一种富集培养滑刃属食真菌线虫的方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，具体为一种富集培养滑刃属食真菌线虫的方法。具体包括：（1）滑刃属食真菌线虫的分离；（2）滑刃属食真菌线虫的鉴定；（3）滑刃属食真菌线虫的表面消毒；（4）滑刃属食真菌线虫的富集培养。本发明的方法简单易行，滑刃属食真菌线虫繁殖成活率高，线虫个体质量好，遗传性变化小，管理方便，可以有效获得大量纯培养的滑刃属食真菌线虫，为研究滑刃属食真菌线虫在整个土壤食物链的关键作用及其与真菌的相互作用对植物生长的影响提供技术支持。
【专利说明】一种富集培养滑刃属食真菌线虫的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种土壤滑刃属食真菌线虫的富集培养方法。
【背景技术】
[0002]土壤中栖居的线虫以自由生活线虫占绝对优势，而土壤自由生活线虫又以食细菌线虫和食真菌线虫为主(两者统称为食微线虫),约占自由生活线虫的80%。很多研究表明，食微线虫通过捕食土壤微生物，加速微生物繁殖，并通过代谢分泌和释放微生物所固持的养分，进而影响土壤生态过程和植物生长。但这种作用会因不同的线虫、微生物和植物的种类以及土壤基质的C/N营养状况而异。目前，关于土壤食真菌线虫与真菌的相互作用及其对植物生长的报道较少，尤其是污染土壤中的相关研究更是罕见报导。该类研究可以深入研究土壤食真菌线虫的取食习性及其取食行为在土壤食物链和整个土壤养分循环中的重要地位，而纯培养的土壤食真菌线虫是研究的基础。诸多研究表明滑刃属食真菌线虫(.Aphelenchoidessp.)对土壤污染具有较强的耐性,广泛存在于各类污染土壤中,对其深入研究具有重大的意义。但是，目前鲜有关于土壤食真菌线虫尤其是滑刃属食真菌线虫的富集培养方法。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种富集培养滑刃属食真菌线虫iAphelenchoides%.)的方法，该方法简单易用， 滑刃属食真菌线虫的繁殖率高，可为高效制备大量纯培养的滑刃属食真菌线虫提供技术保障。
[0004]本发明提供的一种富集培养滑刃属食真菌线虫的方法，具体步骤如下:
1、滑刃属食真菌线虫)的分离:从野外采集新鲜土壤。采用改进的浅盘法从土壤中分离线虫。
[0005]2、滑刃属食真菌线虫)的鉴定:将烧杯中液体转入培养皿，然后根据滑刃属食真菌线虫的特征在解剖镜下用毛细管挑出该属线虫，再将其在光学显微镜下进行活体鉴定。
[0006]3、滑刃属食真菌线虫)的表面消毒:将线虫转入灭菌的离心管中，用硫酸链霉素和放线菌酮混合液对线虫进行表面消毒；
4、滑刃属食真菌线虫)的富集培养:将真菌灰葡萄孢cinerea Pers.)接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，采用封口膜(Parafilm)将培养皿封口，以防止培养基水分蒸发与污染。然后将培养皿倒置放于恒温培养箱，20-25°C黑暗培养，一周后，待灰葡萄孢大量繁殖时即将滑刃属线虫接入长满均匀一致灰葡萄孢的培养皿中。采用封口膜(Parafilm)将培养皿封口，培养皿正面朝上放入大小合适的灭菌整理箱内，20-25°C黑暗培养，定期观察培养皿是否受到其他真菌或者螨虫的污染，几个星期后，灰孢基本消失，线虫大量繁殖。重复以上步骤可获得大量的滑刃属食真菌线虫。其中，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配方为:每1000 ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，土豆190-220 g，葡萄糖18-20 g，琼脂15-20 g，其余为水，pH值自然。
[0007]上述步骤(1)所述的改进的浅盘法所需设备简单，操作易行，具体如下:将10目的不锈钢筛盘放入配套的浅盘中，在筛盘上放置两层面巾纸，然后把土样均匀铺在纸上，往浅盘中加水直至浸没土壤。再置于25°C温度、黑暗条件下分离。48 h后，用400目筛收集线虫于烧杯中。静置过夜后，用真空泵缓慢吸取上层液体，尽量避免扰动下层液体。此时，下层液体聚集了大量的线虫。
[0008]上述步骤(2)中滑刃属食真菌线虫的主要鉴定特征如下:①热杀死后，雌虫虫体直到腹弯，雄虫通常尾部向腹部弯成钩状整个虫体呈“ J”形(如果活体无法鉴定，可将其杀死后确定，为活体鉴定提供参考)，活体线虫多呈“S”形；②头部通常略缢缩，头架骨软化，口针较细，基部膨大，长度通常为10-12 Mm，一般不超过20 Mm ;③食道前体部圆柱形，中食道球发达、卵圆形或者方圆形，中食道球瓣发达，后食道腺叶发达、覆盖肠的背面；④排泄孔位于中食道球后水平处；⑤雌虫尾呈圆锥形，尾端形态多样:钝圆或细圆，指状或分叉或有一腹突，有或无尾尖突，尾尖突的形态多样；⑥雄虫尾呈圆锥形、向腹面弯成钩状；交合刺呈玫瑰刺形，基顶和基喙通常发达，无交合伞。
[0009]上述步骤(3)中，所述混合液中，硫酸链霉素的质量-体积浓度为0.80-1.20g.L-1 ;放线菌酮的质量体积浓度为0.015-0.02 g.L-1 ;对线虫进行表面消毒的时间为15-20min。
[0010]本发明中，步骤(4)中的经灭菌的培养基是将培养基在高压灭菌锅中，121°C温度下灭菌30 min得到。其富集培养后得到的滑刃属食真菌线虫的保存方法如下:采用封口膜(Parafilm)将培养皿封口，然后将培养皿保存在4°C冰箱内备用。每隔5_6个月，对滑刃属食真菌线虫进行继代培养，时间过长则培养基水分蒸发以及食物资源的匮乏，线虫会死亡，时间过短则是财力和劳力的浪费。其具体操作过程为，将培养皿从4°C冰箱取出，挑出一小块长有线虫的培养基，放入长满均匀一致灰葡萄孢的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，将培养皿封口后放入大小合适的灭菌整理箱内，20-25°C黑暗培养，并定期观察培养皿是否受到其他真菌或者螨虫的污染，三周后将培养皿至于4°C冰箱内保存。
[0011]本发明的有益效果在于:其方法简单易行，滑刃属食真菌线虫繁殖成活率高，线虫个体质量好，遗传性变化小，管理方便，可以有效获得大量纯培养的滑刃属食真菌线虫，为研究土壤中食真菌线虫的取食行为以及整个土壤食物链提供技术支持。此外，滑刃属食真菌线虫在污染土壤中占有优势，可利用其对真菌菌丝的取食行为，加速污染土壤中固执在菌丝或孢子内养分的矿化释放，从而在农业生产上可以促进污染土壤中植物的生长，在污染土壤的修复方面则可以提高植物修复效率。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
[0013]实施例1
1、滑刃属食真菌线虫的分离:从江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)苗圃地采集新鲜土壤。采用改进的浅盘法从土壤中分离线虫。具体方法描述如下。
[0014]将10目的不锈钢筛盘放入配套的浅盘中，并在筛盘上放置两层面巾纸，然后把土样均匀铺撒在纸上，往浅盘中加水直至浸没土壤。将整个装置放于培养箱中，在20~25°C温度、黑暗条件下分离。由于线虫的趋水性，再加上其自身重力的作用，线虫陆续脱离土壤穿过面巾纸孔隙进入水中(适用于分离土样中的活跃线虫)。48-60 h后，将筛盘取出，将浅盘中的液体倒入400目筛盘，不断用水冲洗筛盘后收集线虫于烧杯中。烧杯静置过夜后，用真空泵缓慢吸取上层液体，并尽量避免扰动下层液体。此时，下层液体聚集了大量的线虫。
[0015]2、滑刃属食真菌线虫的鉴定
目前鲜有食真菌线虫，尤其是滑刃属食真菌线虫纯培养的报道，难点之一也在于线虫的鉴定，特别是富集培养过程中，需要将线虫活体鉴定；鉴定方法具体如下:将烧杯中液体转入直径5 cm的培养皿。静置5 min后，根据滑刃属线虫的形态学特征在解剖镜下用毛细管挑出该属线虫，然后将其在奥林巴斯光学显微镜下活体鉴定。
[0016]鉴定滑刃属食真菌线虫时依据的主要鉴定特征如下:①热杀死后,雌虫虫体直到腹弯，雄虫通常尾部向腹部弯成钩状整个虫体呈“J”形，活体线虫多呈“S”形；(如果活体无法鉴定，可将其杀死后确定，为活体鉴定提供参考)，②头部通常略缢缩，头架骨软化，口针较细，基部膨大，长度通常为10-12 Mm，一般不超过20 Mm ;③食道前体部圆柱形，中食道球发达、卵圆形或者方圆形，中食道球瓣发达，后食道腺叶发达、覆盖肠的背面；④排泄孔位于中食道球后水平处；⑤雌虫尾呈圆锥形，尾端形态多样:钝圆或细圆，指状或分叉或有一腹突，有或无尾尖突，尾尖突的形态多样；⑥雄虫尾呈圆锥形、向腹面弯成钩状；交合刺呈玫瑰刺形，基顶和基喙通常发达，无交合伞。
[0017]3、滑刃属食真菌线虫的表面消毒:将线虫转入灭菌的50 ml离心管中，用质量-体积浓度为1.0 g L—1的硫酸链霉素和质量-体积浓度为0.02 g L—1的放线菌酮混合液对线虫进行表面消毒20 min, 5000 r mirT1离心5 min,除去上清液,再用无菌水反复清洗6次。每次清洗时充分震荡，5000 r mirT1离心5 min,弃去上清液。
[0018]4、滑刃属食真菌线虫的富集培养:食真菌线虫在土壤中主要以取食真菌为生，因而在纯培养过程中需要给其提 供合适的食物来源。真菌种类不正确，则滑刃属食真菌线虫不愿取食，线虫大量死亡；培养基类型和配方不正确，则真菌繁殖欠佳导致滑刃属食真菌线虫不能正常生长繁殖；培养温度、光照等条件不正确，则真菌颜色发黄、生长缓慢、易衰老，线虫不易取食；线虫接种到培养基上的时机不正确，则影响线虫食物来源的数量与质量；发明人对真菌的种类，培养基的类型和配方以及培养条件等进行了一系列的摸索。确定方法如下。
[0019]采用常规方法制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其培养基配方为:每1000 ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，土豆220 g,葡萄糖18 g,琼脂18 g,其余为水，pH值自然。培养基配好后，在高压灭菌锅中121°C灭菌30 min。待培养基冷却后，将其倒入直径为9 cm的培养皿,厚度为0.7- 1.0 cm ο将真菌灰葡萄孢cinerea Pers.)接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，采用封口膜(Parafilm)将培养皿封口，以防止培养基水分蒸发与污染，然后将培养皿倒置放于恒温培养箱，20-25°C黑暗培养，一周后，真菌大量繁殖。此时，将滑刃属线虫接入长满均匀一致灰葡萄孢的培养皿中，接种方法为，用吸管接种50-100 μ?无菌水于培养基表面，无菌水中包含有200条左右经表面消毒的食真菌线虫。将培养皿采用封口膜(Parafilm)封口，以防止培养基水分蒸发与污染。以上过程均在无菌操作台上进行。最后，将培养皿正面朝上放入合适大小的灭菌整理箱，然后置于培养箱，20-25°C黑暗培养，三个星期后，灰葡萄孢基本消失，线虫大量繁殖。每个培养皿滑刃属食真菌线虫数量约为12000条，繁殖率约为60倍，个体长约0.75 mm，体长/最大体宽约为35.6，口针长约为11.2 μιη0
[0020]挑出一小块长有线虫的培养基，放入长满均匀一致灰葡萄孢的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将滑刃属食真菌线虫进行扩繁，如此重复获得大量纯培养的滑刃属食真菌线虫。
[0021]实施例中，滑刃属食真菌线虫的富集培养时，还采用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方包括:每1000 ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，土豆190 g，葡萄糖19 g，琼脂19 g，其余为水，pH值自然。通过上述配方也获得滑刃属食真菌线虫；此配方下，每个培养皿线虫数量约为11000条，繁殖率约为55倍，个体长约0.68 mm，体长/最大体宽约为36.2，口针长约为 11.0 Mm。
[0022]另外还采用如下配方:每1000 ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，其余为水，pH值自然。通过上述配方也获得滑刃属食真菌线虫，此配方下，每个培养皿线虫数量约为12500条，繁殖率约为62.5倍，个体长约0.70 mm,体长/最大体宽约35.2，口针长约10.8 Mm。
[0023]上述配方条件下均获得了大量纯培养的滑刃属食真菌线虫。
[0024]5、滑刃属食真菌线虫的继代保存:线虫的繁殖速度较快，每2周产生一代，在此过程中消耗大量的真菌菌丝与孢子，此外培养基的养分与水分也有一定的期限，因而线虫的保存时间也是一个难点。本发明所涉及的保存方法如下。采用封口膜(Parafilm)将培养皿封口，然后将培养皿正面朝上保存在4°C冰箱内备用。每隔5-6个月，对滑刃属食真菌线虫进行继代培养，具体操作过程为，将培养皿从4°C冰箱取出，挑出一小块长有线虫的培养基，放入长满均匀一致灰葡萄孢 的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，将培养皿封口后正面朝上放入大小合适的灭菌整理箱内，25°C黑暗培养，并定期观察培养皿是否受到其他真菌或者螨虫的污染，三周后将培养皿至于4°C冰箱内保存。
[0025]6、滑刃属食真菌线虫的应用:将培养皿从4°C冰箱取出，用消毒的牛角勺将培养皿内培养基刮出，放入筛盘内，依次进行线虫的分离和表面消毒步骤获得大量纯培养的滑刃属食真菌线虫。
[0026]将滑刃属食真菌线虫与丛枝菌根真菌同时接种入砷污染土壤，研究滑刃属食真菌线虫与丛枝菌根真菌的相互作用以及对烟草生长的影响。
[0027]结果表明，双接种后，滑刃属食真菌线虫数量增加了 1110%，丛枝菌根真菌的菌丝量提高了 25%，菌根侵染率也有一定数量的提高；与不接种滑刃属食真菌线虫与丛枝菌根真菌的处理对照相比，滑刃属食真菌线虫与丛枝菌根真菌的相互作用显著提高砷污染土壤中烟草的生物量(地下部分干重提高了 40%，地上部分干重提高了 66%)以及体内的砷累积量(地上部分砷累积量提高了 16%)。说明滑刃属食真菌线虫在As污染土壤中有优势，促进污染土壤中植物的生长，将其应用于在污染土壤的修复方面时，则可以提高植物修复效率。
【权利要求】
1.一种富集培养滑刃属食真菌线虫的方法，其特征在于，具体步骤如下:(1)滑刃属食真菌线虫的分离:从野外采集新鲜土壤，采用改进的浅盘法从土壤中分离线虫；(2)滑刃属食真菌线虫的鉴定:根据滑刃属食真菌线虫的特征，在解剖镜下用毛细管挑出该属线虫，再将其在光学显微镜下进行活体鉴定；(3)滑刃属食真菌线虫的表面消毒:将线虫转入灭菌的离心管中，用硫酸链霉素和放线菌酮混合液对线虫进行表面消毒；(4)滑刃属食真菌线虫的富集培养:将真菌灰葡萄孢cinereaPers.)接种到经灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，采用封口膜将培养皿封口，然后将培养皿倒置放于恒温培养箱内，20-25°C黑暗培养；一周后，待真菌大量繁殖时即将滑刃属线虫接入长满均匀一致灰葡萄孢的培养皿中；培养皿用封口膜封口后，置于灭菌整理箱内，20-25 V黑暗培养，定期观察，直至灰孢基本消失，线虫大量繁殖；重复以上步骤获得大量的滑刃属食真菌线虫；其中，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配方为:每1000 ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，土豆190-220 g，葡萄糖18-20 g，琼脂15-20 g，其余为水，pH值自然。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)中所述改进的浅盘法具体如下:将10目的不锈钢筛盘放入配套的浅盘中，在筛盘上放置两层面巾纸，然后把土样均匀铺在纸上，往浅盘中加水直至浸没土壤；再置于20-25°C温度、黑暗条件下分离；48-60 h后，用400目筛收集线虫于烧杯中；静置过夜后，用真空泵缓慢吸取上层液体，并尽量避免扰动下层液体，此时，下层液体收集到线虫。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，所述混合液中，硫酸链霉素的质量-体积浓度为0.80-1.20 g.L—1 ;放线菌酮的质量-体积浓度为0.015-0.02 g.L—1 ;对线虫进行表面消毒的时间为15-20 min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中鉴定滑刃属食真菌线虫，其依据的鉴定特征如下:①热杀死后，雌虫虫体直到腹弯，雄虫通常尾部向腹部弯成钩状整个虫体呈“J”形，活体线虫多呈“S”形；②头部通常略缢缩，头架骨软化，口针较细，基部膨大，长度通常为10-12 Mm，一般不超过20 Mm ;③食道前体部圆柱形，中食道球发达、卵圆形或者方圆形，中食道球瓣发达，后食道腺叶发达、覆盖肠的背面；④排泄孔位于中食道球后水平处；⑤雌虫尾呈圆锥形，尾端形态多样:钝圆或细圆，指状或分叉或有一腹突，有或无尾尖突，尾尖突的形态多样；⑥雄虫尾呈圆锥形、向腹面弯成钩状；交合刺呈玫瑰刺形，基顶和基喙通常发达，无交合伞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的经灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基是将培养基在高压灭菌锅中，121 °C温度下，灭菌30 min得到的。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)富集培养后得到的滑刃属食真菌线虫的保存方法如下:将其置于培养皿中，封口后正面朝上置于4°C冰箱内保存；每隔5-6个月，将滑刃属食真菌线虫继代培养；具体操作过程为，将培养皿从4°C冰箱取出，挑出一小块长有线虫的培养基，放入长满均匀一致灰葡萄孢的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，将培养皿封口后放入灭菌整理箱内，20-25°C黑暗培养，并定期观察，三周后将培养皿至于4°C冰箱内保存。
【文档编号】A01K67/033GK103688908SQ201310696738
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】华建峰, 殷云龙 申请人:江苏省中国科学院植物研究所