优质肉鸡肌苷酸与肌内脂肪含量相关基因聚合的选育方法
【专利摘要】本发明公开了一种优质肉鸡肌苷酸与肌内脂肪含量相关基因聚合的选育方法，其包括以下步骤：以连续两个世代优质肉鸡基因组DNA为模版，在PCR条件下，利用三对引物分别扩增基因；根据琼脂糖凝胶电泳对第一引物、第二引物、第三引物扩增产物进行大小判定，然后采用DNA测序技术筛选到腺苷琥珀酸裂解酶基因外显子9，甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶基因5’非编码区，以及脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因内含子2共有三个碱基的突变；再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对这三个位点的SNPs进行基因分型和基因频率分析。本发明实现优势基因型的有利聚合，同时能较全面的探寻鸡肉质风味性状的遗传机制。
【专利说明】优质肉鸡肌苷酸与肌内脂肪含量相关基因聚合的选育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种选育方法，特别涉及一种优质肉鸡肌苷酸与肌内脂肪含量相关基因聚合的选育方法。
技术背景
[0002]改善与提高肉质风味已成为优质肉鸡育种研究的重要方向，其中，肌苷酸和肌内脂肪含量是影响肉质风味性状的重要因素。但肌苷酸和肌内脂肪均受多种因素影响，常规选育进展较慢；因此利用肌苷酸及肌内脂肪性状的相关候选基因，应用分子标记辅助选择加快遗传进展是当前较为有效的手段，从而从遗传水平上进行鸡肉质风味育种改良。国内外对肌肉品质性状分子标记筛选和标记辅助选择的研究已具备一定基础，特别对一些单基因性状标记辅助选择已取得了一定的进展。但肉质性状是一个受多基因控制的综合性状，仅仅从单基因入手进 行分子辅助育种，往往不能达到全面改良肉品质，最终培育优质鸡的目的。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种优质肉鸡肌苷酸与肌内脂肪含量相关基因聚合的选育方法，其实现优势基因型的有利聚合，同时能较全面的探寻鸡肉质风味性状的遗传机制。
[0004]本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的:一种优质肉鸡肌苷酸与肌内脂肪含量相关基因聚合的选育方法，其特征在于，其包括以下步骤:
[0005]步骤一，以连续两个世代优质肉鸡基因组DNA为模版，在PCR条件下，利用第一引物、第二引物、第三引物，分别扩增ADSL、GARS-AIRS-GART、A-FABP基因；
[0006]步骤二，根据琼脂糖凝胶电泳对第一引物、第二引物、第三引物扩增产物进行大小判定，然后采用DNA测序技术筛选到腺苷琥珀酸裂解酶基因外显子9，甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶基因5’非编码区，以及脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因内含子2共有三个碱基的突变；
[0007]步骤三，再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对这三个位点的SNPs进行基因分型和基因频率分析，分析优质肉鸡个体多态性与肌苷酸与肌内脂肪含量的关系及不同基因型组合与肌苷酸与肌内脂肪含量之间的关系，并上溯亲代，跟踪子代，检测优质肉鸡个体的基因型组合与肌苷酸与肌内脂肪含量的关系，分析不同基因型在肌苷酸与肌内脂肪含量性状形成中的贡献，挑选高肌苷酸与肌内脂肪含量个体的基因型组合，分析高肌苷酸与肌内脂肪含量个体基因型组合形成的选配方式，应用这些选配方式形成优质肉鸡高肌苷酸与肌内脂肪含量的多基因聚合核心群。
[0008]优选地，所述第一引物如下:上游引物IF:5’ -TCTCCTTCCACAGGCTCAA-3’ ；下游引物IR:5’ -AACTGCTGCACTGCACGAT-3’ ；所述第二引物P2如下:上游引物2F:5’-ACAGTTGCCAGTCTGATTA-3’ ；下游引物 2R:5’-CATCGCCAGAGTTAGAAGT-3’ ；所述第三引物P3如下:上游引物3F:5’ -GGAATGTGACAACGCTAA-3’ ；下游引物3R:5， -CGGATAAGGAGGGCAGAG-3，。
[0009]优选地，所述第一引物扩增腺苷琥珀酸裂解酶基因外显子9，用于筛选优质肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因位点的突变，第二引物扩增甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶基因5’非编码区，用于筛选优质肉鸡甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶基因位点的突变，第三引物扩增脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因内含子2，用于筛选优质肉鸡脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因位点的突变。
[0010]本发明具有如下积极效果:本发明实现优势基因型的有利聚合，同时能较全面的探寻鸡肉质风味性状的遗传机制。
【具体实施方式】
[0011]为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据具体实施例，对本发明作进一步详细的说明。
[0012]基因聚合是将分散在不同品种中的有利基因聚合到同一个基因组中，在分离世代中通过分子标记选择含有多个目标基因的个体，实现有利基因的聚合。采用基因聚合手段可以实现真正意义上的分子育种。故研究多个肉质候选基因的聚合效应将为加快地方鸡种优良种质特性的开发与利用，为优质鸡的产业发展提供技术支撑。
[0013]本发明以ADSL、GARS-AIRS-GART、A-FABP基因为研究对象，结果在八种聚合类型中，有利单基因聚合后的CCAAMM基因型胸肌肌苷酸含量(3.077mg/g)显著高于其它非完全有利基因型聚合个体。除了 CCBBMM型，CCAAMM型的肌内脂肪含量显著高于其它聚合基因型(P〈0.05)。通过基因聚合效应 的初步验证，ADSL、GART、A-FABP基因存在聚合效应，聚合基因型可作为大恒优质肉鸡肉质性状有效的候选标记。基因聚合群体可适当调整扩大，有利于更多优势基因型个体筛选 。分子标记辅助选择是进行基因聚合育种一种有效途径，同时，基因聚合育种在优质肉鸡分子育种中是可行的。
[0014]本发明优质肉鸡肌苷酸与肌内脂肪含量相关基因聚合的选育方法包括以下步骤:
[0015]步骤一，以连续两个世代优质肉鸡基因组DNA为模版，在PCR (聚合酶链式反应，PolymeraseChainReaction)条件下,利用三对引物P1、P2和P3(第一引物Pl,第二引物P2,第三引物P3)，分别扩增ADSL、GARS-AIRS-GART、A-FABP基因，其中:
[0016]所述第一引物Pl如下:上游引物IF:5’ -TCTCCTTCCACAGGCTCAA-3’;下游引物IR:5， -AACTGCTGCACTGCACGAT-3，；
[0017]所述第二引物P2如下:上游引物2F:5’ -ACAGTTGCCAGTCTGATTA-3’;下游引物2R:5， -CATCGCCAGAGTTAGAAGT-3，；
[0018]所述第三引物P3如下:上游引物3F:5’ -GGAATGTGACAACGCTAA-3’ ；下游引物3R:5， -CGGATAAGGAGGGCAGAG-3，；
[0019]第一引物Pl扩增腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL)基因外显子9，用于筛选优质肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因位点的突变；
[0020]第二引物P2扩增甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶(GARS-AIRS-GART)基因5’非编码区，用于筛选优质肉鸡甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶基因位点的突变；
[0021]第三引物P3扩增脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因内含子2，用于筛选优质肉鸡脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因位点的突变；
[0022]步骤二，根据琼脂糖凝胶电泳对三对引物扩增产物进行大小判定，然后采用DNA测序技术筛选到腺苷琥珀酸裂解酶基因外显子9，甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶基因5’非编码区，以及脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因内含子2共有三个碱基的突变；
[0023]步骤三，再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对这三个位点的SNPs进行基因分型和基因频率分析，分析优质肉鸡个体多态性与肌苷酸与肌内脂肪含量的关系及不同基因型组合与肌苷酸与肌内脂肪含量之间的关系，并上溯亲代，跟踪子代，检测优质肉鸡个体的基因型组合与肌苷酸与肌内脂肪含量的关系，分析不同基因型在肌苷酸与肌内脂肪含量性状形成中的贡献，挑选高肌苷酸与肌内脂肪含量个体的基因型组合，分析高肌苷酸与肌内脂肪含量个体基因型组合形成的选配方式，应用这些选配方式形成优质肉鸡高肌苷酸与肌内脂肪含量的多基因聚合核心群。
[0024]所述PCR 扩增的条件是:10μ L 扩增体系:2XLong Taq PCR MasterMix 5μ L ；ddH20, 3.5 μ L ;上、下游引物(F、R) (10pmol/ul)，各 0.5μ L ;DNA 模板(50ng/μ L)，0.5 μ L ；
[0025]PCR反应程序如下:1)利用引物Pl的PCR反应程序为:95°C预变性3min ;95°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸50s，共进行35个循环;72°C延伸10min，4°C保存。2)利用引物P2的PCR反应程序为:95°C预变性3min ;95°C变性30s，53。。退火30s, 72°C延伸50s，共进行35个循环；72°C延伸10min，4°C保存。3)利用引物Pl的PCR反应程序为:95°C预变性3min ;95°C变性30s，59°C退火30s，72。。延伸50s，共进行35个循环;72°C延伸IOmin,4°C保存。
[0026]所述腺苷琥珀酸裂解酶基因外显子9在10191bp存在C/T的突变，甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶基因5’非编码区在153bp存在C/T的突变，以及脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因内含子2在1684bp存在C/T的突变；
[0027]所述基因分型是用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和分析引物P1、P2和P3的PCR产物，结果如下:
[0028]第一引物Pl位点:纯合型CC在10191bp位的碱基是C，杂合型CT在10191bp位的碱基是c/τ，纯合型TT在10191bp位的碱基是T ；
[0029]第二引物P2位点:纯合型AA在153bp位的碱基是C，杂合型AB在153bp位的碱基是C/T，纯合型BB在153bp位的碱基是T ；
[0030]第三引物P3位点:纯合型MM在1684bp位的碱基是C，杂合型MN在1684bp位的碱基是C/T，纯合型NN在1684bp位的碱基是T ；
[0031]所述有利单基因聚合组合为:CCAAMM (F0代和Fl代)；
[0032]所述不同基因型在肌苷酸含量与肌内脂肪含量性状形成中的贡献率为，有利单基因聚合后的CCAAMM基因型个体肌苷酸含量(3.077mg/g)显著高于其它非完全有利基因型聚合个体，比基因型CC的高7.96%，比基因型AA的高9.91%，、比基因型丽的高12.21% ;除了 CCBBMM型，CCAAMM型的肌内脂肪含量显著高于其它聚合基因型，比基因型CC的高5.49%,比基因型AA的高5.68%,、比基因型MM的高6.11%。
[0033]利用引物P1、P2和P3分别对腺苷琥珀酸裂解酶基因外显子9、甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶基因5’非编码区和脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因内含子2的PCR扩增及其多态性的检测。
[0034]1、优质肉鸡血样的采集及处理
[0035]用注射器从大恒优质肉鸡翼下静脉处采血2mL，注入真空采血管(EDTA.K2抗凝)中。冰盒保存，带回实验室。3000r/min离心10min,4°C保存备用。
[0036]本实施例采用优质肉鸡血样300份，采自四川大恒家禽育种有限公司。
[0037]2、血样基因组DNA的提取、纯化
[0038](I)血样经离 心移去血清后取10 μ L,加PBS溶液稀释至250 μ L,后加入500 μ L细菌裂解液Buffer API (1.5mL离心管中)，涡旋振荡IOs ；
[0039](2)加入 100 μ L 蛋白沉淀液 Buffer AP2,润旋振荡 10s, 12000g 离心 IOmin ；
[0040](3)取上清液600 μ L,加入DNA制备柱中(制备柱预先置于2mL离心管中)，12000g离心Imin，弃滤液；
[0041](4)制备柱中加入700 μ L洗涤液Buffer W1A，室温放置2min，12000g离心lmin，
弃滤液；
[0042](5)向制备柱中加入800 μ L去盐液Buffer W2,12000g离心lmin,弃滤液；再加入500 μ L Buffer W2,12000g 离心 lmin,弃滤液；12000g 离心 lmin ;
[0043](6)将制备柱置于1.5mL离心管中，在silica膜中央加入200 μ L Buffer TE (预热到65°C)，室温静置lmin ;12000g离心Imin洗脱DNA。
[0044]基因组DNA检测:采用1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测DNA纯度和浓度。
[0045]1.5%琼脂糖凝胶配置:称取琼脂糖0.225g，加入15mL0.5 X TBE溶液，微波溶解，再加入0.75 μ L Gold View核酸染料，制胶(水平胶)；电泳:将5μ L DNA溶与I μ L 6 X DNALoading Buffer混匀，上样，120V条件下在水平电泳槽中于0.5XTBE电泳缓冲液中电泳30min,检测DNA电泳条带,凝胶成像系统照相保存。
[0046]紫外分光光度计测定核酸:在260nm和280nm处测定核酸紫外吸光度值，即0D260、0D280和0D260/0D280值，检测DNA浓度和纯度，确保无蛋白质、RNA及小分子物质污染。
[0047]突变位点检测，采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，具体步骤如下:
[0048](I) 12%聚丙烯酰胺凝胶配置:量取30%丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺预混液(29:1)8mL，I X TBE溶液12mL，加入10%过硫酸铵120 μ L，TEMED 24 μ L，于冰上混匀，迅速灌胶(垂直胶)。
[0049](2) PCR产物预变性:将20 μ L LIS-SSCP上样缓冲液与IyL PCR产物混匀，97°C变性2min，室温放置。
[0050](3)电泳:取IOyL PCR变性产物，上样，120V条件下在垂直电泳槽中于IXTBE电泳缓冲液中冰浴电泳2?4h，检测变性PCR产物的单链构象多态性。
[0051](4)银染:胶铲轻取下凝胶，双蒸水洗涤30s ;加入IOOmL 0.l%AgN03染色液染色IOmin (摇床约30r/min),再用双蒸水洗漆IOs ;采用IOOmL四硼酸钠显色液显色,加入甲醒500 μ L轻摇显色IOmin至获得满意效果，双蒸水洗涤两遍；凝胶成像系统照相保存。
[0052]根据非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，挑选不同基因型个体的PCR产物经AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司)纯化后送上海Invitrogen公司进行序列测定。
[0053]实验过程是先利用聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选到腺苷琥珀酸裂解酶基因外显子9，甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶基因5’非编码区，以及脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因内含子2共有三个碱基的突变；再采用DNA测序技术对这三个SNPs位点不同基因型进行验证，然后进行基因分型和基因型频率分析。
[0054]以上所述具体实施例，对本发明的解决的技术问题、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范 围之内。
【权利要求】
1.一种优质肉鸡肌苷酸与肌内脂肪含量相关基因聚合的选育方法，其特征在于，其包括以下步骤: 步骤一，以连续两个世代优质肉鸡基因组DNA为模版，在PCR条件下，利用第一引物、第二引物、第三引物，分别扩增ADSL、GARS-AIRS-GART、A-FABP基因； 步骤二，根据琼脂糖凝胶电泳对第一引物、第二引物、第三引物扩增产物进行大小判定，然后采用DNA测序技术筛选到腺苷琥珀酸裂解酶基因外显子9，甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶基因5’非编码区，以及脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因内含子2共有三个碱基的突变； 步骤三，再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对这三个位点的SNPs进行基因分型和基因频率分析，分析优质肉鸡个体多态性与肌苷酸与肌内脂肪含量的关系及不同基因型组合与肌苷酸与肌内脂肪含量之间的关系，并上溯亲代，跟踪子代，检测优质肉鸡个体的基因型组合与肌苷酸与肌内脂肪含量的关系，分析不同基因型在肌苷酸与肌内脂肪含量性状形成中的贡献，挑选高肌苷酸与肌内脂肪含量个体的基因型组合，分析高肌苷酸与肌内脂肪含量个体基因型组合形成的选配方式·，应用这些选配方式形成优质肉鸡高肌苷酸与肌内脂肪含量的多基因聚合核心群。
2.根据权利要求1所述优质肉鸡肌苷酸与肌内脂肪含量相关基因聚合的选育方法，其特征在于，所述第一引物如下:上游引物IF: 5 ’ -TCTCCTTCCACAGGCTCAA-3 ’ ；下游引物IR:5’ -AACTGCTGCACTGCACGAT-3，;所述第二引物P2如下:上游引物2F:5’-ACAGTTGCCAGTCTGATTA-3’ ；下游引物 2R:5’-CATCGCCAGAGTTAGAAGT-3’ ；所述第三引物P3如下:上游引物3F:5’ -GGAATGTGACAACGCTAA-3’ ；下游引物3R:5， -CGGATAAGGAGGGCAGAG-3，。
3.根据权利要求1所述优质肉鸡肌苷酸与肌内脂肪含量相关基因聚合的选育方法，其特征在于，所述第一引物扩增腺苷琥珀酸裂解酶基因外显子9，用于筛选优质肉鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因位点的突变，第二引物扩增甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶基因5’非编码区，用于筛选优质肉鸡甘氨酰胺核苷酸合成酶-5-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲基酶基因位点的突变，第三引物扩增脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因内含子2，用于筛选优质肉鸡脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因位点的突变。
【文档编号】A01K67/027GK103436630SQ201310436012
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】蒋小松, 张增荣, 杜华锐, 邱莫寒, 李晴云, 杨朝武, 李雯, 宋小燕, 余春林, 熊霞 申请人:四川省畜牧科学研究院