技术应用于农作物上，从而应对日益严重的土壤缺钾和盐溃化问题。本发明的技术方案如下:本发明的目的之一在于提供具有钾吸收功能的钾离子通道蛋白基因，该基因是从盐角草中分离出来的，具有下列核苷酸序列之一:①该基因具有序列表中SEQ ID N0.17或其自5’端38 2614位所示的碱基序列；②该基因与序列表中SEQ ID N0.17或其自5’端38 2614位所示的碱基序列具有95%以上的同源性，且编码相同蛋白质的碱基序列。本发明的目的之二在于提供了具有上文所述钾离子通道蛋白的编码蛋白，该蛋白由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸残基序列组成；且提供了该钾离子通道蛋白的衍生蛋白质，即由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而产生的具有相同的生物学功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。本发明的目的之三在 于提供一种重组表达载体，该重组表达载体上含有上文所述的钾离子通道蛋白基因；且在优选的技术方案中，是以PBI121作为表达载体，本发明的实施例中，具体公开了重组载体的构建方法和鉴定方法。本发明的目的之四在于提供一种含有上文所述重组表达载体的宿主细胞；且在优选的技术方案中，该宿主细胞为根癌农杆菌GV3101菌株，本发明的实施例中，具体公开了根癌农杆菌GV3101为宿主菌的实验方法。本发明的目的之五在于提供上文所述的钾离子通道蛋白基因在提高转基因植物在不同钾浓度环境下K+的利用率方面的应用；以及该基因在提高转基因植物在低钾和盐胁迫环境下K+的利用率和耐盐性方面的应用；尤其在优选的技术方案中，该基因在改良拟南芥性状中有较好的应用效果。总之，本发明的基因SeAKTl具有钾离子通道蛋白的功能，本发明的实施例证明它能提高转基因拟南芥在3mmol和100 μ mo I浓度K+环境下的K+吸收效率和在缺钾、盐胁迫下的K+吸收能力，提高K+/Na+，进而提高植物钾利用效率及耐盐性，同时也预示着它在农作物钾高效利用和耐盐性方面的应用价值。
图1为SeAKTl基因克隆PCR电泳图。其中，A为保守区部分片段克隆；B为3’端部分片段克隆；C为5’端部分片段克隆；D为ORF全长PCR电泳图。Ml:DL2000marker ；M2:λ -EcoT14marker。图中结果显示:A:克隆所得保守区片段长度约为750bp ；B:克隆所得3’端片段约为2000bp ；C:克隆所得5’端片段长度约为800bp ；D =SeAKTl开放性阅读框长度为2577bp。将上述克隆所得序列测序后进行blast比对，结果表明所得片段均与Shaker家族钾离子通道基因存在较高同源性。图2为本发明的SeAKTl基因编码的蛋白的结构图。图中结果显示该基因具有S1-S6六个跨膜结构域，cNMP结合位点及ANK结构域。从而表明SeAKTl是典型的Shaker家族内向整流型钾离子通道。图3为本发明的钾通道蛋白SeAKTl疏水性分析图。图中结果显示该蛋白具有S1-S6六个跨膜结构域，cNMP结合位点及ANK结构域，从而表明SeAKTl是一个跨膜蛋白，并具有Shaker家族钾离子通道蛋白的一般结构特征。图4为本发明的SeAKTl基因编码的蛋白的进化分析图。图中结果显示该基因与AKTl亚族中的Mktpl和NKTl等亲缘关系较近，表明该编码蛋白属于钾离子通道蛋白家族的AKTl亚族。(钾离子通道SeAKTl的氨基酸序列采用ClustalX程序预测，并采用MEGA5软件构建进化树。AKT1/2/5, KATI/2, AtKCl 和 G0RK/SK0R-拟南芥；SPIK, PeKCl/2-杨树；NKTl-烟草；RCAKTl/2/3/6-蓖麻；Mktpl-冰叶日中花；DKT1-胡萝卜；LKT1-西红柿；TaAKTl-小麦；ΗνΑΚΤ1-大麦；PutAKTl_ 星星草；0sAKTl，0sKT2-水稻。)·
图5为不同处理下，SeAKTl半定量RT-PCR电泳图。其中A为不同处理下幼苗中SeAKTl表达情况；B为不同处理下成苗中SeAKTl表达情况。其中A图中1:未处理；2:缺钾处理；3:100mM NaCl处理；4:缺钾+IOOmM NaCl处理。B图中1:未处理；2:缺钾处理；3:700mM NaCl处理；4:缺钾+700mM NaCl处理。结果表明，在缺钾情况下幼苗和成苗中表达量均有所上调，尤其是幼苗中上调幅度尤为明显；在缺钾+盐胁迫处理的情况下，幼苗(缺钾+IOOmM Na+)和成苗(缺钾+700mM Na+)中表达量都有所增加；在幼苗中IOOmMNa+处理下表达量上升而成苗中700mMNa+处理下表达量略有下调。据报道，AKTl类的钾离子通道(如:MKTl、OsAKTl、AKTl)在外部浓度为400mM，150mM或者50mM的时候表达量剧烈下调，而SeAKTl在IOOmMNa+处理下的盐角草幼苗中表达量上升，在700mMNa+处理下成苗中表达量只略微下降，相比之下具有明显优势。图6为重组植物表达载体pBI121_SeAKTl的结构图谱。表明该基因可在35S启动子的调控下组成型表达，重组载体具有卡那霉素抗性。图7为转SeAKTl基因拟南芥植株的卡那霉素筛选图。a:野生型拟南芥未加卡那霉素筛选；b:转基因拟南芥加卡那霉素筛选；c:野生型拟南芥加卡那霉素筛选；图示的结果证明转SeAKTl基因阳性苗具有卡那霉素抗性，可在卡那霉素下正常生长；而野生型拟南芥则只长出两片子叶，无法继续长出真叶，并逐渐枯萎变黄，直至死亡。图8为本发明SeAKTl基因的转基因拟南芥在不同处理条件下的K+、Na+含量及K+/Na+情况。WT:野生型拟南芥；SeAKTl:转SeAKTl基因拟南芥；Control:正常MS培养基；_K:缺K+MS培养基；+Na:75mM Na+MS培养基；_K/+Na:缺K++75mM Na+MS培养基。结果显示:与对照组相比，处理条件下转基因拟南芥与野生型拟南芥根和冠(地上部分)中钾含量均有所下降，但转SeAKTl基因拟南芥中钾含量下降幅度更小一些；在Na+胁迫下，转基因拟南芥和野生型拟南芥中的Na+含量均有较大幅度的升高，但相对而言，转基因拟南芥根和冠中的Na+含量均低于野生型拟南芥；与对照组相比，在不同胁迫条件下转基因和对照拟南芥根部和冠中的K+/Na+均有明显降低，但转基因拟南芥的K+/Na+要明显高于野生型拟南芥。表明SeAKTl基因可以使胁迫条件下的转基因拟南芥吸收更多的K+，并且减少对Na+的摄入，从而使细胞内维持相对较高的K+/Na+，保证植株正常生长代谢，提高了植物的耐低钾和耐盐性。图9为本发明SeAKTl基因的转基因拟南芥在3mmol浓度K+环境下的K+耗竭实验。图中结果显示在3mmol浓度K+环境下，转SeAKTl基因拟南芥耗竭液中K+浓度下降的更快，并且终浓度更低。表明转基因拟南芥在毫摩尔浓度K+环境下K+吸收效率有所提高。图10为本发明SeAKTl基因的转基因拟南芥在100 μ mol浓度K+环境下的K+耗竭实验。图中结果显示在100 μ mol浓度K+环境下，转SeAKTl基因拟南芥耗竭液中K+浓度下降的更快，并且终 浓度更低。表明转基因拟南芥在微摩尔浓度K+环境下K+吸收效率有所提闻。
具体实施方式
:下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。下面实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规条件或分子克隆中所述条件，或按照产品说明书上所提供的条件。下面是实例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例一 SeAKTl基因cDNA的克隆与分析一盐角草总RNA提取称取50mg新鲜盐角草组织，于液氮中研磨成粉末，将研磨好的材料迅速转移至含有Iml trizol试剂的离心管中，震荡混匀；加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min ；4° C12000r/min, 10_15min，取上清；将上清转移至新的离心管中；加入0.5ml异丙醇，混勻，室温IOmin ；4° C, 12000r/min,离心IOmin ;弃上清,加入Iml冰预冷的70%乙醇(新鲜配制)，洗漆沉淀；4° C, 7500r/min, 5min ;弃上清,室温晾干(勿太干),加入20 μ I RNase-freeddH20,充分溶解RNA，-70 ° C保存备用。1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的质量。结果呈现了 28S、18S、5S三种典型的RNA带型，各条带清晰，无明显的拖尾现象，表明提取的RNA无明显降解，可进一步用于RT-PCR实验。二单链cDNA的获得以提取的盐角草总RNA为模板(500ng),按照宝生物Reverse TranscriptaseM-MLV反转录说明书进行反转录反应,得到的单链cDNA可直接用于2nd_Strand cDNA的合成或者PCR扩增等。三盐角草SeAKTl基因部分编码区的获得①简并引物设计。根据NCBI上提供的冰叶日中花、烟草、拟南芥、水稻和大麦等植物的AKTl家族基因序列进行同源性比对，在其高度保守区设计一对简并引物AKF (SEQ IDN0.1) /AKR (SEQ ID N0.2)。此简并引物中 Y=C/T，D=A/G，W=A/T，R=A/G。②PCR扩增。以反转录获得的单链cDNA为模板，AKF (SEQ ID N0.1)和AKR (SEQID N0.2)为引物，PCR扩增SeAKTl通道基因部分编码区。反应体系如下:
权利要求
1.一种钾离子通道蛋白基因，其特征在于，该基因具有下列核苷酸序列之一: ①该基因具有序列表中SEQID N0.17或其自5’端38 2614位所示的碱基序列； ②该基因与序列表中SEQID N0.17或其自5’端38 2614位所示的碱基序列具有95%以上的同源性，且编码相同蛋白质的碱基序列。
2.—种钾离子通道蛋白，其特征在于，该蛋白由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸残基序列组成。
3.—种钟尚子通道蛋白衍生蛋白质，其特征在于，该蛋白由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而产生的具有相同的生物学功能的衍生蛋白质的氨 基酸序列。
4.一种含有权利要求1所述的钾离子通道蛋白基因的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，其表达载体为PBI121。
6.一种含有权利要求4或5所述重组表达载体的宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞为根癌农杆菌GV3101菌株。
8.如权利要求1所述的基因在提高转基因植物在不同钾浓度环境下K+的利用率方面的应用。
9.如权利要求1所述的基因在提高转基因植物在低钾和盐胁迫环境下K+的利用率和耐盐性方面的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体公开一种钾离子通道蛋白基因、其编码蛋白及该基因在植物钾吸收及耐盐性方面的应用。本发明的基因来源于盐角草，命名为SeAKT1，该基因具有K+吸收功能，能提高转基因拟南芥在3mM和100μM K+环境中K+利用率，是一种双亲和性钾通道蛋白。这预示着它在农作物钾高效利用方面的应用价值，可减少钾肥的施用，从而降低生产成本。该基因也能提高转基因拟南芥在缺钾及盐胁迫条件的K+吸收能力，同时减少对Na+的摄入，提高了K+/Na+，从而提高了植物的耐盐性。这种提高转基因植物的耐土壤低钾和耐盐的特性，可通过转基因技术应用于农作物上，从而应对日益严重的土壤低钾和盐渍化问题。
文档编号A01H5/00GK103215279SQ20131015047
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年4月26日
发明者苏乔, 商玲 申请人:大连理工大学