一株耐盐碱哈茨木霉及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株耐盐碱哈茨木霉及其应用。本发明的耐盐碱哈茨木霉的菌株号为29HB16，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC?No.7975。本发明的哈茨木霉29HB16能耐受80g/L以下盐浓度引起的盐胁迫和pH8.0以下的碱胁迫。在盐碱土壤中引进本发明的哈茨木霉29HB16，通过生物防治可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善环境，维持农业生态系统平衡。
【专利说明】一株耐盐碱哈茨木霉及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株耐盐碱哈茨木霉及其应用。
【背景技术】
[0002]木霉菌(Trichoderma spp.)属于半知菌类的丝孢纲,丛梗孢目，丛梗孢科,广泛存在于土壤中。1932年，Weindling发现木素木霉(Trichoderma Iignorum)可以寄生于多种植物病原真菌，建议将该菌用于土传植物病害的生物防治，木霉菌生防研究工作从此开始。20世纪70年代以来，国内外学者对木霉菌的拮抗作用及其机制作了大量深入的研究。K.Rinu(2013)等的研究发现，木霉菌产生的挥发性物质可引起病原菌结构畸变，进而引发形态畸变，从而抑制其孢子生长。李冲伟(2012)等的研究指出木霉菌产生的抑菌活性物质可破坏病原菌的防护系统和代谢途径，从而抑制其生长。除了生防功能外，木霉菌株还可以促进多种植物种子萌发、植株生长和开花、提高作物产量。关于其促生机制的研究也已比较深入，Hexon Angel Contreras-Cornejo等(2009)的研究指出，木霉菌通过生长素依赖机制增加植物的生物产量，刺激侧根生长，从而促进植物生长；还有研究(K.Rinu, 2013;戚玮真，2012，等)发现部分木霉菌具有溶解可溶性或微溶性矿物质的能力，促进植物对矿物质的吸收，从而促进植物生长。
[0003]烟草猝倒病俗称“倒苗病”、“塌皮烂”，其病原菌主要是由腐霉属真菌引起，猝倒病在幼苗生长的任何时期都可发生，但在三叶期以前幼苗出土至大十字期最易发病，根、茎、叶均可受害。发病初期幼苗基部呈褐色水溃状软腐，真叶局部发生褐色水溃状斑，发病后期茎部似沸水烫过，呈暗绿色；然后病部腐烂并逐渐干缩，病苗猝然萎蔫、折倒、干枯、死亡，苗床通常连片发病，烟苗成片倒伏死亡。天气潮湿时，腐烂部分常产生白色菌丝。烟苗病死后，在苗床上形成“补丁状”病区，严重时整畦烟苗所剩无几。4一6叶期的幼苗也可被害，受病植株停止生长，叶片呈苍黄色，病苗根部发生水溃状腐烂，皮层易自中柱剥离。如病菌从土面侵害烟株，则根不变色，但移`栽后如环境条件有利，在茎的近土面处产生褐色水溃伤痕，进而茎部破碎或皱缩干瘪。成株期受害，也多从茎基部开始，病部表现污白色或褐色水腐状病斑，并沿土层向上、下发展，最后使茎基部组织腐烂，引起整株枯萎。特别是在涝害之后，有时在烟株中部也可产生大块褐色块斑。自80年代以来，烟草猝倒病的发生范围、危害程度均迅速扩大，在山东、河南、安徽、云南、贵州、四川、福建、黑龙江和台湾等省都有流行，是全国各烟区普遍发生的一种苗床期主要病害，已成为烟草生产上的严重威胁。
[0004]烟草黑胫病俗称“黑根”、“黑杆疯”，多发生于成株期，也有少数苗床期发生。幼苗染病时，茎基部出现污黑色病斑，或从底叶发病沿叶柄蔓延至幼茎，引致幼苗猝倒，湿度大时，病部长满白色菌丝，幼苗成片死亡，茎杆染病时，茎基部初呈水溃状黑斑，后向上下及髓部扩展，绕茎I周时，植株萎蔫死亡。纵剖病茎，可见髓部黑褐色坏死并干缩呈“笋节”状，“节”间长满白色絮状菌丝。叶片染病时，初为水溃状暗绿色小斑，后扩大为中央黄褐色坏死、边缘不清晰隐约有轮纹呈”膏药”状黑斑.潮湿条件下，表面会生白色绒毛状物，是烟草上为害最严重的病害之一。据不完全统计，我国烟草黑胫病平均每年发病面积高达76373hm2，产量损失2869.26万千克，产值损失超过1.23亿元人民币。
[0005]目前生产上多采用化学药剂防治，但是长期大量地使用农药致使病原菌产生抗性，且严重破坏农业生态系统，造成对环境的污染。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一株耐盐碱哈茨木霉及其应用。
[0007]本发明提供的耐盐喊哈茨木霉(Trichoderma harzianum),菌株号为29HB16,已于2013年07月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为 CGMCC N0.7975。哈茨木霉(Trichoderma harzianum) 29HB16CGMCC N0.7975 在下文中简称哈茨木霉29HB16。
[0008]实验证明哈茨木霉29HB16能耐受80g/L以下(如50g/L以下或20g/L以下、50g/L-80g/L、20g/L-80g /L或20g/L_50g/L)的盐引起的盐胁迫和pH8.0以下的碱胁迫。在本发明的一个实施方式中，所述盐胁迫由含80g/L、50g/L或20g/L的NaCl环境引起。
[0009]所述哈茨木霉29HB16可以分生孢子、厚垣孢子、菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式存在。
[0010]本发明所提供的哈茨木霉29HB16的应用为下述任一种:
[0011]1、哈茨木霉29HB16在防治植物病害中的应用。
[0012]2、哈茨木霉29HB16和/或哈茨木霉29HB16的代谢物在制备植物病原菌抑制剂中
的应用。
[0013]3、哈茨木霉29HB16和/或哈茨木霉29HB16的代谢物在制备植物病害抑制剂中的应用。
[0014]4、植物病原菌抑制剂或植物病害抑制剂，它的活性成分是哈茨木霉29HB16和/或哈茨木霉29HB16的代谢物。
[0015]5、防治烟草烟草猝倒病和/或烟草黑胫病的方法，包括用哈茨木霉29HB16菌悬浮液浇灌烟草植株的步骤；每株烟草植株的用量为(5-10) X IO5Cfu哈茨木霉29HB16。
[0016]在本发明的一个实施方式中，所述哈茨木霉29HB16菌悬浮是用水悬浮哈茨木霉29HB16得到的液体。
[0017]上文中，所述防治植物病害可为防治植物在盐碱胁迫环境中的所述植物病害。所述植物病害可为真菌病害。所述真菌病害可为烟草猝倒病和烟草黑胫病中的至少一种。在本发明的一个实施方式中，所述烟草粹倒病由瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)引起，所述烟草黑胚病由寄生疫霉烟草致病变种(Phytophthora parasitica var.nicotianae)引起。
[0018]上文中，所述防治具体可为预防和/或治疗。所述哈茨木霉29HB16的代谢物可从哈茨木霉29HB16的发酵液中获得。所述哈茨木霉29HB16的代谢物具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养哈茨木霉29HB16，除去液体培养物(发酵液)中的哈茨木霉29HB16即得到所述哈茨木霉29HB16的代谢物。
[0019]上文中，所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂中除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
[0020]所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂中，所述哈茨木霉29HB16可以分生孢子、厚垣孢子、菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式存在。
[0021]所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
[0022]根据需要，所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
[0023]本发明制剂中的哈茨木霉29HB16的分生孢子数量随剂型和施用的方法而变化。固体制剂中，分生孢子的数量为(IX IO4)- (IXlO8)Cfu/克，如(IX IO6)- (IX IO7)个Cfu/克。对于液体制剂，稀释后的喷洒液中分生孢子的含量通常为(1.0Xio4)- (5.0X107)cfu孢子 /mL,如(1-3) X 1 05cfu/mLo
[0024]所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂可以与其它适合的化学农药配合使用，从而降低化学农药剂的用量，减少对环境的污染。
[0025]实验证明，本发明的哈茨木霉29HB16能耐受80g/L以下盐浓度引起的盐胁迫和PH8.0以下的碱胁迫，对烟草猝倒病和烟草黑胫病的防治效果分别为75%和100%，在盐碱土壤中引进本发明的哈茨木霉29HB16，通过生物防治可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善环境，维持农业生态系统平衡。
[0026]生物材料保藏说明
[0027]1、分类命名:哈茨木霉(Trichoderma harzianum),
[0028]菌株编号:29HB16，
[0029]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
[0030]保藏机构简称:CGMCC，
[0031]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，
[0032]保藏日期:2013年07月31日，
[0033]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.7975。
[0034]2、分类命名:长枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)，
[0035]菌株编号:29TJ04，
[0036]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
[0037]保藏机构简称:CGMCC，
[0038]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，
[0039]保藏日期:2013年07月31日，
[0040]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.7976。
[0041]下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1为编号为29TJ04的木霉菌株对猝倒病病菌和黑胫病病菌的抑制作用。[0043]A为编号为29TJ04的木霉菌株与猝倒病病菌的对峙培养平板；
[0044]B为只接种猝倒病病菌的平板；
[0045]C为编号为29TJ04的木霉菌株与黑胫病病菌的对峙培养平板；
[0046]D为只接种黑胫病病菌的平板。
[0047]图2为编号为29TJ04的木霉菌株的菌落形态和显微照片。
[0048]图3为编号为29HB16的木霉菌株的菌落形态和显微照片。
[0049]图4为编号为29HB16的木霉菌株对猝倒病病菌和黑胫病病菌的抑制作用。
[0050]A为编号为29HB16的木霉菌株与猝倒病病菌的对峙培养平板；
[0051]B为只接种猝倒病病菌的平板；
[0052]C为编号为29HB16的木霉菌株与黑胫病病菌的对峙培养平板；
[0053]D为只接种黑胫病病菌的平板。
【具体实施方式】
[0054]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0055]下述实施例中所用的黑`胫病致病菌为寄生疫霉卵菌纲真菌寄生疫霉烟草致病变种(Phytophthora parasitica var.nicotianae),在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心的保藏编号为ACCC38065，收藏日为2011年8月10日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株，下述实施例中均简称为黑胫病病菌。
[0056]实施例中所用的根腐病(粹倒病)致病菌为瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum),在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心的保藏编号为ACCC38064，收藏日为2011年8月10日，自收藏之日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株，下述实施例中均简称为猝倒病病菌。
[0057]实施例中所用的编号为ACCC32522的木霉菌株(长枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)),在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心的保藏编号为ACCC32522，收藏日为2013年3月23日，自收藏之日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
[0058]实施例中所用的编号为ACCC32524的木霉菌株(哈茨木霉(Trichodermaharzianum)),在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心的保藏编号为ACCC32524，收藏日为2013年3月23日，自收藏之日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
[0059]实施例1、哈茨木霉29HB16和长枝木霉29TJ04的特性及鉴定
[0060]1.1 土壤样品来源采自天津、河北地区的盐碱地。
[0061]1.2培养基
[0062]马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容到IOOOmL,煮沸混匀，得到不含氯化钠的H)液体培养基。
[0063]马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，20g琼月旨，蒸馏水定容到IOOOmL,煮沸混匀，得到不含氯化钠的PDA培养基。
[0064]耐盐碱木霉菌选择性固体培养基:分别向上述不含氯化钠的PDA培养基中加入氯化钠至氯化钠的含量为 20g/L (0.34mol/L),50g/L (0.86mol/L)或 80g/L (1.4mol/L)，均调节pH为8.0，得到氯化钠含量为20g/L的耐盐碱木霉菌选择性培养基(简称20g/L NaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基)、氯化钠含量为50g/L的耐盐碱木霉菌选择性培养基(简称50g/L NaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基)和氯化钠含量为80g/L的耐盐碱木霉菌选择性培养基(简称80g/L NaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基)。
[0065]耐盐碱木霉菌选择性液体培养基:分别向上述不含氯化钠的ro液体培养基中加入氯化钠至氯化钠的含量为 20g/L (0.34mol/L), 50g/L (0.86mol/L)或 80g/L (1.4mol/L),均调节pH为8.0，得到氯化钠含量为20g/L的耐盐碱木霉菌选择性液体培养基(简称20g/L NaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基)、氯化钠含量为50g/L的耐盐碱木霉菌选择性液体培养基(简称50g/L NaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基)和氯化钠含量为80g/L的耐盐碱木霉菌选择性液体培养基(简称80g/L NaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基)。
[0066]以上培养基菌种115 °C条件下灭菌20分钟。
[0067]1.3耐盐碱木霉菌株的分离筛选及基本生物学特性分析
[0068]1.3.1耐盐碱木霉菌株的分离筛选采用稀释涂布法由上述耐盐碱木霉菌选择性固体培养基分离菌株，挑取不同形态的木霉菌菌落进行纯化，转接至上述20g/L NaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基斜面保存。
[0069]结果共得到可耐受80g/L NaCl浓度、pH8.0的木霉菌株20株。其中，编号为29HB16、29TJ04、ACCC32522和ACCC32524的四株木霉菌的土样信息如表I所示。
[0070]表I四株木霉菌土样信息
[0071]
【权利要求】
1.哈茨木霉(Trichodermaharzianum),其特征在于:所述哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的菌株号为29HB16,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC N0.7975。
2.根据权利要求1所述的哈茨木霉，其特征在于:所述哈茨木霉耐受80g/L以下盐浓度引起的盐胁迫。
3.根据权利要求1或2所述的哈茨木霉，其特征在于:所述哈茨木霉耐受pH8.0以下的碱胁迫。
4.权利要求1-3中任一所述的哈茨木霉在防治植物病害中的应用。
5.权利要求1-3中任一所述的哈茨木霉和/或所述哈茨木霉的代谢物在制备植物病原菌抑制剂或植物病害抑制剂中的应用。
6.植物病原菌抑制剂或植物病害抑制剂，它的活性成分是权利要求1-3中任一所述的哈茨木霉和/或所述哈茨木霉的代谢物。
7.如权利要求4或5所述的应用或权利要求6所述的抑制剂，其特征在于:所述植物病害为真菌病害。
8.如权利要求7所述的应用或抑制剂，其特征在于:所述真菌病害为烟草猝倒病和/或烟草黑胫病。
9.根据权利要求4-8中任一所述的应用，其特征在于:所述防治植物病害为防治植物在盐碱胁迫环境中的所述植物病害。
10.防治烟草烟草猝 倒病和/或烟草黑胫病的方法，包括用权利要求1-3中任一所述的哈茨木霉的菌悬浮液浇灌烟草植株的步骤；每株烟草植株的用量为(5-10)X IO5Cfu所述哈茨木霉。
【文档编号】A01P3/00GK103451111SQ201310392172
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月2日 优先权日:2013年9月2日
【发明者】顾金刚, 李世贵, 王倩, 崔西苓, 雷强, 屈健康, 刘好宝, 张良, 龚明波 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所