基于慢病毒转导质粒的hbv小鼠模型的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于慢病毒转导质粒建立的HBV小鼠模型，旨在提供一种建立小鼠HBV持续性感染模型的方法。所属领域为生物技术。其技术特征在于将携带多拷贝HBV?DNA的重组质粒pCS-HBV1.3经尾静脉高压水动力注射到小鼠体内感染小鼠肝组织细胞，所使用的小鼠为免疫功能正常的6周龄雌性C57BL／6小鼠。以该方法建立HBV持续性感染模型操作简单，可模拟人类HBV感染过程，为HBV感染研究提供很好的工具。
【专利说明】基于慢病毒转导质粒的HBV小鼠模型
[0001]【技术领域】本发明属于生物技术发明领域，特别是涉及一种基于慢病毒载体系统转导质粒pCS-HBVl.3建立HBV持续性感染的小鼠模型。
[0002]【背景技术】乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae),其感染已成为全球面临的严重公共健康问题之一,全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC);我国属HBV高流行国家，HBV携带者约有9300万，慢性肝炎患者达3000万，每年有近30万人死于肝硬化或肝癌，因而也是我国亟需解决的重大问题。
[0003]HBV具有严格的宿主特异性和嗜肝性，只感染人和少数灵长类动物，极大地限制了人们对HBV生物学特性、发病机制及药物和疫苗的开发和评价等方面的研究。目前建立的HBV感染动物模型主要有鸭乙肝模型、土拨鼠乙肝模型、HBV感染黑猩猩、HBV转基因小鼠以及人鼠嵌合肝脏小鼠模型等。鸭乙肝病毒(DHBV)和土拨鼠乙肝病毒(WHV)基因组有别于人类HBV，黑猩猩由于费用和伦理方面的原因受到限制；而转基因小鼠的获得需要昂贵的显微注射设备和复杂的操作，非常耗时费力，且免疫系统对HBV先天耐受；人鼠嵌合肝脏小鼠模型虽可完整的呈现HBV复制周期，但其也存在制备困难、技术条件要求较高、难以大规模制备以及免疫系统抑制等问题，因而有必要建立一种方便、实用、快速的小动物动物模型。
[0004]基于HBV可复制性克隆转染免疫功能正常的成体小鼠建立的HBV急、慢性感染模型为HBV相关研究提供了良好的工具。Yang等(Yang PL, Althage A, Chung J，etal.Hydrodynamic injection o`f viral DNA:a mouse model of acute hepatitis B virusinfection.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99 (21): 13825-13830)采用高压水动力注射的方法，将大约1.6ml的含1.3拷贝HBV基因组的DNA溶液在短时间内(5_8s)快速注入到小鼠体内建立了 HBV急性感染模型，该方法可使小鼠产生高滴度的病毒(107cOpy / ml血液)，但一周后由于特异性抗病毒抗体和CD8+T细胞的出现HBV从血液中得以清除，而在(NOD) / SCID小鼠中病毒可持续存在81天。而Huang LR等(Huang LR，ffu HL，ChenPJ，et al.An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronichepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(47):17862-17867.)将pAAV-HBVl.2质粒与将HBV基因组克隆到克隆载体pGEM4Z的质粒同时注射C57BL / 6小鼠，前者在注射后25天仍可检测到HBsAg的表达，28天之内检测不到抗HBs抗体的产生；而后者仅产生瞬时的抗原血症，且28天之内产生抗HBs抗体可见转基因载体结构是影响HBV基因在小鼠体内表达的一个重要因素，。另外国内学者(郭燕菊，王文，孙世惠，等.免疫抑制剂地塞米松可明显延长乙型肝炎病毒抗原在水动力法转染HBV小鼠模型中的表达[J].病毒学报，2010，26 (1):20-26.)等将含有1.3拷贝HBV基因组的HBV表达质粒经高压水动力法尾静脉注射C57BL / 6小鼠，在注射后30天血清HBsAg和HBeAg即转为阴性，且血清和肝组织中病毒载量下降。
[0005]慢病毒载体(Lentiviral vector, LVs)是在人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基础上改造而成的，能利用逆转录酶和整合酶，将自身的RNA转变为DNA整合到宿主细胞的染色体中，从而使目的基因在宿主细胞中长期而稳定的表达。慢病毒载体系统主要由三种包含不同结构的质粒构成，分别是转移质粒、辅助质粒和包膜表达质粒。转移质粒除可插入感兴趣的外源基因，还保留了病毒的LTR区和其他对病毒的整合和复制起重要作用的原件；其中LTR区包含了慢病毒的启动子、增强子、包装信号、整合位点；整合位点可使病毒基因整合到宿主基因，使得外源基因得以长期稳定的表达。
[0006]高压水动力尾静脉注射(ZhangG,Budker V,Wolff JA.High levels of foreigngene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.Hum Gene Then 1999，10 (10): 1735-1737)是可使外源基因在肝内表达的一种技术方法，利用该方法建立的小鼠HBV急慢性感染模型，为研究HBV复制和基因表达、肝癌致病机理及抗病毒药物筛选及疫苗研究等提供了一个良好的工具。但目前难以获得HBV持续性感染模型，因而本研究和发明利用慢病毒载体系统的转基因载体结构，构建携1.3倍HBV基因组的转基因载体pCS-HBVl.3，经高压水动力尾静脉注射的方法注入到小鼠体内，使其能够稳定高效长期表达HBV基因。
【发明内容】
:
[0007]针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于慢病毒转基因载体携带1.3倍HBV基因组的重组质粒pCS-HBVl.3，以及利用该质粒采用高压尾静脉注射技术建立HBV感染模型的方法；利用本发明的方法建立的HBV急、慢性感染模型有助于HBV生物学特性、发病机制及药物的开发和评价等方面的研究。
[0008]本发明利用转基因载体pCS-HBVl.3制备HBV小鼠急、慢性感染模型的制备方法，具体步骤如下:
[0009](1)载体构建:本发明以pAAV / HBV1.3质粒为模板，通过PCR的方法获得1.3拷贝的HBV基因组(ayw亚型，GenBank:AB267090.1，D基因型)DNA片段；然后将此DNA片段插入到pCS-CG质粒的多克隆位点，并去除了原质粒上的EGFP表达盒，获得了携带1.3拷贝HBV基因组DNA的重组质粒pCS-HBVl.3，经酶切、测序鉴定正确；
[0010](2)采用高压水动力的方法将含有1.3拷贝HBV DNA的重组载体通过尾静脉注入至丨J小鼠体内，建立HBV感染的小鼠模型；
[0011](3)模型鉴定。
[0012]上述1.3拷贝的HBV DNA重组表达载体经PCR扩增得到HBV基因组的第1个片段(1066-3182bp)，经Pst 1、EcoR I双酶切后连接到同样双酶切的pCS_CG载体，构建重组质粒pCS-HBVl质粒；之后PCR扩增HBV基因组的第二个片段(0_1582bp)，经EcoR 1、ΚρηΙ双酶切后连接到同样酶切的pCS-HBVl的质粒上，获得了含1.3倍HBV基因组的重组质粒pCS-HBVl.3。
[0013]一种含1.3倍基因组的基于慢病毒载体系统的乙肝成体转基因小鼠模型，它是将
1.3倍的HBV重组质粒pCS-HBVl.3利用高压水动力的方法经尾静脉注入到小鼠体内，所述动物是小鼠，高压水动力尾静脉注射法是本发明所用的关键技术。
[0014]本发明采用常规的高压水动力注射的方法，注射前先将小鼠于白炽灯泡下照射10-15min,使其尾静脉扩张；注射质粒量为5 μ g，液体为0.9% NaCl溶液。利用该方法在注射后24h即可建立HBV感染模型，其抗原表达可持续存在16周，可获得HBV持续性感染的模型。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1HBV转基因载体构结构示意图
[0016]为HBV转基因载体构pCS-HBV1.3结构示意图。载体骨架为慢病毒载体系统的转移质粒pCS-CG，将1.3倍HBV基因组插入取代其中的EGFP表达盒。
[0017]图2pCS-HBVl.3 与 pAAV / HBV1.3 转染细胞上清 HBsAg、HBeAg 的检测
[0018]体外培养的Huh7细胞，分别用质粒pCS-HBVl.3和pAAV / HBV1.3转染细胞后，检测培养细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。图中可见，两种质粒转染细胞后48h，上清中HBsAg和HBeAg的表达均为阳性，但两种质粒转染后上清中HBsAg和HBeAg的表达无显著差异。
[0019]图3雌性C57BL / 6小鼠注射pCS_HBVl.3质粒建立HBV小鼠模型指标检测
[0020]为雌性C57BL / 6小鼠经尾静脉注射5 μ g pCS-HBVl.3后各时间点检测HBV各种指标的动态变化。结果显示，注射后Id后即可在血清中检测到HBsAg、HBeAg和HBV DNA,并且在注射后1周可在血清中检测到ant1-HBc产生以及肝组织HBV DNA的存在，上述指标均持续到8周均为阳性；而在此期间均未检测到ant1-HBs的产生。参见实施例2。[0021 ] 图4雌性C57BL / 6小鼠注射pAAV_HBVl.3质粒建立HBV小鼠模型指标检测
[0022]为雌性C57BL / 6小鼠经尾静脉注射5 μ g pAAV / HBV1.3后各时间点检测HBV各种指标的动态变化。结果显示，注射后Id后即可在血清中检测到HBsAg、HBeAg和HBVDNA,但在4周内全部转为阴性，同时检测到ant1-HBs产生；在注射后1周可在血清中检测到ant1-HBc产生以及肝组织HBV DNA的存在，注射后8周仍为阳性。参见实施例3。
[0023]图5雌性C57BL / 6小鼠分别注射pCS_HBVl.3和pAAV_HBVl.3质粒后血清及肝组织DNA检测
[0024]为雌性C57BL / 6小鼠经尾静脉分别注射5 μ g pCS-HBVl.3和pAAV_HBVl.3质粒后各时间点检测血清及肝组织DNA变化。结果显示，pCS-HBVl.3质粒注射小鼠血清HBV DNA阳性持续时间显著长于pAAV-HBVl.3质粒注射小鼠；而上述两质粒注射小鼠肝组织DNA在注射后56天持续阳性，二者之间无差别。
[0025]图6雌性C57BL / 6小鼠分别注射pCS_HBVL 3和pAAV_HBVL 3质粒后肝组织免疫组化分析结果
[0026]为为雌性C57BL / 6小鼠经尾静脉分别注射5 μ g pCS-HBVl.3和pAAV-HBVl.3质粒后5d经免疫组化检测肝组织HBeAg的表达。可见上述两种质粒注射小鼠肝组织均可检测到HBeAg的表达。A为pCS-HBVl.3质粒注射小鼠结果，B为pAAV-HBVl.3质粒注射小鼠结果，C为注射NS小鼠的免疫组化结果。
[0027]图7雌性BALB / c小鼠注射pCS_HBVl.3质粒建立HBV小鼠模型指标检测
[0028]为雌性BALB / c小鼠经尾静脉注射5 μ g pCS-HBVl.3后各时间点检测HBV各种指标的动态变化。结果显示，注射后Id后即可在血清中检测到HBsAg、HBeAg和HBV DNA,但在注射后2周内全部转为阴性，并且血清中可检测到ant1-HBs ;在注射后1周可在血清中检测到ant1-HBc产生以及肝组织HBV DNA的存在。参见实施例4。
[0029]图8雄性C57BL / 6小鼠注射pCS_HBVl.3质粒建立HBV小鼠模型指标检测[0030]为雄性的C57BL / 6小鼠经尾静脉注射5Bg pCS_HBVl.3后各时间点检测HBV各种指标的动态变化。结果显示，注射后Id后即可在血清中检测到HBsAg、HBeAg和HBV DNA，并在注射后4周转为阴性，并伴随ant1-HBs产生；在注射后1周可在血清中检测到ant1-HBc产生以及肝组织HBV DNA的存在，并在注射后8周均为阳性。参见实施例5。
[0031 ] 图9HI小鼠免疫计划参见实施例7
[0032]图10HI小鼠免疫后抗体及细胞免疫应答检测
[0033]为HI小鼠接受HBSS1联合Alum和Poly I:C佐剂初免和加强免疫后的体液和细胞免疫应答检测结果。结果显示，加强免疫后针对于HBV S和PreSl抗体均显著增加，细胞免疫应答亦有所增强。A ant1-S检测结果B ant1-Presl检测结果C S肽库刺激的ELISpot结果
[0034]图11HI小鼠免疫后HBV DNA、HBsAg及HBeAg动态变化检测
[0035]为HI小鼠免疫后HBV HBV DNA、HBsAg及HBeAg动态变化的结果，可见HBSS1两针免疫后，血清HBV DNA完全清除，但肝组织DNA无明显变化；HBSS1联合Alum和Poly I:C佐剂免疫两次后血清HBsAg和HBeAg和对照组相比显著降低。
【具体实施方式】:
[0036]以下通过实施例进一步说明本发明。
[0037]实施例1重组质粒pCS-HBVl.3的建立
[0038]材料及来源:
[0039]含1.3倍乙型肝炎病毒全基因(ayw亚型，GenBank:AB267090.1)的质粒pAAV-HBVl.3由本室前期构建(郭燕菊，王文，孙世惠，等.免疫抑制剂地塞米松可明显延长乙型肝炎病毒抗原在水动力法转染HBV小鼠模型中的表达[J].病毒学报，2010，26(1):20-26.)；
[0040]质粒pCS-CG 来源于 D r.Chow SA(UCLA AIDS Institute),由本室保存。
[0041]质粒小提试剂盒，PCR产物回收试剂盒，DNA胶回收试剂盒、片段回收试剂盒及病毒基因组提取试剂盒购 自天根生化科技有限公司。质粒大提提取试剂盒购自Qiagen公司。
[0042]pCS-HBVl.3质粒构建方法:
[0043]首先以pAAV-HBVl.3质粒为模板，设计特异性引物扩增HBV基因组第一个(1066-3182bp)，引物如下:上游:ACGCTGCAGATGCATGTATTCAATCTAAG(Pst I)，下游:ATAGAATTCCACCACTGCATGGCCTGAGGAT (EcoR I) ；PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳回收2116bp片段，经Pst I,EcoR I双酶切后经与同样上述两种酶双酶切的pCS-CG质粒连接转化DH10B感受态细胞；筛选含2116bp HBV基因组的阳性克隆pCS-HBVl，经Pst 1、EcoR I酶切及序列测序鉴定。
[0044]其次以pAAV-HBVl.3质粒为模板，设计特异性引物扩增HBV基因组第二个片段(0-1582bp)，引物如下:上游:CGCGAATTCCACAACCTTTCACCAAACTC(EcoR I);下游:ATAGGTACCAGATCTCGTACTGAAGGAAAG (Kpn I) ;PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳回收2116bp片段，PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳回收1582bp片段，经EcoR 1、Kpn I双酶切后经与同样上述两种酶双酶切的pCS-HBVl质粒连接转化DH10B感受态细胞；筛选含1.3倍HBV基因组的阳性克隆pCS-HBVl.3，经Pst 1、Kpn I酶切及序列测序鉴定。构建的重组质粒pCS-HBVl.3结构示意图见图1。
[0045]实施例2重组质粒pCS-HBVl.3和pAAV-HBVl.3体外细胞转染实验材料及来源:
[0046]培养细胞株Huh7为肝来源的细胞，细胞培养液为含10% FBS的DMEM。
[0047]转染试剂FuGENE HD购自Roche公司。
[0048]HBV HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂盒购自上海科华生物公司。
[0049]转染方法:
[0050]接种5X 105Huh7细胞于六孔板，次日转染前换成opt1-MEM培养基，每孔2ml，100ulopt1-MEM加2 μ g质粒后混匀，再加入6 μ 1 FuGENE HD转染试剂，轻轻混匀后室温放置15min后逐滴加入到六孔板中，6h后换为含2 % FBS的DMEM后继续培养，转染后48h收获上清100 μ 1ELISA方法测定HBsAg和HBeAg的表达和分泌水平。血清HBsAg结果判定为S / C0V>1为阳性，进一步用罗氏新型乙肝表面抗原(HBsAg)定量检测试剂检测，将检测到的 S / C0V 值转换为 cut-off index (C0I)，以 C0I ≥ 1 为阳性。HBeAg、HBsAb 及 HBcAb 的判定标准为0D450大于2.1倍阴性对照0D450的平均值判断为阳性。
[0051]结果显示重组质粒pCS-HBVl.3和pAAV-HBVl.3体外转染Huh7细胞后48h，均可检测到HBsAg和HBeAg的表达，且二者表达水平无显著差别。具体结果参见图2。
[0052]实施例3
[0053]比较两种HBV转基因载体pCS-HBVl.3与pAAV-HBVl.3建立HBV成体小鼠模型
[0054]实验如下:
[0055]材料及来源:
[0056]动物SPF级C57BL / 6小鼠，4-6周龄，雌性，体重18_22g，由中国医学科学院实验动物研究所，饲养于中国疾病预防控制中心二级动物房。饲养条件按照SPF级动物标准执行。
[0057]试剂:经QIAGEN公司质粒大量提取纯化试剂盒纯化的质粒pCS_HBVl.3及pAAV-HBVl.3 ;生理盐水(0.9%的 NaCl 溶液)。
[0058]仪器:lml、2ml及5ml注射器。
[0059]方法
[0060]高压水动力尾静脉注射:雌性SPF级C57BL / 6小鼠分成两组，每组6只，分别经高压水动力尾静脉注射5 μ g质粒pCS-HBVl.3及pAAV-HBVl.3。具体操作如下:先将小鼠置于30瓦白炽灯泡下照射，使小鼠尾静脉扩张；注射前再将尾静脉浸于37°C左右的温水中进一步扩张尾静脉；5-8秒内将1.5-2.5ml (相当于小鼠体重的8% -10%体积)的质粒溶液匀速注射到小鼠体内，注射后室温条件下观察小鼠反应；
[0061]HBV指标检测:
[0062]1.各组小鼠注射后l、3、5、7、10、14d之后相继隔周，乙醚麻醉后内眦静脉取血，分离血清，以PBS1:10稀释后用ELISA检测试剂盒(上海科华)检测血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb及HBcAb水平。血清HBsAg结果判定为S / C0V>1为阳性，进一步用罗氏新型乙肝表面抗原(HBsAg)定量检测试剂检测，将检测到的S / C0V值转换为cut-off index (C0I)，以C0I≥1为阳性。HBeAg、HBsAb及HBcAb的判定标准为0D450大于2.1倍阴性对照0D450的平均值判断为阳性。
[0063]2.Real-time PCR检测小鼠血清及肝组织HBV DNA水平:荧光定量PCR试剂盒购自湖南圣湘生物科技有限公司；荧光定量PCR仪为Agilent公司生产的Staragene MX3005P。肝组织DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。观察终末处死小鼠，分离肝组织，称取30mg左右的小鼠肝组织提取，最后以50μ 1 ΤΕ溶解，分别取分离的小鼠血清和提取的肝组织 DNA5 μ 1 进行 Real-time PCR 检测。
[0064]结果显示:pCS-HBVl.3注射组小鼠，在注射后1天即可在血清中检测到HBsAg、HBeAg的表达，并且70%小鼠均可在6周内持续阳性；并且在注射后7天至注射后56天均可检测到HBcAb的表达；而pAAV-HBVl.3注射组小鼠在注射后1周可在血清中检测到高水平的HBsAg、HBeAg及HBV DNA,但在注射后28天全部转阴，并伴随HBsAb产生；而上述两组小鼠均可在血清及肝组织中检测到HBV DNA，在注射后56天，pCS-HBVl.3注射组肝组织HBV DNA水平高于pAAV-HBVl.3注射组；而两组小鼠血清DNA均在注射后第Id即可检测到，pCS-HBVl.3注射组小鼠在注射后1周血清DNA达高峰之后缓慢下降；而pAAV-HBVl.3注射组只在注射后10d检测到，注射后14d全部转阴。二者在肝内均可检测到HBeAg的表达；提示注射pCS-HBVl.3质粒更优于pAAV-HBVl.3建立小鼠HBV持续性感染模型。结果参见图3、4、5。
[0065]实施例4
[0066]比较BALB / c和C57BL / 6小鼠分别注射pCS_HBVl.3建立的小鼠模型
[0067]实验如下:
[0068]实验动物为SPF级BALB / c和C57BL / 6小鼠，各6只，雌性，6周龄。
[0069]注射质粒为pCS-HBVl.3，注射量为5 μ g/只，溶于相当于小鼠体重8% -10%体积的NS中。
[0070]注射方法高压水动力尾静脉注射，小鼠经光照尾静脉扩张后，将质粒溶液在5_8s内匀速注射到小鼠体内。
[0071]检测方法:按预先设定好的时间点经内眦静脉采血。采血量为50 μ 1，经5000rpm，离心5min收集血清，以PBS1:10稀释后，用于HBsAg、HBeAg、HBsAb及HBcAb的ELISA检测(使用上海科华公司的HBV ELISA检测试剂盒);用HBV核酸定量试剂盒(PCR-荧光探针法)(国食药监械(准)字2011第340，湖南圣湘生物)按照使用说明书检测血清及肝组织HBV DNA。
[0072]结果显示:BALB / c小鼠高压水动力注射5μ g pCS-HBVl.3质粒后，HBsAg和HBeAg在注射后5d达高峰，之后迅速下降，至注射后12d转为阴性；与此同时，注射质粒后7天可检测到HBcAb ;注射质粒后14d检测到HBsAb ;血清HBV DNA同样在注射质粒后l_14d阳性，但肝组织DNA注射后15d后仍可检测到。而C57BL / 6小鼠高压水动力注射5 μ gpCS-HBVl.3质粒后，约70%小鼠血清HBsAg、HBeAg及HBV DNA表达时间明显长于BALB /c小鼠，并且在注射后56d未检测到HBsAb的产生，提示宿主的遗传背景影响HBV在小鼠体内的持续表达。结果参见图3和图7。
[0073]实施例5
[0074]雌性、雄性C57BL / 6小鼠高压水动力注射pCS-HBVl.3质粒比较
[0075]实验动物为SPF级雌性及雄性C57BL / 6小鼠，各6只，6周龄。
[0076]注射质粒为pCS-HBVl.3，注射量为5μ g /只，溶于相当于小鼠体重8%-10%体积的NS中。[0077]注射方法高压水动力尾静脉注射，小鼠经光照尾静脉扩张后，将质粒溶液在5_8s内匀速注射到小鼠体内。
[0078]检测方法:按预先设定好的时间点经内眦静脉采血。采血量为50 μ 1，经5000rpm，离55min收集血清，以PBS1:10稀释后，用于HBsAg、HBeAg、HBsAb及HBcAb的ELISA检测(使用上海科华公司的HBV ELISA检测试剂盒);用HBV核酸定量试剂盒(PCR-荧光探针法)(国食药监械(准)字2011第340，湖南圣湘生物)按照使用说明书检测血清及肝组织HBV DNA。
[0079]结果显示:雄性C57BL / 6小鼠经高压水动力尾静脉注射5 μ g pCS-HBVl.3质粒后，血清HBsAg在注射后第Id即可检测到，但到注射后28d全部转阴，并且伴随HBsAb的产生；血清HBeAg同样在注射后第Id检测到，且约70%的小鼠在注射后28d转阴；血清HBVDNA在注射后49d均可检测到。而雌性C57BL / 6小鼠其阳性小鼠比例及阳性持续时间均高于雄性小鼠，提示雌性C57BL / 6小鼠更适合建立HBV持续感染模型。结果参见图3和图8。
[0080]实施例6
[0081 ] 肝组织HBeAg免疫组化分析:
[0082]实验动物为SPF级C57BL / 6小鼠，雌性，6周龄。
[0083]注射质粒为pCS-HBVl.3和pAAV-HBVl.3，注射量为5 μ g/只，溶于相当于小鼠体重8% -10%体积的NS中。
[0084]注射方法高压水动力尾静脉注射，小鼠经光照尾静脉扩张后，将质粒溶液在5_8s内匀速注射到小鼠体内。同时设注射NS对照鼠；免疫组化分析HBeAg的表达。
[0085]试剂:兔抗HBeAg单克隆抗体购自Santa Cruz公司，HRP标记羊抗兔抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。
[0086]方法如下:各小鼠分别在注射后5d、42d处死小鼠，分离肝组织，经4%多聚甲醛固定织常规梯度酒精脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，切片后进行HE染色进行病理分析。同时石蜡切片脱蜡至水，3% H202室温lOmin，消除内源性过氧化物酶活性，正常山羊血清工作液室温封闭，加入1:200稀释的兔抗HBeAg的抗体4°C过夜；PBS漂洗，滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，37°C孵育30min，PBS漂洗，DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明封片，光镜下观察HBeAg的表达。
[0087]结果:雌性6周龄的C57BL / 6小鼠，经高压水动力尾静脉注射5 μ g pCS-HBVl.3质粒后，肝脏均为明显的肝细胞损伤、淋巴细胞浸润、炎性反应；且均可检测到HBeAg的表达，HBeAg的表达，主要位于细胞核内，少量分布于细胞质中。结果参见图6。
[0088]实施例7
[0089]HBV小鼠模型在疫苗评价中的应用
[0090]实验动物SPF级雌性C57BL / 6小鼠，各6只，6周龄。
[0091]疫苗及佐剂CHO细胞表达CHO细胞表达的含S+PreSl融合抗原的颗粒疫苗HBSS1，为华北制药股份有限公司产品，用注射用生理盐水配制成lOOyg / ml ;氢氧化铝佐剂由华北制药集团提供，浓度为2mg / ml。聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C):购自美国SIGMA公司，用注射用生理盐水配制成2mg / ml ο
[0092]方法:小鼠经高 压尾静脉注射5 μ g pCS-HBVl.3质粒后，将阳性鼠随机分为3组，每组 6 只。分别为 Alum+Poly I:C、HBSS1+A1 (OH) 3、HBSS1+A1 (OH) 3+Poly I:C 免疫组；其中每剂中抗原含量皆为1.25ug，A1(0H)3含量为lmg/mL，Poly I:C含量为50 μ g，注射体积为0.lml ;肌肉注射，共免疫两次，间隔2周；每次免疫后2周经内眦静脉采血分离血清；末次免疫后2周将小鼠脱颈处死后无菌取脾，研磨分离获得脾细胞悬液，计数调整细胞浓度后立即用于ELISPOT检测。参见图9
[0093]用于HBsAg、HBeAg及HBsAb及的ELISA检测(使用上海科华公司的HBV ELISA检测试剂盒)；乙型肝炎病毒前S1抗体(抗S1)诊断试剂盒购自上海阿尔法生物技术有限公司。用HBV核酸定量试剂盒(PCR-荧光探针法)(国食药监械(准)字2011第340，湖南圣湘生物)按照使用说明书检测血清及肝组织HBV DNA。小鼠IFN-y细胞因子ELISPOT试剂购自BD公司。
[0094]按说明书操作，在包被抗用抗IFN-Y抗体后，每孔加入100ul含S或PreSl抗原多肽的脾细胞培养悬液，每孔脾细胞数为5 X 105个，37°C 5%C02静置培养18h ;弃去培养液后，分步加入检测抗体和显色液显色，Bioreader4000斑点分析仪计数斑点形成数(SFC)。根据斑点数的多少判断特异性杀伤T细胞的数量，该数量的多少与细胞免疫强度呈正相关。结果见图6。
[0095]结果:小鼠经高压尾静脉注射5μ g pCS-HBVl.3质粒后免疫，同对照组相比，HBSS1联合佐剂组在第二次免疫后均可诱导高水平的S和PreSl特异性的体液和细胞免疫应答，见图10 ;HBSS1联合Alum和PolyI:C佐剂免疫两次后血清HBsAg和HBeAg和对照组相比显著降低。并且血清HBV DNA完全清除，但肝组织DNA无明显变化，见图11。
【权利要求】
1.本发明所述的基于慢病毒转导质粒建立小鼠模型技术，其技术特征是将携带多拷贝HBV基因组的慢病毒转导质粒pCS-HBVl.3用于制作HBV小鼠模型。
2.依据权利要求1，该重组质粒骨架来自于慢病毒转导质粒pCS-CG，以HBV基因取代其多克隆位点的EGFP表达盒。
3.依据权利要求1，HBV基因组DNA的拷贝数为1.3个拷贝。
4.依据权利要求1，所述的慢病毒转导质粒PCS-HBV1.3是经尾静脉高压水动力注射的方法感染小鼠肝细胞而建立的HBV小鼠模型。
5.依据权利要求1，所述的HBV小鼠模型为HBV持续性感染模型。
6.依据权利要求1，所述的HBV小鼠模型为雌性4-6周龄C57BL/ 6小鼠。
【文档编号】A01K67/027GK103642839SQ201310581982
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】谭文杰, 揣侠, 王文, 陈红, 杨扬 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所