通过未受精胚珠培养雄性不育烟草单倍体的方法
【专利摘要】本发明提供一种通过未受精胚珠培养雄性不育烟草单倍体的方法。所述培养雄性不育烟草单倍体的方法是以未授粉的雄性不育烟草花蕾发育介于大孢子母细胞时期到二核期之间的胚珠为培养材料，经过消毒处理后在28℃光照培养室中，依次经过胚状体诱导培养、再生芽生根培养和再生植株的培养之后培养而成，在培养过程过每天在1500Lux光照条件下连续光照十个小时。采用本发明的方法培育雄性不育烟草，明显提高了烟草胚珠胚状体的诱导和植株再生的频率。
【专利说明】通过未受精胚珠培养雄性不育烟草单倍体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于烟草育种【技术领域】，具体涉及通过未受精胚珠培养获得雄性不育烟草杂交种单倍体的方法。
【背景技术】
[0002]单倍体是指具有配子染色体组成的孢子体。单倍体诱导技术作为现代高效育种体系的主要组成部分，具有如下显著优点:作物单倍体材料加倍后即为纯系(双单倍体)，优中选优后可快速纯合优良杂交组合的优异基因位点，从而使育种年限较常规方法缩短3~4年；其次，由于双单倍体植株的基因型和表现型完全一致，在筛选育种材料时能大大降低误选频率，明显提高选择效率，特别是在选择由隐性基因控制的优良性状时更是优势明显。此外，利用单倍体培养可以快速获得加倍单倍体(DH)群体，可为开展作物重要农艺性状分子标记的理想材料，而利用分子标记进行辅助选择是现代高效育种体系的主要组成部分(张正.2007.农作物单倍体育种研究概况与思考.山东农业科学，N0.5.122-125)。
[0003]烟草是世界上重要的经济作物。通常，可以通过体外培养烟草的花药或小孢子产生单倍体，即花药起源的单倍体。20世纪90年代，美国一些烟草科研机构，特别是北卡州立大学烟草遗传育种项目组做了大量研究，发现这类单倍体经加倍后往往产量和品质性状劣变严重，育种利用的价值有限，再加上这类单倍体的加倍频率很低，通常只有1%左右，目前这种方法在烟草育种中已很少使用(任学良，李继新，李明海.2007.美国烟草育种进展简况.中国烟草学报，N0.6.57-64)。而从烟草未授粉子房诱导单倍体植株具有明显的优点，如倍性和性状变异小，后代比较稳定，更接近于原始亲本等(潘莉，杨铁钊.2000.烟草未授粉子房胚状体诱导的研究.西北植物学报，N0.1.59— 63)。
[0004]国外学者Wernsm an等人早在1979年就开始了烟草未授粉子房培养工作，并成功获得了单倍体植株(Burk LG, Gerstel DU, Wernsman EA.1979.Maternal Haploids ofNicotiana tabacum L.from Seed.Science.，N0.2.585)。他们将烟草雌性单倍体和雄性单倍体加倍后的双单倍体与它们的来源亲本进行了比较，发现雌性双单倍体优于雄性双单倍体，雌性双单倍体与来源亲本更相似，不会造成产量和品质的劣变(Wernsman EA,Matzinger DF, Rebeca C Rufty.1989.Androgenetic vs.Gynogenetic Doubled Haploidsof Tobacc0.Crop Sci，N0.29.1151-1155)。目前，他们已经将这种技术成功应用于烟草育种中(任学良，李继新，李明海.2007.美国烟草育种进展简况.中国烟草学报，N0.6.57-64)。但这种方法不是直接利用子房或胚珠培养获得单倍体，而是借助野生烟草N.africana作为杂交父本，获得大量的高发芽力种子，杂交后代幼苗大多数在子叶阶段死亡，存活的幼苗是易于分辨的母体单倍体，利用这类单倍体的叶柄体外培养很容易实现单倍体的自然加倍，而且频率很高，通常达80%以上(任学良，李继新，李明海.2007.美国烟草育种进展简况.中国烟草学报，N0.6.57-64)。
[0005]国内学者祝仲纯、吴海珊等人对普通烟草品种copus yeusuheku N0.4进行了未授粉子房培养(祝仲纯，吴海珊.1979.从未授粉的小麦及烟草子房培养出单倍体植株.遗传学报，N0.2.181-183)，继之对普通烟草品种NC2326、大叶黄烟和不育烟草纯系品种MSNC2326进行了未授粉子房培养(祝仲纯，吴海珊.1981.从烟草单倍体植株未传粉子房又培养出单倍体植株.遗传学报，N0.1.63-65)，接着又对普通烟草品种革新五号进行了未授粉子房培养(祝仲纯，刘振岳，吴海珊等.1981.离体培养未传粉烟草子房的胚状体发育.植物学报，N0.6.499-501)，他们以子房为外植体，直接将子房接种于Hl培养基(附加生长素IAA0.5mg/L和细胞分裂素KT2mg/L)上培养，但仅见copus yeusuheku N0.4通过子房培养获得单倍体植株的报道。吴伯骥和郑国镏对普通烟草品种柳叶烟、金星烟、黄苗榆和黄花烟草品种甘肃黄花烟进行了未授粉子房培养，也是以子房作为外植体，直接将子房接种于H2培养基(附加生长素IAA0.5mg/L和细胞分裂素6_BA2mg/L)上培养，也获得了单倍体植株(吴伯骥，郑国镏.1982.从未授粉烟草子房诱导单倍体植株的细胞学和胚胎学研究.植物学报，N0.2.125-129)，但具体品种不详。而 申请人:采用与祝仲纯等人和吴伯骥等人相同的培养基、相同时期的子房、相同的接种方法对雄性不育烟草未授粉子房进行培养，并未观察到胚珠膨大、子房壁被推向上方，进而分化出再生植株的现象。其中，采用吴伯骥等人报道的附加生长素IAA0.5mg/L和细胞分裂素6_BA2mg/L的H2培养基，将子房直接接种，改为去除子房壁和剥取胚珠接种，胚珠并不直接形成胚状体，进而发育成苗，而是先形成愈伤组织，再由愈伤组织分化形成胚状体，最后长成植株,但单倍体植株频率较低，并增加了性状变异的风险。而且，祝仲纯等人和吴伯骥等人均以花粉发育时期作为子房培养时期的依据不适合于雄性器官退化的雄性不育烟草。祝仲纯等人采用N6培养基对大叶黄烟未传粉子房进行了培养(祝仲纯，吴海珊，安庆坤.1984.大叶黄烟未传粉子房培养及其细胞学研究.遗传学报，N0.4.281-287)，将花粉处于单核期的子房直接接种于N6培养基(附加生长素IAA0.5mg/L、细胞分裂素KT6mg/L、肌醇100mg/L和蔗糖8g/L)上培养，获得了再生植株，但频率很低，仅占4%;提高培养基中生长素的用量，能够诱导出旺盛的愈伤组织，然后分化出大量的苗，但产生了染色体数的多样畸变，单倍体植株频率低。 申请人:采用相同培养基，以胚珠为外植体对雄性不育烟草进行培养，结果是除大孢子母细胞时期子房内胚珠外其它外植体产生膨大胚珠的比率极小。潘莉等人采用Hl培养基对普通烟草品种NC89未传粉子房进行了培养(潘莉，刘宗才，喜进安.1998.外源激素对烟草未授粉子房培养的作用.河南农业大学学报，N0.2.16 7-170)，将子房作为外植体，直接接种于附加2，4-D和6-BA的Hl培养基上培养，结果表明，2，4-D能够诱导子房产生愈伤组织，然后分化成胚状体；6-BA浓度为8.89 μ mo I/L时，子房能够直接产生胚状体，进而形成小苗；6_BA浓度为2.22 μ mol/L和4.44 μ mol/L时，子房则先产生愈伤组织，再分化成胚状体,进而形成小苗,但单倍体的诱导率低，形成小植株所需的时间长。他们继之对普通烟草品种MC944、K326XC319、G80、Coker319、晋太6号、辽烟I号和不育纯系品种MS NC89未传粉子房进行了培养，并探讨了胚状体诱导的影响因素(潘莉，杨铁钊.2000.烟草未授粉子房胚状体诱导的研究.西北植物学报，N0.1.59-63)，但最终未见获得再生植株的报道。冉邦定对普通烟草(SpeightG-28XBurley21) Fl、(Speight G28XKy56)Fl和红花大金元品种进行了未授粉子房培养。选择花冠比花萼约长I厘米的花蕾里的胚珠接种于附加KT2mg/L、IAA0.5mg/L、活性碳IOg/L的B5和H两种基本培养基上，获得了再生植株，但未鉴定倍性，结果不明确，且再生植株诱导率极低。 申请人:采用相同培养基、相同发育时期的胚珠进行培养，甚至未见有明显膨大的胚珠。尽管前人涉及了雄性不育烟草未传粉子房的培养(祝仲纯，吴海珊.1981.从烟草单倍体植株未传粉子房又培养出单倍体植株.遗传学报，N0.1.63-65 ;潘莉，杨铁钊.2000.烟草未授粉子房胚状体诱导的研究.西北植物学报，N0.1.59-63)，但仅限于纯系品种，未见有雄性不育杂交种未传粉子房培养的报道，尤其是通过未受精胚珠培养获得雄性不育烟草单倍体植株的研究，至今未见公开报道。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种通过未受精胚珠培养获得雄性不育烟草杂交种单倍体植株的方法，采用该方法可以明显提高胚状体和植株的诱导频率。
[0007]本发明提供的技术方案:所述一种通过未受精胚珠培养雄性不育烟草单倍体的方法，其特征在于具体步骤如下:
[0008](1)制备培养基
[0009]采用Hl培养基或H2培养基作为基本培养基，然后加入生长素IAA、细胞分裂素KT(即激动素KT)、蔗糖和琼脂制备成胚状体诱导培养基，其中生长素IAA和细胞分裂素KT在胚状体诱导培养基中的终浓度分别是0.5mg/L和2mg/L ;所述蔗糖和琼脂在胚状体诱导培养基中的终浓度分别是2%和1% ；
[0010]采用Hl培养基作为基本培养基，然后加入蔗糖和琼脂制备成不含激素的固体状再生芽诱导培养基，其中，所述蔗糖和琼脂在再生芽诱导培养基中的终浓度是2%和1% ；
[0011]采用Hl培养基和N6培养基作为基本培养基，然后加入生长素IAA、蔗糖和琼脂制备成固体状再生芽生根培养基，其中生长素IAA在再生芽生根培养基中的终浓度是IOmg/L，蔗糖和琼脂在再生芽生根培养基中的终浓度分别是8%和0.8% ；
[0012](2)培养材料的采集，在雄性不育烟草开花期间，采胚珠发育介于大孢子母细胞时期到二核期之间的未授粉的雄性不育烟草花蕾；
[0013](3)消毒处理和接种，将步骤(2)中采集的雄性不育烟草花蕾放入浓度为0.1%的升汞水溶液中消毒7-9min，然后用无菌水冲洗3_4次，在无菌条件下将花蕾的基部切掉，挤出子房，并去除子房壁或直接剥离胚珠后，将胚珠放入步骤(1)中制备的胚状体诱导培养基中；
[0014](4)胚状体的诱导，将步骤(3)中接种有胚珠的胚状体诱导培养基置于28°C光照培养室中，每天在1500Lux光照下连续光照培养10小时，诱导胚珠产生胚状体；
[0015](5)再生芽的诱导，将步骤(4)中获得的胚状体在无菌条件下转移到步骤(1)中制备的再生芽诱导培养基上，继续置于28°C光照培养室中，每天在1500LUX光照下连续光照培养10小时，培养2-3周，诱导胚状体产生再生芽；
[0016](6)再生植株的培养，将步骤(5)中获得的再生芽在无菌条件下转移到再生芽生根培养基上，继续置于28°C光照培养室中，每天在1500Lux光照下连续光照培养10小时，培养2-3周，使其生根形成小植株，之后，对萌发根的再生植株转移到新配制的再生芽生根培养基上在同样的条件下继续培养，形成雄性不育烟草单倍体再生植株。
[0017]在步骤(6)中培养的雄性不育烟草单倍体再生植株长至2_3cm高或有3_4片叶片时，取所得再生植株的叶片样品通过流式细胞仪分析进行倍性确定。通过流式细胞仪分析倍性是以正常的子房供体植株DNA含量作为对照标准，调节到40channelS，每个曲线峰至少分析10000个细胞，并重复4次。所述叶片样品的制备方法:取按照上述方法培育的再生植株1.3-1.6cm2幼叶，在0.5ml的细胞裂解液中(Tris-Hcl buffer, ph=7.2)用刀片切碎，把样品和溶液混合物通过孔径30 μ m微孔膜过滤到测试管里，加20ul DAPI染色液[137mM NaCl, 2.7mM KC1,4.3mM Na2HP04,1.47mM KH2P04,0.4μ g propidium iodide (PI)(sigma) ,0.l%tritonX-100, and4 μ g RNAse A]染色 15min 后，将样品上样于流式细胞仪。
[0018]步骤2中采集的花蕾外观表现时期介于花冠即将露出花萼时期至花冠比花萼长一倍而花药未散粉时期之间阶段的花蕾。
[0019]本发明步骤(1)中所述Hl培养基、H2培养基和N6培养基均是以水为溶剂，并按照每升水加入以下配方物质配制而成，每种培养基的具体物质配方如表1所示。
[0020]表1Hl培养液、H2培养液和N6培养液配方
[0021]
【权利要求】
1.一种通过未受精胚珠培养雄性不育烟草单倍体的方法，其特征在于具体步骤如下: (1)制备培养基 采用Hl培养基或H2培养基作为基本培养基，然后加入生长素IAA、细胞分裂素KT、蔗糖和琼脂制备成胚状体诱导培养基，其中生长素IAA和细胞分裂素KT在胚状体诱导培养基中的终浓度分别是0.5mg/L和2mg/L ;所述蔗糖和琼脂在胚状体诱导培养基中的终浓度分别是2%和1% ； 采用Hl培养基作为基本培养基，然后加入蔗糖和琼脂制备成不含激素的固体状再生芽诱导培养基，其中，所述蔗糖和琼脂在再生芽诱导培养基中的终浓度是2%和1% ； 采用Hl培养基和N6培养基作为基本培养基，然后加入生长素IAA、蔗糖和琼脂制备成固体状再生芽生根培养基，其中生长素IAA在再生芽生根培养基中的终浓度是10mg/L，蔗糖和琼脂在再生芽生根培养基中的终浓度分别是8%和0.8% ； (2)培养材料的采集，在雄性不育烟草开花期间，采胚珠发育介于大孢子母细胞时期到二核期之间的未授粉的雄性不育烟草花蕾； (3)消毒处理和接种，将步骤(2)中采集的雄性不育烟草花蕾放入浓度为0.1%的升汞水溶液中消毒7-9min，然后用无菌水冲洗3_4次，在无菌条件下将花蕾的基部切掉，挤出子房，并去除子房壁或直接剥离胚珠后，将胚珠放入步骤(1)中制备的胚状体诱导培养基中； (4)胚状体的诱导，将步骤(3)中接种有胚珠的胚状体诱导培养基置于28°C光照培养室中，每天在1500LUX光照下连续光照培养10小时，诱导胚珠产生胚状体； (5)再生芽的诱导，将步骤(4)中获得的胚状体在无菌条件下转移到步骤(1)中制备的再生芽诱导培养基上，继续置于28°C光照培养室中，每天在1500Lux光照下连续光照培养10小时，培养2-3周，诱导胚状体产生再生芽； (6)再生植株的培养，将步骤(5)中获得的再生芽在无菌条件下转移到再生芽生根培养基上，继续置于28°C光照培养室中，每天在1500Lux光照下连续光照培养10小时，培养2_3周，使其生根形成小植株，之后，对萌发根的再生植株转移到新配制的再生芽生根培养基上在同样的条件下继续培养，形成雄性不育烟草单倍体再生植株。
2.根据权利要求1所述的一种通过未受精胚珠培养雄性不育烟草单倍体的方法，其特征在于该方法还包括以下步骤:在步骤(6)中培养的雄性不育烟草单倍体再生植株长至2-3cm高或有3-4片叶片时，取所得再生植株的叶片样品通过流式细胞仪分析进行倍性确定。
3.根据权利要求1所述的一种通过未受精胚珠培养雄性不育烟草单倍体的方法，其特征在于:步骤2中采集的花蕾外观表现时期介于花冠即将露出花萼时期至花冠比花萼长一倍而花药未散粉时期之间阶段的花蕾。
4.根据权利要求1所述的一种通过未受精胚珠培养雄性不育烟草单倍体的方法，其特征在于:步骤(7)中通过流式细胞仪分析倍性是以正常的子房供体植株DNA含量作为对照标准，调节到40channels,每个曲线峰至少分析10000个细胞,并重复4次。
5.根据权利要求2所述的一种通过未受精胚珠培养雄性不育烟草单倍体的方法，其特征在于:所述通过流式细胞仪进行倍性分析的叶片样品是采取再生植株1.3cm2-l.6cm2幼叶，在0.5ml的细胞裂解液用刀片切碎，把样品和溶液混合物通过孔径30 μ m微孔膜过滤到测试管里，加20ul DAPI染色液染色15min后，将样品上样于流式细胞仪。
【文档编号】A01H4/00GK103718957SQ201310680014
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】曹景林, 程君奇, 蔡长春, 黎根, 李亚培, 吴成林 申请人:湖北省烟草科研所