一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法。本发明提供了包括蔗糖和缓冲液的蝙蝠蛾卵筛选液，通过蔗糖的对不同发育程度的蝙蝠蛾卵的分层作用，缓冲液在有效调节pH值的同时还能够利用盐浓度提高蝙蝠蛾的孵化率。利用本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液及筛选方法能够利用廉价易得的材料与简单方便方法对的蝙蝠蛾卵的发育程度进行快速优劣检测，并且在不破坏实验用卵的同时优化蝙蝠蛾卵，使筛选后的有用卵增加其孵化率和孵化后蝙蝠蛾的存活率。
【专利说明】一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法
[0001]本申请要求于2012年12月19日提交中国专利局、申请号为201210554851.1、发明名称为“一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
【技术领域】
[0002]本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法。
【背景技术】
[0003]冬虫夏草是中国的一种名贵中药材，与人参、鹿茸一起列为中国三大补药。早在一七五七年《本草从新》中就有“冬虫夏草甘平保肺，益肾，补精髓，止血化痰，已劳咳，治膈症皆良”的记载。中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。
[0004]冬虫夏草是一种特殊的虫和真菌共生的生物体，是冬虫夏草真菌(中国被毛孢)的菌丝体通过各种方式感染蝙蝠蛾(鳞翅目蝙蝠蛾科蝙蝠蛾属昆虫)的幼虫，以其体内的有机物质作为营养能量来源进行寄生生活，经过不断生长发育和分化后，最终菌丝体扭结并形成子座伸出寄主外壳，从而形成的一种特殊的虫菌共生的生物体。
[0005]冬虫夏草主产于我国西藏、青海、云南、四川和甘肃等省区海拔3500~5200m局部高寒山区草甸地带，天然资源十分有限，近年来采挖过渡造成生态环境的恶化，天然资源日趋枯竭。因此，人工栽培冬虫夏草势在必行。
[0006]人工栽培冬虫夏草，通过冬虫夏草菌(中国被毛孢)侵染寄主昆虫(蝙蝠蛾幼虫)，进入到寄主的体腔内，并在体腔中繁殖生长，最后产生子座，形成冬虫夏草药材。其中，寄主昆虫为蝙fe蛾，鳞翅目(Lepidoptera)蝙fe蛾科(Hepialidae)近300种昆虫的统称,全球分布。包括几种最大的蛾类，翅展超过22.5公分(9吋)，飞行很快，但无一定方向。幼虫钻入茎内，或生活在地下吃草根。
[0007]目前进行人工培植冬虫夏草需要进行大规模的寄主昆虫饲养，在用卵前需要较为快速准确的了解不同批次卵的受精与发育情况，以便确定工艺处理所用的卵量，也对用卵前的工艺环节的质量监控增加一个评判确定指标和方法，为准备生产线各阶段的生产材料提供较准确的参考。但是目前尚无将蝙蝠蛾卵依据发育状况进行有效分类的报道。
【发明内容】
[0008]有鉴于此，本发明提供一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法。利用本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液及筛选方法能够利用廉价易得的材料与简单方便方法对的蝙蝠蛾卵的发育程度进行快速优劣检测，并且在不破坏实验用卵的同时优化蝙蝠蛾卵，使筛选后的有用卵增加其孵化率和孵化后蝙蝠蛾的存活率。[0009]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0010]本发明提供了一种蝙蝠蛾卵筛选液，其包括蔗糖和缓冲液。
[0011]研究发现，盐水不能完全将蝙蝠蛾卵进行有效分层，并且持续加大盐水浓度，会对蝙蝠蛾卵造成一定程度的损伤，不仅孵化率会降低而且孵化后蝙蝠蛾存活率也会下降。本发明通过提供包括蔗糖和缓冲液的蝙蝠蛾卵筛选液，通过蔗糖的对不同发育程度的蝙蝠蛾卵的分层作用，缓冲液在有效调节PH值的同时还能够利用盐浓度提高蝙蝠蛾的孵化率。利用本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液能够利用廉价易得的材料与简单方便方法对的蝙蝠蛾卵的发育程度进行快速优劣检测，并且在不破坏实验用卵的同时优化蝙蝠蛾卵，使筛选后的有用卵增加其孵化率和孵化后蝙蝠蛾的存活率。
[0012]作为优选，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选液的pH值为6~7。
[0013]作为优选，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为12.5~15.5%。
[0014]优选地，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选液中，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为13~15%。
[0015]作为优选，缓冲液的盐浓度为0.04~0.16mol/L。
[0016]作为优选，缓冲液为弱酸性缓冲液或中性缓冲液。
[0017]优选地，中性缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
[0018]作为优选，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.2~1.0mmol/L的牛磺酸。
[0019]优选地，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.4~0.8mmol/L的牛磺酸。
[0020]本发明还提供了一种蝙蝠蛾卵的筛选方法，取蝙蝠蛾卵浸没于蝙蝠蛾卵筛选液中，静置，根据蝙蝠蛾卵在蝙蝠蛾卵筛选液中的位置获得蝙蝠蛾卵的发育程度，浮于蝙蝠蛾卵筛选液表面的蝙蝠蛾卵为未发育卵，下沉的蝙蝠蛾卵为发育卵；其中，蝙蝠蛾卵筛选液包括蔗糖和缓冲液。
[0021]作为优选，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液的pH值为6~7。
[0022]作为优选，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液中蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为12.5~15.5%。
[0023]优选地，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为13~15%。
[0024]作为优选，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液中缓冲液的盐浓度为 0.04 ~0.16mol/L。
[0025]作为优选，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液中缓冲液为弱酸性缓冲液或中性缓冲液。
[0026]优选地，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，中性缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
[0027]作为优选，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.2~
1.0mmol/L的牛磺酸。
`[0028]优选地，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.4~
0.8mmol/L的牛磺酸。
[0029]优选地，本发明使用此筛选液的时间为在一定的工业条件下蝙蝠蛾虫卵孵化前的4-10 天。
[0030]本发明提供了包括蔗糖和缓冲液的蝙蝠蛾卵筛选液，通过蔗糖的对不同发育程度的蝙蝠蛾卵的分层作用，缓冲液在有效调节PH值的同时还能够利用盐浓度提高蝙蝠蛾的孵化率。利用本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液及筛选方法能够利用廉价易得的材料与简单方便方法对的蝙蝠蛾卵的发育程度进行快速优劣检测，并且在不破坏实验用卵的同时优化蝙蝠蛾卵，使筛选后的有用卵增加其孵化率和孵化后蝙蝠蛾的存活率。
【具体实施方式】
[0031]本发明公开了一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0032]本发明提供了一种蝙蝠蛾卵筛选液，其包括蔗糖和缓冲液。
[0033]试验发现pH值虽然对蝙蝠蛾卵的筛选影响不显著，但是能够影响蝙蝠蛾卵的孵化率、孵化速度及蝙蝠蛾幼虫的健康状况。PH值为5.5,7.5时，孵化率都较高，也加快了孵化速度，但后期成活率中虫子却相对较弱，可见过酸过碱在一定程度上薄弱了卵壳，刺激了胚胎，导致加速孵化，但是如果一定程度的损害卵壳、过度腐蚀刺激后，则对后期幼虫健康有不利的影响。在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选液的PH值为6~7，在此条件下的蝙蝠 蛾卵孵化率较高，而且后期成活率也没有受到影响。
[0034]水不能把有胚胎与无胚胎的蝙蝠蛾卵分层，并且处理的卵孵化比较分散；仅用浓度较低的蔗糖分层效果不佳，需要增加蔗糖浓度，且浓度较低的蔗糖溶液处理卵比对照孵化率略低，也影响了幼虫后期成活率。浓度较高的氯化钠的处理分层效果尚可，但是严重影响孵化率以及后期成活率；而本发明提供的一种适当浓度的蔗糖磷酸盐缓冲液，将卵分层更精确，偏差较小，而且可能是磷酸盐缓冲液中的各种离子成分为蝙蝠蛾卵提供了营养护理，使处理后的蝙蝠蛾幼虫健康度提高。因此本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液不但可以较迅速较准确的将发育与未发育的卵分层，使的很快的了解卵的发育状况，预测孵化率，并且还可以促使卵孵化整齐，而且与对照相比，处理过的蝙蝠蛾健康度会提高，便于工业化筛选。在本发明的一些实施例中，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为12.5~15.5%。优选地，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为13~15%。
[0035]缓冲液的盐浓度对蝙蝠蛾卵及幼虫的成活率均有影响。随着缓冲液的盐浓度的升高，成活率下降。因此，在本发明的一些实施例中，缓冲液的盐浓度为0.04~0.16mol/L。缓冲液能够提供合适的缓冲能力，并使得溶液的pH值与卵内的pH相当，在本发明的一些实施例中，缓冲液为弱酸性缓冲液或中性缓冲液。优选地，中性缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。更优选地为磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液的优点为:①容易配制成各种浓度的缓冲液！②适用的PH范围宽pH受温度的影响小；@缓冲液稀释后pH变化小。
[0036]在本发明的另一些实施例中，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.2~1.0mmol/L的牛磺酸。优选地，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.4~0.8mmol/L的牛磺酸。
[0037]本发明还提供了一种蝙蝠蛾卵的筛选方法，取蝙蝠蛾卵浸没于蝙蝠蛾卵筛选液中，静置，根据蝙蝠蛾卵在蝙蝠蛾卵筛选液中的位置获得蝙蝠蛾卵的发育程度，浮于蝙蝠蛾卵筛选液表面的蝙蝠蛾卵为未发育卵，下沉的蝙蝠蛾卵为发育卵；其中，蝙蝠蛾卵筛选液包括蔗糖和缓冲液。
[0038]试验发现pH值虽然对蝙蝠蛾卵的筛选影响不显著，但是能够影响蝙蝠蛾卵的孵化率、孵化速度及蝙蝠蛾幼虫的健康状况。PH值为5.5,7.5时，孵化率都较高，也加快了孵化速度，但后期成活率中虫子却相对较弱，可见过酸过碱在一定程度上薄弱了卵壳，刺激了胚胎，导致加速孵化，但是如果一定程度的损害卵壳、过度腐蚀刺激，则对后期幼虫健康有不利的影响。在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，筛选液的PH值为6~7，在此条件下的蝙蝠蛾卵孵化率较高，而且后期成活率也没有受到影响。
[0039]水不能把有胚胎与无胚胎的蝙蝠蛾卵分层，并且处理的卵孵化比较分散；仅用浓度较低的蔗糖分层效果不佳，需要增加蔗糖浓度，且浓度较低的蔗糖溶液处理卵比对照孵化率略低，也影响了幼虫后期成活率。浓度较高的氯化钠的处理分层效果尚可，但是严重影响孵化率以及后期成活率；而本发明提供的一种适当浓度的蔗糖磷酸盐缓冲液，将卵分层更精确，偏差较小，而且可能是磷酸盐缓冲液中的各种离子成分为蝙蝠蛾卵提供了营养护理，使处理后的蝙蝠蛾幼虫健康度提高。因此本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液不但可以较迅速较准确的将发育与未发育的卵分层，使的很快的了解卵的发育状况，预测孵化率，并且还可以促使卵孵化整齐，而且与对照相比，处理过的蝙蝠蛾健康度会提高，便于工业化筛选。在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为12.5~15.5%。优选地，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为13~15%。
[0040]缓冲液的盐浓度对蝙蝠蛾卵及幼虫的成活率均有影响。随着缓冲液的盐浓度的升高，成活率下降。因此，在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，缓冲液的盐浓度为0.04~0.16mol`/L。
[0041 ] 缓冲液能够提供合适的缓冲能力，并使得溶液的pH值与卵内的pH相当，在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，缓冲液为弱酸性缓冲液或中性缓冲液。优选地，中性缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。更优选地为磷酸盐缓冲液。
[0042]在本发明的一些实施例中，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.2~1.0mmol/L的牛磺酸。优选地，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.4~0.8mmol/L的牛磺酸。
[0043]本发明提供了包括蔗糖和缓冲液的蝙蝠蛾卵筛选液，通过蔗糖的对不同发育程度的蝙蝠蛾卵的分层作用，缓冲液在有效调节PH值的同时还能够利用盐浓度提高蝙蝠蛾的孵化率。本发明也提供了加入一定量的牛磺酸来优化包括蔗糖和缓冲液的蝙蝠蛾卵筛选液。利用本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液能够利用廉价易得的材料与简单方便方法对的蝙蝠蛾卵的发育程度进行快速优劣检测，并且在不破坏实验用卵的同时优化蝙蝠蛾卵，使筛选后的有用卵增加其孵化率和孵化后蝙蝠蛾的存活率。[0044]本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0045]下面结合实施例，进一步阐述本发明:
[0046]实施例1
[0047]蔗糖磷酸盐缓冲液检测卵效果:
[0048]取第一批次蝙蝠蛾卵，共取3份卵，每份100粒。
[0049]取2份虫卵Α1-1、Α1-2进行解剖查看发育状况，结果如下表1。
[0050]另1份100粒卵A2，调节筛选液中蔗糖含量为1%、10%、15%,20%,分别取液5mL，移入IOmL离心管内。将蝙蝠蛾卵整体抽样由低到高先后浸入几个蔗糖浓度的测试液中。将卵粒投放入各离心管，反复颠倒6到8次，静止待沉。在每个处理漂浮液面的卵粒捞出放于标有对应记号的铺有滤纸的培养皿内，滤纸加湿，然后将沉底的卵投入下一个处理，再观察卵的漂浮情况。依次投入下一个处理。直到无卵下沉。最后将各处理漂浮卵于解剖镜下解剖，察看发育情况。将每次都将漂浮液面的卵捞出。直到所有卵都被捞出。最后附加进行解剖验证。结果如下表2。
[0051]表1蝙蝠蛾卵镜检结果
[0052]
【权利要求】
1.一种蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，其包括蔗糖和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，其PH值为6~7。
3.根据权利要求1所述的蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，所述蔗糖占所述蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为12.5~15.5%。
4.根据权利要求1所述的蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，所述缓冲液的盐浓度为0.04 ~0.16mol/L。
5.根据权利要求1所述的蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，所述缓冲液为弱酸性缓冲液或中性缓冲液。
6.根据权利要求5所述的蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，所述中性缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求1所述的蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，还包含0.2~1.0mmol/L的牛磺酸。
8.一种蝙蝠蛾卵的筛选方法，其特征在于，取蝙蝠蛾卵浸没于蝙蝠蛾卵筛选液中，静置，根据所述蝙蝠蛾卵在所述蝙蝠蛾卵筛选液中的位置获得所述蝙蝠蛾卵的发育程度，浮于所述蝙蝠蛾卵筛选液表面的蝙蝠蛾卵为未发育卵，下沉的蝙蝠蛾卵为发育卵； 所述蝙蝠蛾卵筛选液包括蔗糖和缓冲液。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，其pH值为6~7。`
10.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述蔗糖占所述蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为12.5~15.5%。
11.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述缓冲液的盐浓度为0.04~0.16mol/L。
12.根据权利要求8所述的蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，还包含0.2~1.0mmol/L的牛磺酸。
【文档编号】A01K67/033GK103875604SQ201310698338
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2012年12月19日
【发明者】李全平, 李文佳, 华献春, 蒋均才, 谢俊杰, 贺媛, 蒋成吉 申请人:宜昌山城水都冬虫夏草有限公司, 乳源南岭好山好水冬虫夏草有限公司