毒肽产生、植物中的肽表达和富含半胱氨酸的肽的组合的制作方法
【专利摘要】新的杀虫蛋白、核苷酸、肽、其在植物中的表达、生产所述肽的方法、新的处置方法、生产技术、新的肽、新的制剂和新的生物、提高来自酵母表达系统的杀虫肽生产产量的方法。本发明还涉及并公开了选定的我们称为富含半胱氨酸的杀虫肽(CRIPS)的内毒素，其是来源于苏云金芽孢杆菌(Bt)的肽及其基因，以及内毒素与称为抑制物胱氨酸结(ICK)基因和肽的毒肽的组合、以及内毒素与其它类型的杀虫肽例如胰蛋白酶调节抑卵因子(TMOF)肽序列的组合，它们用于基因和肽两者的各种制剂和组合，用于控制昆虫。
【专利说明】毒肽产生、植物中的肽表达和富含半胱氨酸的肽的组合
[0001] 相关申请的引用 本申请是PCT申请，其要求早期在2012年3月9日提交的美国临时申请顺序号 61/608,921、2012年5月8日提交的美国临时申请顺序号61/644,212、2012年9月7日 提交的美国临时申请顺序号61/698, 261和2012年11月26日的美国临时申请顺序号 61/729, 905的权益，所述申请的完整内容通过引用结合到本文中。 发明领域
[0002] 描述并要求保护新的杀虫蛋白、核苷酸、肽、其在植物中的表达、生产所述肽的方 法、新的处置方法、生产技术、新的肽、新的制剂和产生比用于昆虫控制的相关肽所预期的 更高产量的新的和已知生物体的组合。
[0003] 发明背景 通过现代农业和园艺生产的食物的全球安全性受到虫害的挑战。农民依靠杀虫剂来抑 制虫害，然而由于从市场中清除危险化学物质以及对所有主要类别的化学和生物杀虫剂有 抗性的昆虫品系的进化，农民可获得的对安全实用的杀虫剂的商业选择正在缩小。新的杀 虫剂对农民维持作物保护是必需的。
[0004] 杀虫肽是对其目标（通常为某种类型的昆虫或蜘蛛类动物）有毒的肽，所述肽常 常可具有节肢动物起源，例如来源于蝎或蜘蛛。所述肽可递送到内部，例如通过注射将毒素 直接递送到昆虫的肠或内部器官，或通过诱使昆虫从其食物中食入毒素，例如昆虫摄食转 基因植物，和/或当通过将毒素散布在昆虫居住的场所将毒素递送给昆虫，或通过喷洒或 其它方法将毒素递送至昆虫的环境，然后昆虫与所述肽有某种形式的接触时，所述肽可具 有抑制生长、损害运动或甚至杀死昆虫的能力。
[0005] 然而，杀虫肽进入市场时有很大的问题，迄今很少（如有的话）杀虫肽获准并在市 场上销售，只有一个著名的例外，即来源于苏云金芽孢杆菌（你 CiBi1S 或 Bt的肽。目前在昆虫对Bt蛋白产生抗性方面存在顾虑。
[0006] Bt蛋白，或Bt肽，是以植物结合杀虫剂（plant incorporated protectant)和叶 面喷撒两种形式用于作物保护的有效杀虫剂。Bt蛋白的商业制剂广泛用于控制幼虫期的昆 虫。ICK肽包括具有杀虫活性的许多分子。所述ICK肽对天然存在的生物目标物种（通常 为某种类型的昆虫或蜘蛛类动物）常常是有毒的。通常ICK肽可具有节肢动物起源，例如蝎 或蜘蛛的毒液。Bt是一种并且是唯一的商用杀虫肽的来源生物。已鉴定出潜在的其它类别 和类型的肽，例如胰蛋白酶调节抑卵因子（Trypsin modulating oostatic factor, TM0F) 肽。TMOF肽以各种方式被递送到它们的生理作用部位，并且TMOF肽被鉴定为具有极大潜力 的潜在杀幼虫剂，参见 D. Borovsky，Journal of Experimental Biology 206,3869-3875， 但像几乎所有的其它杀虫肽一样，TMOF未被商业化或未被农民广泛使用，并且有理由如此。
[0007] 具有可再现的肽形成和折叠，以合理和经济的价格，在商业规模上成功生产杀虫 肽的能力可能受到挑战。杀虫肽种类繁多、性能独特且性质特殊，结合极其多种的生产技 术，可提供肽应用和生产的众多方法，但很少（如有的话）是商业上成功的。
[0008] 为什么已鉴定的众多杀虫肽中如此少量已被推向市场有几个原因。第一，大多数 杀虫肽足够脆弱或毒性不足而难以商用。第二，杀虫肽难以商业化生产且昂贵。第三，许多 杀虫肽快速降解并且半寿期短。第四，当通过植物表达时，极少杀虫肽正确折叠，因此在遗 传修饰生物体（GMO)中失去其毒性。第五，大多数已鉴定的杀虫肽当被昆虫采食时，在昆虫 中的全身分布被阻断和/或丧失其毒性性质。Bt蛋白是最后这个问题的例外，并且因为它 们扰乱昆虫摄食，因此被广泛使用。
[0009] 在此，我们提出对于阻碍杀虫肽的商业化和广泛使用的这些主要问题的几个解决 方法。在第一部分中，我们描述了如何产生允许植物产生和表达保持对昆虫的毒性的正确 折置的杀虫肤的特殊表达盒和系统。
[0010] 在第二部分中，我们描述了如何对肽的组成产生相对小的改变，并如此进行以显 著提高可通过发酵生产的速率和量。该处置方法还同时降低商业化工业肽生产的成本。该 部分教导了如何可将蛋白质"转化"成不同的更有成本效益的肽，所述肽可以更高产量生 产，并且出人意料地仍具有与转化前恰好一样的毒性。在第三和最后的部分中，我们描述了 如何将不同类别的杀虫肽组合在一起，使得它们可以协同方式一起运作以显著改变并提高 与其各个组分相比时组分肽的毒性和活性。该部分还提供支持我们的系统、方法和肽组合 和制剂的详细资料和数据以应付正在逼近的Bt抗性昆虫的发生和散布的威胁。Bt抗性昆 虫代表了下一个对全球食物供应的巨大威胁，我们教导本领域技术人员如何迎接和战胜这 种威胁。
[0011] 发明概沭 本发明描述了如何在植物中产生毒性杀虫肽，因此当它们通过植物表达时正确折叠。 本发明描述了如何使用各种载体在实验室和商业生产环境中生产高产量的肽。本发明描 述了一个类别的毒性杀虫肽，我们称为CRIPS，其表示富含半胱氨酸的杀虫肽（Cysteine Rich Insecticidal Peptides,CRIPS)。本发明描述了另一个类别的毒性杀虫肽，我们称为 PFIPS，其表不成孔杀虫蛋白（Pore Forming Insecticidal Proteins，PFIPS)。本发明描 述了如何可将CRIPS和PFIPS的新的协同组合制备在一起并用于各种目的，包括保护作物 免遭Bt或苏云金芽孢杆菌肽抗性昆虫。我们公开了如何制备和使用CRIPS和PFIPS的组 合以非常低的剂量杀死和控制昆虫，甚至Bt抗性昆虫。虽然不受理论约束，但是我们对Bt 或苏云金芽孢杆菌肽和蛋白质的理解，可供我们教导本领域的普通技术人员建立保护植物 和控制昆虫的新的方法、组合物、化合物（蛋白质和肽）和程序。
[0012] 我们描述并要求保护包含与富含半胱氨酸的杀虫蛋白（CRIP)(例如抑制物半胱 氨酸结（Inhibitor Cysteine Knot, ICK)基序蛋白）有效连接的内质网信号肽（ERSP)的 蛋白质，其中所述ERSP是所述蛋白质（ERSP-ICK)的N端。一种肽，其中所述ERSP是将表 达的CRIP导向植物细胞的内质网的任何信号肽。一种肽，其中所述CRIP是抑制物半胱氨 酸结（ICK)蛋白。一种肽，其中所述CRIP是非ICK蛋白。一种肽，其中所述ERSP是来源于 植物的长度为5-50个氨基酸的肽。一种与翻译稳定性蛋白（Translational Stabilizing Protein，STA)有效连接的肽，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，翻译稳定性蛋白（STA) 可在CRIP的N端一侧，所述CRIP任选为ICK基序蛋白（ERSP-STA-ICK)或非ICK基序蛋白 (ERSP-STA-非 ICK);或在 ICK 或非 ICK 基序蛋白的 C 端一侧（ERSP-ICK-STA)或（ERSP-非 ICK-STA)。
[0013] 我们描述并要求保护具有添加至已知肽并与所述已知肽有效连接的N端二肽的 肽，其中所述N端二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成， 其中所述肽选自CRIP (富含半胱氨酸的杀虫肽），例如选自ICK肽或非ICK肽。一种具有 添加至已知肽并与所述已知肽有效连接的N端二肽的肽，其中N端二肽由二肽N端的一个 非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成。一种肽，其中来自N端二肽的N端氨基 酸的非极性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲 硫氨酸。一种肽，其中N端肽的C端氨基酸的极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸。权利要求8的肽，其中N端二肽的N端氨基酸 的非极性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫 氨酸且N端肽的C端氨基酸的所述极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷 氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸。一种肽，其中所述二肽由甘氨酸-丝氨酸组成。
[0014] 我们描述了包含至少两种类型的杀虫蛋白或肽的组合物，其中一种类型是成孔 杀虫蛋白（PFIP)，另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽（CRIP)。一种组合物，其中CRIP 是ICK，任选所述ICK源自于或来源于rerMia或布鲁山脉漏斗网蝴蛛（Blue Mountain funnel web spider) ^Atrax robustus^Atrax formidabilis^Atrax infensus, 包括称为U-ACTX多肽的毒素 U-ACTX-Hvla、rU-ACTX-Hvla、rU-ACTX-Hvlb或突变体或变体。 一种组合物，其中CRIP是非ICK CRIP，任选所述非ICK CRIP源自于或来源于具有非ICK CRIPS的动物例如海葵、海胆和海蛤蝓，任选包括名为hrii/i的海葵，任选包括 名为Av2和Av3的肽，尤其类似于Av2和Av3的肽，包括序列表所列出的这类肽或突变体或 变体。
[0015] 我们描述了使用权利要求13的组合物控制Bt抗性昆虫的方法，所述方法包括产 生至少两种类型的肽的组合物，其中一种类型的肽是成孔杀虫蛋白（PFIP)，另一种类型的 肽是富含半胱氨酸的杀虫肽（CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自权利要求1和本文描述的任 何组合物和序列表提供的任何蛋白质；然后将所述组合物施用于昆虫所在地。一种控制Bt 抗性昆虫包括保护植物免遭Bt抗性昆虫的方法，所述方法包括产生表达至少两种正确折 叠的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成孔杀虫蛋白（PFIP)，另一种类型的肽是富含 半胱氨酸的杀虫肽（CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自本文所述任何组合物和选自序列表提 供的任何蛋白质。一种方法，其中在PFIP影响昆虫肠内衬期间的任何时间给予CRIP。一种 方法，其中在测试昆虫的Bt抗性后给予CRIP，且其中所述昆虫Bt抗性测试为阳性。我们描 述了将呈固体或液体形式的本文所述任何化合物施用于昆虫、昆虫所在地，或作为植物结 合杀虫剂施用。
[0016] 附图简沭 图1是发明的ERSP (内质网信号肽，以对角条纹表示）与CRIP (富含半胱氨酸的杀 虫蛋白）例如ICK (抑制物半胱氨酸结）基序（以垂直条纹表示）的N端融合物的示图。
[0017] 图2是发明的ERSP (对角条纹）与融合STA (翻译稳定性蛋白，以水平条纹表 示）的CRIP基序杀虫蛋白（垂直条纹）的N端融合物的示图。有图2中所示的两种可能 的方向。
[0018] 图3是发明的ERSP (对角条纹）与CRIP基序（垂直条纹）融合的N端融合物的 示图，所述CRIP基序与用水平条纹表示的翻译稳定性蛋白（STA)融合。通过称为间插接头 肽（LINKER)(以方格图案表示）的间插序列将STA与CRIP基序分隔。图3中显示两种可 能的方向。
[0019] 图4是类似于图3的示图，具有下标字母"N"的（LINKER-CRIP)基序表明 LINKER-CRIP基序可使用一次或重复数次，优选1-10个重复序列，有可能甚至更多达15、20 或25次。
[0020] 图5是显示CRIP-LINKER或ICK-LINKER组还可起STA-LINKER组的作用的示图。 换句话说，CRIP-LINKER或ICK-LINKER的组合可起STA-LINKER的作用。换句话说，可以使 用两个ICK基序与一个LINKER，并省去翻译稳定性蛋白或STA的需要。
[0021] 图6是抑制物半胱氨酸结（ICK)基序蛋白中半胱氨酸共价交联的示图。图中的 箭头表示β片层；数字表示形成ICK基序的胱氨酸氨基酸，按其在一级结构中从N到C端 出现的顺序编号。粗曲线表示蛋白质的一级结构；细直线表示特定半胱氨酸共价交联产生 ICK基序。有时包含半胱氨酸2号的β片层不存在。
[0022] 图7是ACTX的ELISA检测水平（作为总可溶性蛋白的百分比（%TSP))的示图，所 述ACTX作为与不同的其它结构元件的翻译融合物自编码ACTX的植物转基因的表达产生。
[0023] 图8是具有不同蓄积定位的烟草瞬时表达的GFP融合的U-ACTX-Hvla的iELISA 检测的％TSP图。APO :质外体定位；CYTO :胞质定位；ER :内质网定位。
[0024] 图9是使用编码具有以下3种不同ERSP序列的翻译融合物的FECT表达载体，烟 草叶瞬时表达GFP融合的U-ACTX-Hvla的iELISA检测的％TSP图：BAAS信号肽（BGIH)、伸 展蛋白信号肽（EGIH)和修饰的伸展蛋白信号肽（E*GIH)。
[0025] 图10是从瞬时转化的烟草叶提取的胰蛋白酶处理和非胰蛋白酶处理的Jun a 3 融合的ω-ACTX-Hvla蛋白的浓缩过程的示图。
[0026] 图11是含ω -ACTX-Hvla样品的HPLC色谱图。如下将样品加载到HPLC系统中 以产生色谱图：Α. 25 Pg合成的ω-ACTX-Hvla5B. 500 PL的样品B I kD过滤截留物；C. 500 PL的样品A I kD过滤截留物。
[0027] 图12是在乳酸克鲁维酵母尤菌株中产生的 U+2-ACTX-Hvla (本文有时亦称"U+2"）和天然U-ACTX-Hvla (本文有时亦称"天然U"） 两者的归一化肽产量的分布图。U+2数据用黑色表示，天然U数据用灰色表示。X轴表示归 一化产量，单位为在600 nm波长处的毫克/升/光吸收单位（mg/L. A.)。左边y刻度表示 U+2菌株的分数。右边y刻度天然U菌株的分数。
[0028] 图13是来自U+2和天然U-ACTX-Hvla乳酸克鲁维酵母菌株的归一化肽产量的分 布图。此处y轴表示各菌株的归一化产量（针对下述相应培养物中的细胞密度归一化），单 位为以600 nm波长处的毫克/升/光吸收单位（mg/L. A.)，X轴相当于所观察到的各菌株 产量相对于针对经工程改造产生相同肽同种型的所有其它乳酸克鲁维酵母菌株所观察到 的产量的百分等级。
[0029] 图14是用U+2和天然U-ACTX-Hvla的家蝇注射生物测定的剂量反应图。U+2数据 用黑色圆点标示，天然U数据用灰色三角标示。X刻度表示以微微摩尔/克家蝇为单位的剂 量。y刻度表示死亡百分比。
[0030] 图15是自巴斯德毕赤酵母O0ZcAia pasioris，/I pasioris)菌株生产的U+2和 天然U-ACTX-Hvla的肽产量的分布图。U+2数据用黑色表示，天然U数据用灰色表示。X轴 表示单位为毫克/升的产量，y刻度表示自巴斯德毕赤酵母菌株生产的总U+2或天然U的 分数。
[0031] 图16是另一个自巴斯德毕赤酵母菌株生产的U+2和天然U-ACTX-Hvla的肽产量 的分布图。此处y轴表示各菌株的单位为毫克/升的产量，X轴相当于所观察到的各菌株 产量的百分等级（相对于针对经工程改造以生产相同肽同种型的所有其它巴斯德毕赤酵 母菌株所观察到的产量）。
[0032] 图17是自乳酸克鲁维酵母表达菌株产生的海葵毒素 Av3和Av3+2的肽产量的分 布图。来自名为ririt/i的海葵的天然毒素称为Av3。修饰毒素在此处标示为Av3 + 2。像上述实例一样，我们在乳酸克鲁维酵母菌株中产生毒肽。X轴表示单位为mAu. sec/ A的各菌株的肽产量，y轴表示菌株的分数。图17中，天然Av3菌株用浅灰色表示，修饰的 高产量菌株Av3 +2用黑色表示。
[0033] 图18表示通过以生产相同肽的转化体的百分等级为函数对肽产量作图，自相应 乳酸克鲁维酵母菌株生产的Av3+2和天然Av3的肽产量的差异。此处y轴表示各菌株的归 一化产量，单位为mAu. sec/A，X轴相当于所观察到的各菌株产量相对于针对经工程改造产 生相同肽同种型的所有其它乳酸克鲁维酵母菌株所观察到的产量的百分等级。
[0034] 图19在施用和暴露于ICK肽或Bt蛋白后叶生物测定24小时百分比死亡率相对 于虫龄的示图。
[0035] 图20在对72小时幼虫使用Bt蛋白或ICK肽或Bt + ICK肽的组合施用后18、24 和48小时，测量百分比死亡率的叶生物测定的示图。
[0036] 图21在暴露于Bt蛋白或非ICK CRIP或其组合后24小时和48小时，测量由Bt 抗性昆虫引起的叶片损伤的食叶生物测定的示图。
[0037] 图22在对Bt蛋白抗性小菜蛾仍幻幼虫使用Bt蛋白或ICK肽或其 组合施用后24和48小时，测量百分比死亡率的食叶生物测定的示图。
[0038] 序列表简沭 本发明包括1593个序列的序列表。
[0039] 在第 1 部分提到或提及 SEQ ID NO: 1-28、1553-1570 和 1593。
[0040] 在第2部分提到或提及SEQ ID NO: 29-32和1571-1592。
[0041] 在第3部分提到或提及SEQ ID NO: 33-1042。
[0042] SEQ ID NO: 1043-1221是来源于或具有蜘蛛源的序列。
[0043] SEQ ID NO: 1222-1262是来源于或具有海葵源的序列。
[0044] SEQ ID NO: 1263-1336是来源于或具有蝎源的序列。
[0045] SEQ ID NO: 1337-1365是来源于或具有蝎源的序列。
[0046] SEQ ID NO: 1366-1446是来源于或具有Cry或Cyt源的序列。
[0047] SEQ ID NO: 1447-1552是来源于或具有VIP源的序列。
[0048] 发明详沭 定义 "ACTX"或"ACTX肽"意指自属于Jiraciz7ae亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛分离的杀虫 ICK肽家族。一种这样的蜘蛛称为澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛，其学名为办 。来自该种的ACTX肽的两个实例是ω肽和U肽。
[0049] "农杆菌感染法（agroinfection) "意指其中通过使用农杆菌属（Agrobacteria) 根癌农杆菌（^. 或发根农杆菌ClrAizogefles)，将DNA导入植物细胞中的植 物转化方法。
[0050] "BAAS"意指大麦α淀粉酶信号肽。它是ERSP的一个实例。
[0051] "二元载体"或"二元表达载体"意指可在大肠杆菌（A. cWi)菌株和农杆菌属 菌株两者中自我复制的表达载体。此外，载体含有被左和右边界序列置于 中间的DNA区（常常称为t-DNA)，所述边界序列被待拷贝并被农杆菌递送至植物细胞中的 毒力基因识别。
[0052] "Bt"亦称苏云金芽抱杆菌（ifeciBws 或汉 ，意指 在全世界范围内已使用60多年以控制农业、林业和公共健康虫害的革兰氏阳性土壤细菌。
[0053] "Bt蛋白"和"Bt肽"在此是指同一物，这些是由Bt产生的肽。所述肽常被写为 "cry"、" Cyt"或"VIP"蛋白，由肩/功7基因编码。Bt蛋白更常被认为是由c/T基 因编码的杀虫晶体蛋白。Bt蛋白是PFIPS (成孔杀虫蛋白）的实例，参见下文定义。序列 表提供了实例PFIPS和其它Bt蛋白。
[0054] "嵌合基因"意指编码来源于一个或多个编码序列的部分的基因以产生新基因的 DNA序列。
[0055] "可切割接头"意指是蛋白酶（可将蛋白质裂解并分成两部分）的靶位点的蛋白质 中的短肽序列或被置于ORF的读框中并编码是蛋白酶（可将蛋白质裂解并分成两部分）的 靶位点的蛋白质中的短肽序列的短DNA序列。
[0056] "条件培养基"意指已被细胞利用并且富含来源于细胞的物质但不含细胞的细胞 培养基。
[0057] "转化"或"转化的"是指制备HP肽的过程。
[0058] "CRIP"和"CRIPS"是一种或多种富含半胱氨酸的杀虫蛋白的缩略语。富含半胱 氨酸的杀虫肽（CRIPS)富含形成二硫键的半胱氨酸的肽。在具有至少10个氨基酸的蛋白 质或肽中，CRIPS含有至少四（4)个、有时六（6)个和有时八（8)个半胱氨酸氨基酸，其中 半胱氨酸形成两（2)、三（3)或四（4)个二硫键。二硫键有助于杀虫肽的折叠、三维结构和 活性。它们形成的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键和三维结构在这些杀虫肽的毒性中起重要作 用。CRIP的实例为抑制性半胱氨酸结或ICK肽（通常具有6-8个半胱氨酸）和具有二硫 键但不被视为ICK肽的毒肽（非ICK CRIPS)两者。ICK的实例可为来自蜘蛛和上文定义 的ACTX肽。非ICK CRIP的实例可为像Av2和Av3 (其是最早从海葵中鉴定的肽）的肽。 这些肽是调节昆虫外周神经系统（PNS)中的钠通道的一类化合物的实例。非ICK CRIPS可 具有形成2-4个二硫键的4-8个半胱氨酸。这些半胱氨酸-半胱氨酸二硫键稳定的毒肽 (CRIPS)当暴露于环境时可具有显著的稳定性。许多CRIPS自分泌毒液的动物（例如蜘蛛、 蝎、蛇和海螺和海葵）中分离，并且它们对昆虫是有毒的。下面提供其它描述。
[0059] "确定成分培养基"意指由已知化学组分组成但不含未加工的蛋白质性提取物或 副产物（例如酵母提取物或蛋白胨）的培养基。
[0060] "二硫键"意指通过两个半胱氨酸氨基酸侧链的两个巯基的偶联得到的两个半胱 氨酸间的共价键。
[0061] "双重转基因肽表达载体"或"双重转基因表达载体"意指含有2拷贝的杀虫肽表 达盒的酵母表达载体。
[0062] "ELISA"或"iELISA"意指其中将样品固定在板的表面，然后如下检测的分子生物 学方案：施加第一抗体，接着施加与酶缀合的第二抗体，所述酶将无色底物转化成可在样品 中检出或定量的有色底物。在该方案过程中，洗去抗体，使得仅保留与其表位结合的抗体用 于检测。我们手中的样品是自植物分离的蛋白质，ELISA允许定量测定回收的已表达的转 基因蛋白的量。
[0063] "表达0RF"意指编码蛋白质复合物的核苷酸，并限定为ORF中的核苷酸。
[0064] "ER"或"内质网"是所有真核生物共有的亚细胞器，其中发生某些翻译后修饰过 程。
[0065] "ERSP"或"内质网信号肽"是在转基因 mRNA分子的蛋白质翻译期间被宿主细胞信 号识别颗粒识别并结合的氨基酸N端序列，其使蛋白质翻译核糖体/mRNA复合物移动至胞 质的ER中。结果是蛋白质翻译暂停，直到它与ER相接，在其中翻译继续，所得蛋白质被注 入ER中。
[0066] "意指编码肽ERSP的核苷酸。
[0067] "ER运输"意指细胞表达的蛋白质运送到ER中用于翻译后修饰、分选和转运。
[0068] "FECT"意指使用剔除外被蛋白基因和三基因框（triple gene block)的狐尾草花 叶病毒的瞬时植物表达系统。
[0069] "GFP"意指来自水母维多利亚多管发光水母ricioria)的绿色突光蛋 白。它是翻译稳定性蛋白的实例。
[0070] "高产肽"或"HP肽"意指按照本文所述程序能够生产或"转化"且一旦转化，可在 生物系统中以高的产量或较高生产率或大于常量生产的肽。较高的生产率可为采用转化前 用来生产肽的相同或类似生产方法，用转化前的肽可达到生产率的20-400%或更大。
[0071] "杂合肽"，亦称"杂合毒素"，亦称"杂合-ACTX-Hvla"，亦称"天然杂合ACTX-Hvla" 以及"U肽"，亦称"U毒素"，亦称"天然U"，亦称"υ-ACTX-Hvla"，亦称"天然U-ACTX-Hvla" 全是指ACTX肽，其是在称为澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛办MT 1SWia的蜘蛛中 发现的，是昆虫电压门控Ca2+通道和电压门控K+通道的双重拮抗剂。
[0072] "IGER"意指一种短肽的名称，基于其一字母代码的实际序列。它是间插接头的实 例。
[0073] " ICK基序"、" ICK基序蛋白"、"抑制物胱氨酸结基序"、"毒性昆虫ICK肽"、" ICK 肽"、"CK"肽"、"胱氨酸结基序"或"胱氨酸结肽"意指16-60个含至少6个半-胱氨酸核心 氨基酸、具有3个二硫桥的氨基酸肽，其中3个二硫桥是共价键，6个半-胱氨酸残基中的共 价二硫键介于自N端氨基酸开始的6个核心半-胱氨酸氨基酸的第一和第四、第二和第五 及第三和第六个半-胱氨酸之间。这种类型的肽一般包含β-发夹二级结构，通常由位于 基序的第四和第六个核心半-胱氨酸之间的残基组成，发夹通过由基序的3个二硫键提供 的结构交联而被稳定。注意其它的半胱氨酸/胱氨酸或半-胱氨酸氨基酸可存在于抑制物 胱氨酸结基序内。序列表中提供了实例。
[0074] 意指编码ICK基序蛋白的核苷酸。
[0075] "ICK基序蛋白表达0RF"或"表达0RF"意指编码ICK基序蛋白复合物的核苷酸， 并限定为ORF中的核苷酸。
[0076] " ICK基序蛋白表达载体"或" ICK表达载体"或" ICK基序表达载体"意指含有表 达ORF的二元载体。二元载体还含有表达ORF周围必要的转录启动子和终止子序列以促进 其编码的ORF和蛋白质表达。
[0077] "昆虫"意指任何节肢动物和线虫，包括螨、已知侵染所有作物、蔬菜和乔木的昆 虫，包括在林业、园艺和农业领域被视为有害生物的昆虫。可用本文公开的方法保护的具体 作物的实例为大豆、玉米、棉、苜蓿和蔬菜作物。具体作物和昆虫列表出现本文件结束时。
[0078] "昆虫肠环境"或"肠环境"意指存在于昆虫或昆虫幼虫的前肠、中肠或后肠中的特 定pH和蛋白水解酶条件。
[0079] "昆虫血淋巴环境"意指存在于昆虫或昆虫幼虫内的特定pH和蛋白水解酶条件。
[0080] "杀虫活性"意指在昆虫暴露于化合物或肽的时候或之后，昆虫死亡，停止或减慢 其运动或其摄食，停止或减慢其生长，不能化蛹，无法生殖或无法生产能育后代。
[0081] "杀虫肽"或"杀虫蛋白"或"毒肽"或"毒蛋白"意指当被昆虫食入、与昆虫接触或 注入昆虫时具有杀虫活性的蛋白质。
[0082] "杀虫肽生产菌株筛选"意指从较低产的菌株鉴定出较高产的杀虫肽生产酵母菌 株的筛选过程。在本文所述方法中，它是指利用反向HPLC或家蝇注射生物测定的筛选。 [0083] "整合表达载体或整合载体"意指本身可插入酵母细胞基因组的特定基因座并稳 定地变成酵母基因组的一部分的酵母表达载体。
[0084] "间插接头"意指蛋白质中将所述蛋白质分隔成不同部分的短肽序列，或被置于 ORF的读框中以将上游和下游DNA序列分隔的短DNA序列，使得在蛋白质翻译期间DNA中编 码的蛋白质可实现其独立的二级和三级结构形成。在植物细胞环境中、在昆虫和/或鳞翅 类肠环境中和在昆虫血淋巴和鳞翅类血淋巴环境中，间插接头可以是抗切割的或是易被切 割的。
[0085] "已知肽"意指已知具有生物活性的肽，且其可以是成熟肽或其任何形式或片段， 包括前肽和肽原（pro p印tide)及活性肽的缀合物。优选的已知肽是具有杀虫活性的肽。
[0086] "L"在适当的上下文中意指连接翻译稳定性蛋白与ICK基序蛋白或多个ICK基序 蛋白结构域的间插接头肽，和连接相同或不同的多个ICK基序蛋白的间插接头肽。当提及 氨基酸时，"L"也可指亮氨酸。
[0087] "接头、LINKER"或在某些情况下"L"意指连接翻译稳定性蛋白与ICK基序蛋白或 多个ICK基序蛋白结构域的间插接头肽，和连接相同或不同的多个ICK基序蛋白的间插接 头肽。接头可具有以下（至少）3个作用之一：在昆虫肠环境中裂解、在植物细胞中裂解或 设计成不刻意裂解。
[0088] "或兹矣〃意指编码间插接头肽的核苷酸。
[0089] "鳞翅类肠环境"意指存在于鳞翅类昆虫或幼虫的前肠、中肠或后肠内的特定pH和 蛋白水解酶条件。
[0090] "鳞翅类血淋巴环境"意指存在于鳞翅类昆虫或幼虫内的特定pH和蛋白水解酶条 件。
[0091] "多个ICK基序蛋白结构域"意指由被多个间插接头肽连接的多个ICK基序蛋白组 成的蛋白质。多个ICK基序蛋白结构域中的ICK基序蛋白可以是相同的或不同的，且该结 构域中的间插接头肽也可以是相同的或不同的。
[0092] "非ICK CRIPS"可具有4-8个形成2-4个二硫键的半胱氨酸。非ICK肽包括不是 ICK肽的胱氨酸结肽。非ICK肽可具有与ICK不同的胱氨酸键的连接顺序。非ICK CRIP的 实例是像Av2和Av3 (其是最早从海葵中鉴定的肽）一样的肽。这些海葵肽是调节昆虫外 周神经系统（PNS)的钠通道的一类化合物的实例。
[0093] "非极性氨基酸"是弱疏水性的氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。甘氨酸或gly是用于本发明二肽的最优选的非极性氨 基酸。
[0094] "归一化肽产量"意指条件培养基中的肽产量除以在测量肽产量的时间点上的相 应的细胞密度。肽产量可用体积单位中所产生的肽的质量表示，例如mg/升或mg/L，或用 HPLC色谱仪中所产生的肽的UV吸光度峰面积表示，例如mAu. sec。细胞密度可用在600 nm 波长处培养物的可见光吸光度（0D600)表不。
[0095] "一字母代码"意指以其一字母代码列出以辨别蛋白质一级结构中不同氨基酸的 肽序列。丙氨酸=A，精氨酸=R，天冬酰胺=N，天冬氨酸=D，天冬酰胺或天冬氨酸=B，半胱氨 酸=C，谷氨酸=E，谷氨酰胺=Q，谷氨酰胺或谷氨酸=Z，甘氨酸=G，组氨酸=H，异亮氨酸=I，亮 氨酸=L，赖氨酸=K，甲硫氨酸=M，苯丙氨酸=F，脯氨酸=P，丝氨酸=S，苏氨酸=T，色氨酸=W， 酪氨酸=Y，缬氨酸=V。
[0096] " ω肽"，亦称" ω毒素"，亦称" ω -ACTX-Hvla"，亦称"天然ω -ACTX-Hvla"全是指 最早从称为澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛办MT1SWia的蜘蛛中分离的，且是昆虫 电压门控Ca 2+通道的拮抗剂的ACTX肽。
[0097] "0RF"或"开放阅读框"或"肽表达0RF"意指编码始于ATG起始密码子并终于TGA、 TAA或TAG终止密码子的蛋白质的DNA序列。ORF也可指DNA编码的翻译的蛋白质。
[0098] "有效连接"意指两个邻接DNA序列放置在一起使得一个的转录活性可作用于另一 个。
[0099] "PEP"意指植物表达的肽。
[0100] "肽表达盒"或"表达盒"意指由在生物表达系统中完成杀虫肽转录所必需的全部 DNA元件组成的DNA序列。在本文所述方法中，它包括转录启动子、编码α-交配因子信号 序列和Kex 2切割位点的DNA序列、杀虫肽转基因、终止密码子和转录终止子。
[0101] "肽表达载体"意指含有异源杀虫肽转基因的宿主生物表达载体。
[0102] "肽表达酵母菌株"、"肽表达菌株"或"肽生产菌株"意指可产生异源杀虫肽的酵母 菌株。
[0103] "特殊制备的肽"意指之前自生物表达系统具有低肽产量并因使用本文所述用于 提高肽产量的方法而变成HP肽的肽。
[0104] "肽转基因"或"杀虫肽转基因"意指编码杀虫肽并且可在生物表达系统翻译的DNA 序列。
[0105] "肽产量"意指从肽表达酵母菌株的细胞中产生的条件培养基中的杀虫肽浓度。它 可用体积单位中所产生的肽的质量表示，例如mg/升或mg/L，或用HPLC色谱仪中所产生的 肽的UV吸光度峰面积表示，例如mAu. sec。
[0106] "围食膜"意指截留大的食物颗粒的昆虫肠内的内衬可有助于所述食物颗粒运动 通过肠，同时允许消化，并且还保护肠壁。
[0107] "PFIP"意指可在内衬昆虫肠的细胞（例如肠上皮细胞）中形成孔或通道的蛋白 质。PFIPS的实例为Bt蛋白例如cry、crt和VIP，其它PFIP实例可见于序列表。
[0108] "PIP"或"植物结合杀虫剂"意指由转基因植物产生的杀虫蛋白和植物产生所述蛋 白质所必需的遗传物质。
[0109] "植物可切割接头"意指可切割的接头肽，或编码可切割的接头肽的核苷酸，其含 有植物蛋白酶识别位点，并且可在植物细胞中在蛋白质表达过程期间被切割。
[0110] "植物再生培养基"意指这样的任何培养基，其含有植物生长的必需元素和维生素 及促进细胞再生为可发芽并生成源于组织培养的小植株的胚所必需的植物激素。所述培养 基常常含有选择剂，转基因细胞表达针对所述选择剂赋予所述选择剂抗性的选择基因。
[0111] "植物转基因蛋白"意指在编码所述蛋白质的DNA或RNA被递送至一个或多个植物 细胞后在植物中表达的来自异源物种的蛋白质。
[0112] "极性氨基酸"是极性的氨基酸，包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、组氨酸、色氨酸和酪氨酸；优选的极性氨基酸为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和 谷氨酰胺；其中丝氨酸为最优选的。
[0113] "转录后基因沉默"或"PTGS"意指活细胞内抑制基因表达的细胞过程。
[0114] 在本文件中，"蛋白质"具有与"肽"相同的含义。
[0115] "重组载体"意指外源DNA插入其中的DNA质粒载体。
[0116] "选择基因"意指赋予基因组修饰的生物在选择压力下生长的优势的基因。
[0117] " STA"，或"翻译稳定性蛋白"，或"稳定性蛋白"，或"融合蛋白"意指具有可在细胞 中蓄积而又不作为蛋白质降解的细胞过程的目标的充足三级结构的蛋白质。蛋白质可介于 5和50aa (例如另一种ICK基序蛋白）、50-250aa (GNA)、250-750aa (例如几丁质酶）和 750-1500aa (例如增强蛋白）之间。翻译稳定性蛋白由ORF中与编码杀虫蛋白的序列融合 在框中的蛋白质的DNA序列编码。融合蛋白可在杀虫蛋白的上游或下游，并且在两个序列 间可具有任何间插序列，只要间插序列不导致任一 DNA序列的移码。翻译稳定性蛋白还可 具有增加 ICK基序蛋白跨肠壁递送并进入昆虫血淋巴中的活性。这种递送可如下实现：通 过跨肠壁主动运输整个0RF，或通过在肠环境内切割以分开ICK基序蛋白同时翻译稳定性 蛋白损坏围食膜和/或肠壁以增加 ICK基序蛋白扩散进入血淋巴。
[0118] "意指编码翻译稳定性蛋白的核苷酸。
[0119] "TM0F"、"TM0F基序"或"TMOF蛋白"意指"胰蛋白酶调节抑卵因子"蛋白序列。序 列表中提供了实例。本文提供了许多实例和变体。SEQ ID NO :708是野生型TMOF序列。 SEQ. ID. NO: 709-721提供了其它非限制性变体。其它实例是已知的或可通过本领域技术 人员产生。
[0120] "TSP"或"总可溶性蛋白"意指可从植物组织样品中提取并溶于提取缓冲液中的蛋 白质的总量。
[0121] "转基因"意指转化进入植物中的编码蛋白质的异源DNA序列。
[0122] "转基因宿主细胞"意指用基因转化并针对其转基因状态通过另外的选择基因选 择的细胞。
[0123] "转基因植物"意指来源于用外源DNA转化的单细胞使得植物中的每个细胞都含有 该转基因的植物。
[0124] "瞬时表达系统"意指基于根癌农杆菌的系统，其将编码无害的（disarmed)植物病 毒的DNA递送到植物细胞中，在其中DNA进行表达。植物病毒被工程改造以表达高浓度的 目标蛋白质，高达40%的TSP。在技术论证中，所采用的瞬时表达系统有两个，TRBO和FECT 系统，植物细胞为烟草植物"AYcoiiaaa "的叶组织。
[0125] "TRB0"意指使用剔除病毒外被蛋白基因的烟草花叶病毒的瞬时植物表达系统。
[0126] "胰蛋白酶切割"意指使用蛋白酶胰蛋白酶（其识别暴露的赖氨酸和精氨酸氨基 酸残基）将可切割接头在该切割位点上切断的体外测定。它还指胰蛋白酶切割该位点的作 用。
[0127] "U肽"、"U蛋白"，亦称"U毒素"，亦称"天然U"，亦称"U-ACTX-Hvla"，亦称"天然 U-ACTX-Hvla"以及"杂合肽"，亦称"杂合毒素"，亦称"杂合-ACTX-Hvla"，亦称"天然杂合 ACTX-Hvla"全都是指天然蛋白质或天然毒素，其可存在于自然界或是以其它方式已知的， 在"U-ACTX-Hvla"，亦称"天然U-ACTX-Hvla"的情况下，该蛋白质是天然蜘蛛毒素，最早发 现于澳大利亚布鲁山脉起源的蜘蛛，并且是针对昆虫电压门控Ca 2+通道和K+通道的双重 拮抗剂。从中发现毒素的蜘蛛已知为澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛，学名为办 versuta。
[0128] "U+2肽"、"U+2蛋白"、"U+2毒素"或"U+2"或"U+2-ACTX-Hvla"全都指具有与天然 肽有效连接的另外二肽的任一毒素，并可指有时称为U肽和上述其它名称的蜘蛛毒素。与U 肽有效连接并因此标为"+2"或"加2"的另外二肽可从数种肽中选择，其任一种可产生具有 本文所述的独特性能的"U+2肽"。这些有时亦称"高产肽"。当使用术语"U+2-ACTX-Hvla" 时，它是指特定的高产毒肽，包括来自澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛（学名为办 的天然存在的肽。
[0129] "VIP"蛋白自针对可能的杀虫活性筛选Bt的营养生长菌株的上清液而被发现。 它们与cry蛋白几乎没有或没有相似性，且它们被命名为营养性杀虫蛋白（Vegetative Insecticidal Protein)或VIP。具有鳞翅类活性的名为VIP3、Vip3蛋白或Vip毒素的是 本文件特别使用和优先使用的。它们被认为与Bt cry肽具有类似的作用方式。在本文件 中，VIP蛋白被归类为PFIP型的蛋白质。
[0130] "酵母表达载体"或"表达载体"或"载体"意指可将异源基因和/或表达盒导入酵 母细胞中以被转录和翻译的质粒。
[0131] "产量"是指肽的生产量，高的产量可意指生产量提高、生产率提高及平均产量或 中值产量提高和较高产量的频率提高。
[0132] 第1部分.棺物结合狀或棺物表汰的狀"PIPS"和"PEPS" 植物结合杀虫剂，或"PIPS"，为农民所面临的昆虫压力提出一种解决方法。现代农业 利用作为植物转基因蛋白表达的苏云金芽孢杆菌的基因以起PIPs的作用，但是天然抗性 昆虫品系已在田间检出，并且这个类别可能来临。需要开发具有新的作用方式的其它PIPs 以控制抗性的发生。具有变成PIPs的潜力、有杀虫活性的新的蛋白质类别被称为富含半胱 氨酸的杀虫蛋白（CRIPS)，这些蛋白质具有4、6或8个半胱氨酸和2、3或4个二硫键。这类 化合物的一个实例被视为具有被称为抑制物半胱氨酸结（ICK)基序蛋白的类型。具有杀虫 活性的ICK基序蛋白具有成为杀虫蛋白和PIPs的潜力。
[0133] ICK基序蛋白是具有形成特定的ICK三级结构的至少6个半胱氨酸残基的一类蛋 白质。ICK基序蛋白中半胱氨酸残基的共价交联形成导致这样的三级结构的二硫桥：使蛋 白质对蛋白酶和有时对极端物理条件（pH、温度、紫外线等）相对有抗性，并赋予针对离子 通道的活性，这可能对昆虫是特异性的。在使用ICK基序蛋白作为毒素使其捕食者或猎物 不动或被杀死的无脊椎动物和脊椎动物毒液中，许多ICK基序蛋白发生进化。所述杀虫肽 常常具有蝎、蜘蛛起源，有时具有蛇起源。在性质上，毒肽可通过注射流入昆虫的肠或内部 器官。在PIP的情况下，递送通常通过昆虫摄食植物组织中表达的转基因蛋白。在从其食 物摄食毒素时，例如昆虫摄食转基因植物，ICK基序蛋白可具有抑制生长、损害运动或甚至 杀死昆虫的能力。
[0134] 然而，毒肽当在植物中表达时常常丧失其毒性。除非ICK基序蛋白作为正确折叠 的蛋白质表达，否则其无法成功地保护植物或作物免遭虫害。在某些情况下，植物表达的肽 需要在昆虫内或在植物中的表达过程期间通过切割而被激活以便有活性。对以下的方法和 修饰的肽和核酸存在需要：使肽不仅仅能够在植物中表达，而且还能够表达、正确折叠并在 某些情况下正确切割使得肽甚至在植物中表达后仍保留其针对昆虫的活性。在该部分中， 我们提供了生产适宜在植物中表达的活性肽的几种方法。
[0135] 我们描述了有效连接在一起以获得新的蛋白质复合物的不同肽的各种组合。描 述了下列蛋白质复合物。一种包含与富含半胱氨酸的杀虫肽（CRIP)例如抑制物胱氨酸结 (ICK)基序蛋白有效连接的内质网信号肽（ERSP)的肽，其命名为ERSP-ICK，其中所述ERSP 是所述肽的N端，且其中ERSP肽的长度为3-60个氨基酸、5-50个氨基酸、20-30个氨基酸和 /或其中肽是BAAS、或烟草伸展蛋白信号肽、或修饰的烟草伸展蛋白信号肽、或 aiei或/ aiei的Jun a 3信号肽。
[0136] 一种包含与富含半胱氨酸的杀虫肽（CRIP)例如抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白 有效连接的内质网信号肽（ERSP)的肽，其命名为ERSP-ICK，其中ICK基序蛋白的长度介于 16和60个氨基酸之间、介于26和48个氨基酸之间、介于30和44个氨基酸之间和/或其 中 ICK 基序蛋白是 U-ACTX-Hvla、或 ω-ACTX-Hvla、或 κ-ACTX-Hvlc。
[0137] 一种包含与抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白有效连接的内质网信号肽（ERSP)的 肽，命名为ERSP-ICK，其中所述ERSP和抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白是本文所述任何大 小和长度的组合和/或包含本文件教导的任何已鉴定的序列。
[0138] 一种编码本文描述的作为内质网信号肽（ERSP)和/或富含半胱氨酸的杀虫肽 (CRIP)例如抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白的任何肽的核苷酸。一种包含编码这些肽的任 何核苷酸的表达0RF。一种包含编码这些肽的任何核苷酸的表达0RF，其被转化至转基因植 物基因组中。一种肽，其中所述ICK基序蛋白是杀虫蛋白。一种肽，其中所述杀虫肽是本文 描述的任何ICK基序蛋白或肽。一种肽，其中所述杀虫肽是选自包括澳毒蜘蛛属Oir aW 或的任何肽或肽源的任何肽。选自序列表的任何肽的杀虫肽及其片段，包括所 述肽和序列号的成熟、前肽和肽原形式。一种肽，其中所述杀虫肽是描述或选自ACTX蛋白 的任何所选的肽。一种TMOF蛋白。
[0139] 本文所述任何肽或核苷酸制备或转化植物或植物基因组以在转化植物中表达正 确折叠的毒肽的用途。本文所述任何肽或核苷酸制备或转化植物或植物基因组从而在转化 植物中表达正确折叠的毒肽并使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积并使植物 对虫害的抗性提高的用途。
[0140] 一种使用任何肽的核苷酸或在CRIP、ICK、非ICK、基序蛋白表达载体中的表达ORF 产生转基因植物的方法。一种包含表达本文所述任何肽的任何核苷酸的ICK基序蛋白表达 载体。一种掺入到转化植物中的ICK基序蛋白表达载体，其包含编码本文公开的任何肽或 鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人员制备的核苷酸。一种生产具有或表达本文所 述任何肽的转化植物的方法。一种由本文所述任何产品和处置方法产生的植物。
[0141] 一种包含与有效连接间插接头肽（L或接头）的抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白 或富含半胱氨酸的肽有效连接的内质网信号肽（ERSP)的蛋白质，其命名为ERSP-接头-ICK (ERSP-L-ICK)或ERSP-ICK-接头（ERSP-ICK-L)，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，和所 述L或接头可位于ICK基序蛋白的N端一侧（上游）或ICK基序蛋白的C端一侧（下游）。 一种命名为ERSP-L-ICK或ERSP-ICK-L的蛋白质，其包含本文所述任何ERSP或ICK基序蛋 白，且其中所述L可以是不可切割的接头肽或可切割的接头肽，其在植物细胞中在蛋白质 表达过程期间是可切割的或在昆虫肠环境和血淋巴环境中可被切割，且包含本文件描述或 教导的任何间插接头肽（LINKER)，包括下列序列：IGER (SEQ ID NO. 1)、EEKKN (SEQ ID NO. 2)和 ETMFKHGL (SEQ ID NO. 3)。
[0142] 一种编码所述作为内质网信号肽（ERSP)、抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白和/或 间插接头肽（LINKER)的任何肽的核苷酸和编码用于产生转基因植物的这些蛋白质的任一 种的任何和所有核苷酸。
[0143] 所述肽或编码内质网信号肽（ERSP)、抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白和/或间插 接头肽（LINKER)的核苷酸的任一种在制备或转化植物或植物基因组从而在转化植物中表 达正确折叠的毒肽中的用途。所述肽或编码内质网信号肽（ERSP)、抑制物胱氨酸结（ICK) 基序蛋白和/或间插接头肽的核苷酸的任一个在制备或转化植物或植物基因组从而在转 化植物中表达正确折叠的毒肽并使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积并使植 物对虫害的抗性提高中的用途。
[0144] -种使用编码内质网信号肽（ERSP)、抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白和/或间插 接头肽（LINKER)的核苷酸或表达ORF产生转基因植物的方法。一种表达0RF，其包含在ICK 表达载体中的表达本文所述任何肽、ERSP、ICK基序蛋白和/或LINKER的任何核苷酸。一 种掺入转化植物中的ICK基序蛋白表达载体中的功能表达0RF，其包含编码本文公开的任 何肽的核苷酸；编码ERSP、ICK基序蛋白和/或LINKER的核苷酸；或鉴于本文公开的教导 内容可由本领域技术人员制备的核苷酸。一种生产具有或表达本文所述任何肽、ERSP、ICK 基序蛋白和/或LINKER的转化植物的方法。一种由本文所述任何产品和处置方法产生的 植物。
[0145] 一种包含与有效连接翻译稳定性蛋白（STA)的抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白有 效连接的内质网信号肽（ERSP)的蛋白质，其命名为ERSP-STA-ICK或ERSP-ICK-STA，其中所 述ERSP是所述蛋白质的N端，所述STA可位于ICK基序蛋白的N端一侧（上游）或ICK基 序蛋白的C端一侧（下游）。一种命名为ERSP-STA-ICK或ERSP-ICK-STA的蛋白质，其包含 本文所述的任何ERSP或ICK基序蛋白，且其中STA包含本文件所述或教导的任何翻译稳定 性蛋白，包括GFP (绿色突光蛋白）、GNA (雪花莲凝集素）、Juna3 和许多其它ICK基序蛋白。
[0146] 一种编码所述作为内质网信号肽（ERSP)、抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白和/或 翻译稳定性蛋白（STA)的任何肽的核苷酸和具有编码用于产生转基因植物的这些蛋白质 的任一种的这些功能类型的任一个的任何和所有核苷酸。
[0147] 所述肽或编码内质网信号肽（ERSP)、抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白和/或翻 译稳定性蛋白（STA)的核苷酸的任一个在制备或转化植物或植物基因组从而在转化植物 中表达正确折叠的毒肽中的用途。所述肽或编码内质网信号肽（ERSP)、抑制物胱氨酸结 (ICK)基序蛋白和/或翻译稳定性蛋白（STA)的核苷酸的任一个在制备或转化植物或植物 基因组从而在转化植物中表达正确折叠的毒肽并使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植 物中蓄积并使植物对虫害的抗性提高中的用途。
[0148] 一种使用在ICK表达载体中编码内质网信号肽（ERSP)、抑制物胱氨酸结（ICK)基 序蛋白和/或翻译稳定性蛋白（STA)的核苷酸或表达ORF以产生转基因植物的方法。一种 表达0RF，其包含表达ERSP、ICK基序蛋白和/或STA的任何核苷酸。一种掺入转化植物中 的ICK基序蛋白表达载体中的功能表达0RF，其包含编码ERSP、ICK基序蛋白和/或STA或 鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人员制备的核苷酸。一种产生具有或表达ERSP、 ICK基序蛋白和/或STA的转化植物的方法。一种由本文所述任何产品和处置方法产生的 植物。
[0149] 一种包含与有效连接与间插接头肽（LINKER)有效连接的翻译稳定性蛋白（STA) 的抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白有效连接的内质网信号肽（ERSP)的蛋白质，其命名为 ERSP-STA-LINKER-ICK、ERSP-ICK-LINKER-STA、ERSP-STA-L-ICK 或 ERSP-ICK-L-STA，其中 所述ERSP是所述蛋白质的N端，所述STA可位于ICK基序蛋白的N端一侧（上游）或ICK 基序蛋白的C端一侧（下游），且所述LINKER介于STA和ICK基序蛋白之间。一种命名为 ERSP-STA-LINKER-ICK 或 ERSP-ICK-LINKER-STA 的蛋白质，其包含本文所述 ERSP、ICK 基序 蛋白、间插接头肽和翻译稳定性蛋白的任一种。
[0150] 一种编码所述作为内质网信号肽（ERSP)、抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白、间插 接头肽（LINKER)和/或翻译稳定性蛋白（STA)的任何肽的核苷酸和编码用于产生转基因 植物的这些蛋白质的任一种的任何和所有核苷酸。
[0151] 所述肽或编码内质网信号肽（ERSP)、抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白、间插接头 肽和/或翻译稳定性蛋白（STA)的核苷酸的任一种在制备或转化植物或植物基因组从而在 转化植物中表达正确折叠的毒肽中的用途。所述肽或编码内质网信号肽（ERSP)、抑制物胱 氨酸结（ICK)基序蛋白、间插接头肽（LINKER)和/或翻译稳定性蛋白（STA)的核苷酸的任 一种在制备或转化植物或植物基因组从而在转化植物中表达正确折叠的毒肽并使已表达 的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积并使植物对虫害的抗性提高中的用途。
[0152] 一种使用ICK表达载体中的编码内质网信号肽（ERSP)、抑制物胱氨酸结（ICK)基 序蛋白、间插接头肽和/或翻译稳定性蛋白（STA)的核苷酸或表达ORF以产生转基因植物 的方法。一种表达0RF，其包含在ICK表达载体中的表达ERSP、ICK基序蛋白、LINKER和/ 或STA的任何核苷酸。一种掺入转化植物中的ICK表达载体中的功能表达0RF，其包含编 码ERSP、ICK基序蛋白、LINKER和/或STA或鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人 员制备的核苷酸。一种产生具有或表达ERSP、ICK基序蛋白、LINKER和/或STA的转化植 物的方法。一种由本文所述的任何产品和处置方法产生的植物。
[0153] 一种包含与多个抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白结构域有效连接的内质网 信号肽（ERSP)的蛋白质，所述抑制物胱氨酸结基序蛋白结构域被有效连接与间插接 头肽有效连接的翻译稳定性蛋白（STA)的间插接头肽（LINKER)有效连接，其命名为 ERSP-STA-(LINKERi-ICKj) N 或 ERSP-(ICKj-LINKERi)N-STA,有时为 ERSP-STA-(Li-ICKj) N或ERSP-(ICK j-Li)irSTA,其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，所述STA可位于多个ICK 基序蛋白结构域（(LINKERi-ICW)的N端一侧（上游）或多个ICK基序蛋白结构域 ((ICKj-LINKERi) N)的C端一侧（下游），所述多个间插肽（LINKERi)介于STA和多个ICK基 序蛋白结构域之间和介于多个ICK基序蛋白结构域中的ICK基序蛋白之间。一种命名为 ERSP-STA-(LINKERi-ICKj)N 或 ERSP-(ICKj-LINKERi)irSTA 的蛋白质，其包含本文所述 ERSP、 ICK基序蛋白、间插接头肤和翻译稳定性蛋白的任一种。
[0154] 一种编码所述作为内质网信号肽（ERSP)、多个抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白结 构域、间插接头肽（LINKER)和/或翻译稳定性蛋白（STA)的任何肽的核苷酸和编码用于产 生转基因植物的这些蛋白质的任一种的任何和所有核苷酸。
[0155] 所述肽或编码内质网信号肽（ERSP)、多个抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白结构 域、间插接头肽（LINKER)和/或翻译稳定性蛋白（STA)的核苷酸的任一种在制备或转化植 物或植物基因组从而在转化植物中表达正确折叠的毒肽中的用途。所述肽或编码内质网信 号肽（ERSP)、多个抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白结构域、间插接头肽（LINKER)和/或翻 译稳定性蛋白（STA)的核苷酸的任一种在制备或转化植物或植物基因组从而在转化植物 中表达正确折叠的毒肽并使已表达的和正确折叠的毒肽在所述植物中蓄积并使植物对虫 害的抗性提高中的用途。
[0156] 一种使用编码内质网信号肽（ERSP)、多个抑制物胱氨酸结（ICK)基序蛋白结构 域、间插接头肽（LINKER)和/或翻译稳定性蛋白（STA)的核苷酸或表达ORF以产生转基因 植物的方法。一种表达0RF，其包含表达ERSP、多个ICK基序蛋白结构域、L或LINKER和/ 或STA的任何核苷酸。一种掺入转化植物中的功能表达0RF，其包含编码ERSP、多个ICK基 序蛋白结构域、LINKER和/或STA或鉴于本文公开的教导内容可由本领域技术人员制备的 核苷酸。一种产生具有或表达ERSP、多个ICK基序蛋白结构域、LINKER和/或STA的转化 植物的方法。一种由本文所述的任何产品和处置方法产生的植物。
[0157] 一种嵌合基因，其包含与本文所述核苷酸的核酸或表达ORF有效连接的在植物中 有活性的启动子。一种制备、生产或使用本文中描述的这些嵌合基因的方法。一种包含本 文所述嵌合基因的重组载体。一种制备、生产或使用本文所述重组载体的方法。一种包含 本文所述嵌合基因的转基因宿主细胞。一种制备、生产或使用本文所转基因宿主细胞的方 法。一种本文所述的转基因宿主细胞，其是转基因植物细胞。一种制备、生产或使用本文所 述的转基因植物细胞的方法。一种包含本文所述的转基因植物细胞的转基因植物。一种制 备、生产或使用本文所述转基因植物的方法。一种本文所述的转基因植物，其由玉米、大豆、 棉、稻、小麦、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、任何绿叶蔬菜或任何果树制备。 一种得自本文所述转基因植物的种子，其中所述种子包含本文所述嵌合基因。一种制备、生 产或使用本文所述转基因植物的方法。一种制备、生产或使用本文所述种子的方法。
[0158] 文献描述了来自蝴蛛和蝎的植物表达的抑制半胱氨酸结（ICK)基序蛋白（Khan 等，Transgenic Res. , 2006,15 :349-357 ;Hern<5ndez-Campuzano 等，Toxicon. 2009 年 I 月；53(1): 122-8)。我们描述了如何制备有活性的并且在植物中蓄积至杀虫剂量水平的植 物表达的ICK基序蛋白。我们表明植物表达的ICK基序蛋白的之前的描述实际上是已丧失 其天然毒性的无活性蛋白质的描述。我们描述了提高植物表达的效能、增加植物表达的蛋 白质的蓄积和显著提高植物表达的蛋白质的杀虫活性的方法。我们描述了如何由植物细胞 中的内质网信号转导蛋白（ERSP)指导将植物表达的ICK基序蛋白引导进入内质网（ER)， 以便正确共价交联杀虫活性所需的基本三级ICK基序结构的肽二硫桥。我们还描述了植物 表达的ER运输性含加入的翻译稳定性蛋白结构域（STA)的ICK基序蛋白复合物以增加所 得ICK融合蛋白的大小，所述ICK融合蛋白促进肽在植物中蓄积。我们还描述了植物表达 的ER运输性含上述加入的翻译稳定性蛋白和含加入的间插接头肽（LINKER)的ICK基序蛋 白，所述间插接头肽允许潜在切割和回收具有杀虫活性的ICK基序蛋白的活性形式。我们 还描述了植物表达的多肽，其含有ER运输性的含被间插接头肽（LINKER)分隔的多个ICK 基序蛋白、含加入的间插接头肽、含加入的翻译稳定性蛋白的ICK基序蛋白结构域，所述翻 译稳定性蛋白允许正确折叠的ICK基序蛋白在植物中蓄积至杀虫剂量。
[0159] 本发明描述了是植物表达的并可成功保护植物或作物免遭虫害的具有杀虫活性 的ICK基序蛋白。本文所述ICK基序蛋白表达ORF是这样的核苷酸，其使植物翻译的肽不 仅能够在植物中表达，而且能够正确表达并折叠，而且在植物中蓄积至杀虫剂量。蛋白质表 达ORF的一个实例可以是按以下等式形式描述和在附图或图表中的示图形式表示的ICK基 序蛋白表达ORF。
[0160] (兹义N，或 (CriZT7-兹义 上述表达式只是一个实例，对于其它类型的CRIP表达ORF可写出类似表达式，例如ICK 表达ORF可写作： ersp-sta-{接头 fickSw^ersp-ijckj-接头）N_sta 这些表达式、等式或线性示图描述了一种类型的CRIP的多核苷酸开放阅读框 (ORF)，其是表达ICK基序蛋白复合物的一种，可写作ERSP-STA- (LINKER1-ICig N或 ERSP- (ICK厂LINKER1) N-STA，或 ERSP-STA- (L1-ICK1) N 或 ERSP- (ICK1-L1) N-STA，含有用短划线 符号将各个组分间隔开的4种可能的肽组分。在上图中，#5/7的核苷酸组分是编码植物内 质网运输信号肽（ERSP)的多核苷酸区段。的组分是编码翻译稳定性蛋白（STA)的多核 昔酸区段，其有助于表达的ICK基序蛋白在植物中畜积但可能不是ICK基序蛋白表达ORF 必需的。兹矣i的组分是编码使ICK基序蛋白彼此间隔和与翻译稳定性蛋白间隔开来的间 插接头肽（L或LINKER)的多核苷酸区段，下标"i"表示不同类型的接头肽可用于CRIP或 ICK基序蛋白表达0RF。在Sia不用于ICK基序蛋白表达ORF的情况下，可不用接头 与编码ICK基序蛋白的多核苷酸直接连接。的组分是编码ICK基序蛋白（ICK)的多核 苷酸区段，下标"j"表示不同的ICK基序蛋白；（兹矣i-icW"表示编码间插接头肽和ICK 基序蛋白的核苷酸结构可在相同的ICK基序蛋白表达ORF的同一可读框中重复"N"次，其 中N可以是1-10的任何整数。N可为1-10,具体地讲N可为1、2、3、4或5,而在一些实施方 案中，N为6、7、8、9或10。重复序列可含有编码不同间插接头（LINKER)和不同ICK基序蛋 白的多核苷酸区段。包括在相同ICK基序蛋白表达ORF内的重复序列的不同多核苷酸区段 全在同一翻译框内。
[0161] 如ICK基序蛋白表达ORF示图中的4种主要组分兹关和cri/7或?的 任何组合，可用来产生PEP型ICK基序蛋白表达0RF，只要使用最小量的從沙和至少1拷贝 StJ crip WLick0
[0162] I. PEPs的ERSP或從沙组分。
[0163] ICK基序蛋白表达ORF始于其5'端的er577。对于正确折叠和有功能的ICK基序 蛋白，当它从转基因植物表达时，它必须具有与编码ICK基序蛋白的多核苷酸在框中融合 的從沙核苷酸。在细胞翻译过程中，翻译的ERSP可通过与称为信号识别颗粒的细胞组分 结合，指导正翻译的ICK基序蛋白插入植物细胞的内质网（ER)中。在ER内，ERSP肽被信 号肽酶切割，ICK基序蛋白被释放到ER中，其中ICK基序蛋白在翻译后修饰过程中正确折 叠，例如形成二硫键。在没有任何其它的保留蛋白质信号的情况下，该蛋白质通过ER转运 到高尔基体，在此被最终分泌到质膜以外并进入质外体空间。ICK基序蛋白可在质外体空间 蓄积以有效达到在植物中的杀虫剂量。图1表示由与ICK基序功能性连接的ERSP组成的 简单的两种组分肽或核苷酸的代表性示图。ICK可以是合适的CRIP。使用ERSP的更复杂 的蛋白质和多核苷酸见图2-5,将在STA或翻译稳定性蛋白的阐述中进一步讨论这些图。
[0164] ERSP肽位于植物翻译的ICK基序蛋白复合物的N端区，且ERSP部分由大约3-60个 氨基酸组成。在一些实施方案，为5-50个氨基酸。在一些实施方案，为10-40个氨基酸，但 最通常由15-20、20-25或25-30个氨基酸组成。ERSP是所谓的信号肽，因为它指导蛋白质 的转运。信号肽也可称为引导信号、信号序列、转运肽或定位信号。用于ER运输的信号肽的 长度常常为15-30个氨基酸残基，具有由两侧接带正电荷的氨基端和极性但不带电荷的羧 基端区域的疏水残基的核心组成的三联组构。（Zimmermann等，"Protein translocation across the ER membrane (跨 ER膜的蛋白质转移）"，ei Jcia, 2011, 1808: 912-924)。
[0165] 许多ERSP是已知的。许多植物ERSP是已知的。ERSP来源于植物ERSP不是必须 的，非植物ERSP将按本文所述方法运作。然而，许多植物ERSP是众所周知的，在此，我们描 述了一些植物来源的ERSP。例如，BAAS来源于植物大麦（/Yorifews ra&are)，并具有如下 的氨基酸序列： MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG (SEQ ID NO: 4) 植物ERSP，其选自已知表达并释放进入植物质外体空间的蛋白质的基因组序列，少数 实例为BAAS、胡萝卜伸展蛋白、烟草PR1。下列参考文献提供更多描述，并通过引用以其整 体结合到本文中。De Loose, M.等，"The extensin signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts (伸展蛋白信号肽允许异源蛋白质从 原生质体中分泌）" 99 (1991) 95-100。De Loose，Μ.等人描述了来自皱叶烟草 (/Vico )的伸展蛋白编码基因的结构分析，其序列含有用于蛋白 质易位到内质网的典型信号肽。Chen, M.H.等 "Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular compartments of plant cells (稻α淀粉酶和货物蛋白质的信号肽依赖性引导至植物细 胞的质体和胞外区室）"2004年7月；135(3): 1367-77.电子出版 物2004年7月2日。Chen，Μ. H.等人通过分析转基因烟草中在有或没有其信号肽的情况 下a-淀粉酶的表达，研究了 a-淀粉酶在植物细胞中的亚细胞定位。这些参考文献和其 它文献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体 的信号肽。
[0166] II. PEPs的CRIP和ICK基序蛋白组分或crip和?。
[0167] 在我们的ICK基序蛋白表达ORF图中，"id"意指编码"ICK基序蛋白"或"抑制 物胱氨酸结基序蛋白"的多核苷酸，其为16-60个氨基酸肽，具有含3个二硫桥的至少6个 半-胱氨酸核心氨基酸，其中3个二硫桥是共价键，6个半-胱氨酸残基中共价二硫键介 于自N端氨基酸开始的6个核心半-胱氨酸氨基酸的第一和第四、第二和第五及第三和第 六个半-胱氨酸之间。ICK基序蛋白还包含β-发夹二级结构，通常由位于基序的第四和 第六核心半-胱氨酸间的残基组成，发夹通过由基序的3个二硫键提供的结构交联而被稳 定。注意其它的半胱氨酸/半胱氨酸或半-胱氨酸氨基酸可存在于抑制物半胱氨酸结基 序中，如图6所示。CRIP或ICK基序可以重复以增加毒肽在植物中的蓄积。参见图4和图 5。重复CRIP或ICK基序1-10次、有时高达15、20或25次的这种能力还见于本文描述为 (兹关 i-icAj) Ν 或 (icl.-兹关 的 CRIP 或 ICK 蛋白质表达 ORF 的等 式样示图中，其中通过下标数值N给出重复LINKER-ICK基序的数目，且N通常为1-10,但在 一些植物中甚至可以达到更高。
[0168] 可写出类似的表达式像(贫关i-icij) N或-贫关, 并可描述其它CRIP肽。在该部分中，一种表达ORF的实例是用来增加植物中的肽表达 的表达0RF，并以ICK蛋白为最佳实例。在上图中，使用含有4个可能的肽组分（各组分 用短划线符号分隔）的表达ICK基序蛋白复合物的多核苷酸可读框（0RF)，其可描述为 Ersp-Sta-(Linkeri-Ickj)n 或 Ersp-(Ickj-Linkeri)n-Sta,或为 Ersp-STA-(Li-Ickj)n 或 Ersp-(ICKt-Li)n-STAc显示这种类型的构建体的替代方法可见图中。在示图和附图中， 的核苷酸组分是编码植物内质网运输信号肽（ERSP)的多核苷酸区段。的组分是编码 翻译稳定性蛋白（STA)的多核苷酸区段，其有助于表达的ICK基序蛋白在植物中蓄积但可 能不是ICK基序蛋白表达ORF必需的。Λ的组分是编码将ICK基序蛋白彼此分隔和与翻译 稳定性蛋白分隔开来的间插接头肽（L或LINKER)的多核苷酸区段，下标"i"表示不同类型 的接头肤可用于ICK基序蛋白表达0RF。在不用于ICK基序蛋白表达ORF的情况下， #5/7可不用接头与编码ICK基序蛋白的多核苷酸直接连接。i味的组分是编码ICK基序 蛋白（ICK)的多核苷酸区段，下标"j"表示不同的ICK基序蛋白；（兹矣i-icW"表示编码 间插接头肤和ICK基序蛋白的核昔酸结构可在相同的ICK基序蛋白表达ORF的同一可读框 中重复"N"次，其中N可以是1-10的任何整数，但可以变得甚至更高至15、20和25,这些重 复序列可含有编码不同间插接头和不同ICK或CRIP基序蛋白的多核苷酸区段。在相同ICK 或CRIP基序蛋白表达ORF内包括重复序列的不同的多核苷酸区段全都在同一翻译框内。
[0169] 该基序在自许多物种的毒液中分离的肽中是共有的。无脊椎动物物种包括蜘蛛、 蝎、芋螺（cone snail)、海葵等，其它实例有很多，已知甚至蛇毒液都具有含ICK基序的肽。 我们使用的蜘蛛中的一个实例是来自澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛的一类ACTX肽，但是 本文所述程序是有用的，可应用于含ICK基序的任何蛋白质。
[0170] 含ICK基序的肽毒素的实例可见于下列参考文献。Lew，M. J.等人 ("Structure-Function Relationships of ω-Conotoxin GVIA (ω-食鱼螺毒素 GVIA 的结构-功能关系）" /oaraa/ o/ 第 272 卷，第 18 期，5月2日发行，第12014-12023页，1997)回顾了 N型钙通道阻断剂ω-食鱼螺 毒素。Quintero-Hernandez，V.等人（"Scorpion and Spider Venom Peptides: Gene Cloning and Peptide Expression (蝎和蝴蛛毒液肽：基因克隆和肽表达）" Tb^rico/?， 58，第644-663页，2011)回顾了来自不同蜘蛛和蝎品种的许多节肢动物毒肽的概要。 在 Takahashi, H.等· "Solution structure of hanatoxinl, a gating modifier of voltage-dependent K+ channels: common surface features of gating modifier toxins (电压依赖性K+通道的门控调节剂hanatoxinl的溶液结构：门控调节剂毒素的一般表面 特征）" /otfraa/ o/ 第 297 卷，第 3 期，2000 年 3 月 31 日，第 771-780页中，使用NMR光谱法，将Hanatoxinl的三维结构鉴定为抑制物半胱氨酸结基序。 Zhu, S.等· "Evolutionary origin of inhibitor cystine knot peptides (抑制物胱 氨酸结肽的进化起源）/·，2003年9月17日，（12):1765-7,电子出版物2003 年7月3日发表了编码蝎毒液ICK毒素肽Opicalcinel的cDNA的分离和鉴定。Dauplais, M.等人（"On the convergent evolution of animal toxins (有关动物毒素的趋同 潘:D'' Journal of Biological Chemistry. 1997 年 2 月 14 日；272 (7) : 4302-9)公 开了来自海葵及gra/w/i/era的K+通道阻断性毒素 BgK的序列特异性排布和 二级结构鉴定° Escoubas, P.等人（"Structure and pharmacology of spider venom neurotoxins (蝴蛛毒液神经毒素的结构和药理学）" 第82卷，第9 - 10期， 2000年9月10日，第893-907页）发表了强调表明半胱氨酸桥、半胱氨酸结形成和"成 结型（knotting-type) "折叠的多肽毒素结构、作用方式和分子进化的蜘蛛毒液的组成和 药理学的综述。Galvez, A.等人（"Purification and characterization of a unique, potent, peptidyl probe for the high conductance calcium-activated potassium channel from venom of the scorpion Buthus tamulus (来自蝎Buthus tamulus毒液的 高传导性钙激活的钾通道的独特有效的肽基探针的纯化和表征） 1990 年 7 月 5 日；265 (19) : 11083-90)公开了纯化的肤 iberiotoxin，一种 来自蝎（及毒液的Ca2+激活的K+通道的抑制剂。Gimenez-Gallego, G.等 人（"Purification, sequence, and model structure of charybdotoxin, a potent selective inhibitor of calcium-activated potassium channels ( 一种?丐激活的钾 通道的有效选择性抑制剂卡律蝎毒素的纯化、序列和模型结构）" /7TOC 1988年5月；85(10): 3329 - 3333)公开了纯化的肽卡律蝎毒素，一种来自蝎Zeiwrw1S 的毒液的Ca2+激活的K+通道的抑制剂。根据这些和其它出版物，本领域 的技术人员应能够容易地鉴定具有我们描述为ICK基序、ICK基序蛋白或"抑制物胱氨酸结 基序"的蛋白质和肤。
[0171] ICK基序蛋白可以是具有ICK基序且长度介于16和60个氨基酸之间的任何蛋白 质，其具有产生正确顺序的共价交联二硫键的至少6个半胱氨酸残基。参见图6。一些ICK 基序肽的长度介于26-60个氨基酸之间。一些ICK基序蛋白的长度介于16-48个氨基酸 之间。一些ICK基序蛋白的长度介于26-48个氨基酸之间。一些ICK基序蛋白的长度介 于30-44个氨基酸之间。具有天然杀虫活性的ICK基序蛋白是优选的，但是具有其它类型 的活性（例如耐盐性和耐霜性）的ICK基序蛋白是本领域技术人员已知的和本文要求保护 的。杀虫ICK基序蛋白的实例包括ACTX肽和基因，并包括所有的肽及其称为Magi6的编码 基因。
[0172] 如下图不的蛋白质表达ORF的Iv实例可以是ICK基序蛋白表达ORF : ersp-sta-{接头「ick^^^ersp-ijckj-接头 h N-sta 对于其它CRIP肽，可写出类似的表达式。在该部分中，表达ORF的这个实例是用于高 肽表达的表达0RF，并以ICK蛋白为最佳实例。上图为表达ICK基序蛋白复合物的多核苷 酸可读框（ORF)，所述复合物可描述为 ERSP-STA- (LINKER1-ICig N 或 ERSP- (IcK1-LINKERi) n-STA，或 ErSP-STA-(Li-ICK1)n 或 ErSP-(ICK1-Li)n-STA,含有 4 种可能的肽组分，各组分用 短划线符号分隔。在该图中，#5/7的核苷酸组分是编码植物内质网运输信号肽（ERSP)的 多核苷酸区段。的组分是编码翻译稳定性蛋白（STA)的多核苷酸区段，其有助于表达的 ICK基序蛋白在植物中蓄积但可能不是ICK基序蛋白表达ORF必需的。A的组分是编码将 ICK基序蛋白彼此分隔和与翻译稳定性蛋白分隔开来的间插接头肽（L或LINKER)的多核苷 酸区段，下标"i"表示不同类型的接头肽可用于ICK基序蛋白表达0RF。在不用于ICK 基序蛋白表达ORF的情况下，#5/7可不用接头与编码ICK基序蛋白的多核苷酸直接连接。 的组分是编码ICK基序蛋白（ICK)的多核苷酸区段，下标"j"表示不同的ICK基序蛋 白；（兹矣i-icW"表示编码间插接头肽和ICK基序蛋白的核苷酸结构可在相同的ICK基 序蛋白表达ORF的同一可读框中重复"N"次，其中N可以是1-10的任何整数，且重复序列可 含有编码不同间插接头和不同ICK或CRIP基序蛋白的多核苷酸区段。在相同ICK或CRIP 基序蛋白表达ORF内包括重复序列的不同的多核苷酸区段全都在同一翻译框内。
[0173] 杀虫ICK基序蛋白的实例包括ACTX肽和基因，并包括上文和本文提供的参考文献 中描述的所有肽及其编码基因。所公开的用于提供实例的目的并且无意以任何方式限制 的ICK基序蛋白和肽的具体实例，是上述肽及其同源物，特别是来源于澳大利亚漏斗网蜘 蛛毒液的肽和核苷酸。下列美国的文件通过引用以其整体予以结合，是本领域技术人员已 知的，并且全已发表。它们公开了许多ICK基序蛋白，其完整肽序列、其完整核苷酸序列已 明确公开，并通过引用予以结合，此外完整的公开内容（包括其所有序列表）均通过引用予 以结合。参见以下文献：2008年4月8日授予专利权的US 7,354,993 B2,具体地说来自 7, 354, 993 B2的作为序列1-39列于其中的肽和核苷酸序列，和名为U-ACTX多肽的那些、 可形成2-4个链内二硫桥的这些和其它毒素及其变体，以及7, 354, 993 B2的第4-9列和图 2中出现的肽。其它具体的序列可见于2008年10月8日公布和授予专利权的欧洲专利1 812 464 B1，参见Bulletin 2008/41，具体地说，序列表列出的肽和核苷酸序列，和可形成 2-4个链内二硫桥的那些其它毒素，和其中以1-39列出的那些序列，和名为U-ACTX多肽的 序列及其变体，以及欧洲专利1 812 464 Bl的段落0023-0055中出现的和图1中出现的肽。
[0174] 参照本文鉴定的肽描述和予以结合的是所提及的序列的同源变体，与本文提及的 这样的序列具有同源性，其按照本文所述处置方法也被鉴定为适于特别制备并要求保护， 包括与本文公开的任何序列或与通过引用结合的任何序列具有至少任何下列百分比同一 性的全部同源序列：与上述专利鉴定的任何和所有序列、与本文鉴定的任何其它序列（包 括本申请序列表中的每一个序列）有 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%或99%或更大的同一性或100%同一性。当本文以数值（例如50%或更大）使用术 语同源或同源性时，则意味着是两个肽之间的百分比同一性或百分比相似性。当不用数字 百分比使用同源或同源性时，则是指在进化或发育方面密切相关的两个肽序列，因为它们 有共同的生理和功能方面，像局部毒性和类似的大小（即同源物在本文明确提及的或通过 本文的上述参考文献鉴定的肽的长100%的长度或短50%的长度内）。
[0175] 通过参照本文鉴定的肽描述和予以结合包括以下的毒肽：存在于、分离自或来源 于以下蝴蛛的肽及其变体：澳毒蝴蛛属或属，包括属种rersWia或 布鲁山脉漏斗网蝴蛛、Jtrax ro/wsiiAs、Jirax /brffiit/aAi/is、Jirax ;包括称为 U-ACTX多肽、U-ACTX-Hvla、rU-ACTX-Hvla、rU-ACTX-Hvlb的毒素或突变体或变体，尤其这 些类型任一种的肽和尤其小于约200个氨基酸但大于约10个氨基酸的肽，和尤其小于约 150个氨基酸但大于约20个氨基酸的肽，尤其小于约100个氨基酸但大于约25氨基酸的 肽，尤其小于约65氨基酸但大于约25氨基酸的肽，尤其小于约55氨基酸但大于约25氨基 酸的肽，尤其约37或39或约36-42个氨基酸的肽，尤其具有小于约55个氨基酸但大于约 25个氨基酸的肽，尤其具有小于约45个氨基酸但大于约35个氨基酸的肽，尤其具有小于约 115个氨基酸但大于约75个氨基酸的肽，尤其具有小于约105个氨基酸但大于约85个氨基 酸的肽，尤其具有小于约100个氨基酸但大于约90个氨基酸的肽，包括可形成2、3和/或 4个或更多个链内二硫桥的本文提及的任何长度的肽毒素，包括破坏钙通道电流的毒素、包 括破坏钾通道电流的毒素、尤其破坏昆虫I丐通道或其Us的毒素、尤其任何这些类型的毒素 或其变体，和具有口服或局部杀虫活性、可通过本文所述处置方法特别制备的本文所述任 何类型的毒素的任何组合。
[0176] 来自澳大利亚漏斗网蜘蛛澳毒蜘蛛属和你属的U肽当通过本发明所述 方法、程序或处置方法处理时特别适宜且运作良好。本文提供这类所测试并具有数据的合 适肽的实例。还明确已知下列物种携带通过本发明的处置方法适于植物表达成为PIPs的 毒肤。下列物种具体命名为：ro/wsiiAs、 rersWia。来源于上列任何属和/或属种和与U肽同源 的任何毒肽适于按照本发明的处置方法植物表达成为PIPS。
[0177] 本说明书中的实例无意且不应用来限制本发明，它们仅供说明本发明。
[0178] 如上所述，许多肽是作为用于植物表达成为PIP的处置方法主题的合适候选物。 上文、下文和序列表中所述序列是可在植物中作为PIP表达的特别合适的肽，且这些肽中 的一些已经作为本发明的PIP在植物中表达，其结果见下列实例。
[0179] GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A (SEQ ID NO. 5) 名为"U+2-ACTX-Hvla"，在5-20、12-25、19-39位上具有二硫桥。分子量为4564. 85道 尔顿。ICK基序杀虫蛋白的另一个实例： QYCVP VDQPC SLNTQ PCCDD ATCTQ ERNEN GHTVYYCRA (SEQ ID NO: 6) 名为"U-ACTX-Hvla"，在3-18、10-23、17-37位上具有二硫桥。分子量为4426. 84道尔 顿。
[0180] 其它实例包括序列表中的许多序列。
[0181] III.翻译稳定性蛋白组分STA或Wa。
[0182] ICK基序蛋白表达ORF之一 ERSP-ICK，足以在转化植物中表达正确折叠的ICK基 序肽，但为了有效地保护植物免遭害虫损害，植物表达的ICK基序蛋白必须蓄积到杀虫水 平。随着正确构建的ICK基序蛋白表达ORF的转化，转基因植物可表达并蓄积更大量的正 确折叠的ICK基序蛋白。当植物蓄积更大量的正确折叠的毒肽时，可更容易地对抗或杀死 攻击和摄食植物的昆虫。翻译稳定性蛋白可用来显著增加毒肽在植物中的蓄积，因此提高 PIP的效能（尤其当PIP具有自身的翻译稳定性蛋白时）。参见图2-5中和下文所用各种 线性示图或等式样表达式中STA如何可用于表达ORF的各种表述。翻译稳定性蛋白可为另 一种蛋白质的结构域或可包含完整的蛋白质序列。翻译稳定性蛋白是一种具有充足三级结 构的蛋白质，它可在细胞中蓄积而又不会成为蛋白质降解的细胞过程的目标。蛋白质可介 于5和50aa之间（例如另一种ICK基序蛋白）、50-250aa (GNA)、250-750aa (例如几丁质 酶）和750-1500aa (例如增强蛋白）。
[0183] 除图2-5以外，下面的线性示图描述了编码与ICK基序蛋白融合的稳定性蛋白的 ICK基序蛋白表达ORF的一个实例： ersp s ta -I ~i ck 该蛋白质或蛋白质结构域可含有除翻译稳定以外没有有用特性的蛋白质，或它们可具 有除翻译稳定以外的其它有用特性。有用特性可包括：另外的杀虫活性，例如对围食膜是破 坏性的活性、对肠壁是破坏性的活性和/或主动将ICK基序蛋白跨过肠壁转运的活性。翻 译稳定性蛋白的一个实施方案可以是包括ICK基序蛋白的融合蛋白的聚合物。本文提供翻 译稳定性蛋白的一个具体实例以说明翻译稳定性蛋白的用途。该实例无意以任何方式限制 本公开内容或权利要求书。有用的翻译稳定性蛋白是本领域众所周知的，如本文所公开的， 可以使用这种类型的任何蛋白质。评价和测试肽产生的程序均是本领域已知的，并且在本 文中予以描述。一种翻译稳定性蛋白的一个实例是SEQ ID NO: 7, 一字母代码如下： ASKGE ELFTG VVPIL VELDG DVNGH KFSVS GEGEG DATYG KLTLK FICTT GKLPV PffPTL VTTFS YGVQC FSRYP DHMKR HDFFK SAMPE GYVQE RTISF KDDGN YKTRA EVKFE ⑶TLV NRIEL KGIDF KEDGN ILGHK LEYNY NSHNV YITAD KQKNG IKANF KIRHN IEDGS VQLAD HYQQN TPI⑶ GPVLL PDNHY LSTQS ALSKD PNEKR DHMVL LEFVT AAGIT HGMDE LYK (SEQ ID NO: 7)。名为 "GFP"。 分子量为26736. 02道尔顿。
[0184] 在一些实施方案中，STA甚至可以是CRIP或ICK，如图5所示。在这些实施方案中， 没有单独的STA蛋白，STA蛋白与所用的CRIP或ICK相同。可以是同一个ICK与LINKER 结合，或可能有不同的ICK，一种类型与LINKER结合，另一种类型起STA的作用。在LINKER 部分还论述了这些替代的排布。
[0185] 翻译稳定性蛋白的其它实例可见于下列参考文献，通过引用以其整体予以结 合：Kramer, K. J.等· "Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta (编码Manduca Sezia 表皮和肠几 丁质酶的基因的 cDNA 序列和表达）" /aseci SiocAeffii1Stry aflt/ifo/ecw/ar 第23卷，第6期，1993年9月，第691-701页。Kramer，K.J.等人从烟草天蛾幼虫 ifeflt/wca Sezia 中分离出几丁质酶编码 cDNA 并测序。Hashimoto, Y.等."Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the /?i granulosis virus (编码粉纹夜蛾颗粒体病病毒的病毒增强因子的基 因的定位和核昔酸序列）" o/ （1991)，72，2645-2651。 Hashimoto, Y.等人克隆了编码粉纹夜蛾/?i)颗粒体病病毒的病毒增强因 子的基因并测定了完整的核苷酸序列。Van Damme, E.J.M.等· "Biosynthesis, primary structure and molecular cloning of snowdrop {Gal an thus nivalis L.) lectin (雪 花莲/?i ra7i5· L.)凝集素的生物合成、一级结构和分子克隆）" /oaraa/ o/202，23-30 (1991)。Van Damme，E.J.M.等人从成熟子房中 分离出雪花莲凝集素（GNA)的富含Poly (A)的RNA，当在无麦胚细胞系统中翻译时产生单一 的17-kDa凝集素多肽，称为凝集素（agglutin)。这些参考文献和其它文献教导和公开了可 用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构建体的翻译稳定性蛋白。
[0186] IV. PEPs的间插接头肽组分LINKER、接头、L或如果为多核苷酸:兹矣或/ 本发明所述的ICK基序蛋白表达ORF还在编码ICK基序蛋白（id)和翻译稳定性蛋白 Gte)的多核苷酸序列之间，或在编码多个ICK基序蛋白结构域的多核苷酸序列 或之间（如果表达ORF包括多个ICK基序蛋白结构域表达）掺入了编码间插接 头肽的多核苷酸序列。间插接头肽（LINKERS)将表达的ICK基序蛋白复合物分隔成不同的 部分，有助于在表达过程期间复合物的不同部分的正确折叠。在表达的ICK基序蛋白复合 物中，不同的间插接头肽可涉及隔开不同的功能结构域。具有LINKER的蛋白质的各种表述 见（图3-5)。LINKER与CRIP (例如ICK)连接，并且该二价体类型（bivalent group)可 重复至多10次（N=I-IO)，可能甚至超过10次，以利于正确折叠的杀虫肽在被保护的植物中 蓄积。
[0187] 间插接头肽的长度通常介于1和30个氨基酸之间。在植物中在表达的ICK基序 蛋白复合物中它不是必需的基本组分。可将可切割的接头肽设计到ICK基序蛋白表达ORF 中，以在转化的植物中从表达的ICK基序蛋白复合物中释放正确折叠的ICK基序蛋白，来 改进ICK基序蛋白对植物保护免遭虫害。间插接头肽的一种类型是植物可切割的接头肽。 在植物细胞中在翻译后表达过程中，这种类型的接头肤可从表达的ICK基序蛋白表达复合 物中完全去除。因此，通过这种类型的间插接头肽连接的正确折叠的ICK基序蛋白可在翻 译后表达过程期间，在植物细胞中从表达的ICK基序蛋白复合物中释放。在此我们显示了 LINKER的许多实例。
[0188] 可切割的间插接头肽的另一种类型在植物中在表达过程中是不可切割的。然而， 它具有对丝氨酸、苏氨酸、光胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶有特异性的蛋白酶切割 位点。该类型的可切割接头肽被存在于昆虫和鳞翅类肠环境和/或昆虫血淋巴和鳞翅类血 淋巴环境中的蛋白酶消化，以将ICK基序蛋白释放到昆虫肠或血淋巴中。在此我们显示了 LINKER的许多实例。这些接头只作为实例提供，并不应视为限制本发明。利用本公开内容 所教导的信息，对于本领域的技术人员而言，制备或发现可用于本发明的LINKER的其它实 例应是一个常规事件。
[0189] 说明本发明的间插接头的可切割类型的一个实例列于SEQ ID NO: 1中，但是可 切割接头不限于该实例。SEQ ID NO: 1 (-字母代码）为IGER，在本文我们将其命名为 "IGER"。该间插接头或LINKER的分子量为473. 53道尔顿。
[0190] 间插接头肽（LINKER)还可以是没有任何类型的蛋白酶切割位点的间插接头，即 不可切割的间插接头肽。其一个实例为接头ETMFKHGL (SEQ ID NO. 3)。
[0191] 间插接头肽的其它实例可见于下列参考文献，其通过引用以其整体予以结合：在 Heath 等· "Characterization of the protease processing sites in a multidomain proteinase inhibitor precursor from Nicotiana alata (来白 TVYcotfafla alata ^ 多结构域蛋白水解酶抑制物前体中蛋白酶加工位点的表征）" European Journal of Biochemistry, 1995; 230: 250-257中发现植物表达的丝氨酸蛋白水解酶抑制物前体含 有被6个相同接头肽分隔的5种同源的蛋白质抑制物。在Chang, H. C.等."De novo folding of GFP fusion proteins: high efficiency in eukaryotes but not in bacteria (GFP融合蛋白的从头折叠：在真核生物但非细菌中高效率）" /oaraW 〇/ ifohcWar 沿〇/〇灯，2005年10月21日；353(2): 397-409中，探索了绿色荧光蛋白通过6种不同 接头的折叠行为的比较。在 Daskalova, S.M.等人"Engineering of N. benthamiana L. plants for production of N-acetylgalactosamine-glycosylated proteins (用 于产生N-乙酰半乳糖胺糖基化蛋白质的N. benthamiana L.植物的工程改造）" 沒2010 年 8 月 24 日；10: 62 中表明人GalNAc-Ts 家族的同种型 GalNAc-T2 在Λ 植物中表达时保持其定位和功能性。在Kwok, E. Y.等."GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in plastid stromules and traffic between plastids (GFP标记的核酮糖二磷酸羧化酶一加氧酶和天冬氨酸氨基转 移酶存在于质体基质填充小管中并在质体间运输）" 2004年3月；55(397) : 595-604.电子出版物2004年1月30日中，表明了内源质 体蛋白质通过基质填充小管移动的能力。Borovsky, D.等人"Expression of Aedes trypsin-modulating oostatic factor on the virion of TMV: A potential larvicide (TMV病毒体中伊蚊胰蛋白酶-调节抑卵因子的表达：潜在的杀幼虫剂）他以Jcai/ 2006年12月12日；103(50): 18963 - 18968提交了有关用蚊十肽激素胰蛋白酶-调 节抑卵因子（TMOF)对烟草花叶病毒（TMV)病毒体表面的工程改造的报告。这些参考文献 和其它文献教导和公开了可用于本文描述的方法、程序及肽、蛋白质和核苷酸复合物和构 建体的间插接头。
[0192] 上述ICK基序蛋白表达ORF可瞬时或稳定地克隆到任何植物表达载体中用于植物 中的ICK基序蛋白表达。
[0193] 瞬时植物表达系统 对于植物中的一些特殊ICK基序蛋白表达，瞬时植物表达系统可用来迅速优化ICK基 序蛋白表达ORF的结构，包括一些组分的必要性，一些组分的密码子优化，各组分的顺序的 优化等。瞬时植物表达载体常常来源于植物病毒基因组。由于植物病毒的感染性质所致， 植物病毒载体在植物中提供快速和高水平的外源基因表达的优势。全长的植物病毒基因组 可用作载体，但常常剔除病毒组分，例如外被蛋白，将转基因 ORF亚克隆到该位置上。ICK基 序蛋白表达ORF可亚克隆至这个位点以产生病毒载体。这些病毒载体可被机械地导入植物 中，因为它们本身是感染性的，例如通过植物伤口、喷射等。它们还可通过农杆菌感染法，通 过将病毒载体克隆至根癌细菌根癌农杆菌或发根细菌发根 农杆菌a? rAizogefles)的T-DNA中，来转化至植物中。该载体中ICK基序蛋 白的表达受RNA病毒复制的控制，而将病毒翻译成mRNA用于复制受强病毒启动子的控制， 例如，来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。具有ICK基序蛋白表达ORF的病毒载体通常克 隆至二元载体中的T-DNA区域，所述二元载体自身可在大肠杆菌菌株和农杆菌属菌株两者 中重复。植物的瞬时转化可通过用含有用于ICK基序蛋白表达的病毒载体的农杆菌细胞浸 润植物叶来进行。在瞬时转化的植物中，由于转录后基因沉默（PTGS)所致，外源蛋白质表 达在短时间内停止是常见的。有时PTGS抑制性蛋白质基因必须与用ICK基序蛋白表达ORF 驱动表达的相同类型的病毒载体一起瞬时共转化植物。这改进和延长ICK基序蛋白在植物 中的表达。最常用的PTGS抑制性蛋白质是自番茄丛矮病毒（TBSV)发现的P19蛋白。
[0194] 瞬时植物表达的证明可见于图7。
[0195] 图7显示瞬时表达的植物转基因蛋白。图7中报告了通过ELISA测定的与％ TSP 相比ICK蛋白的相对蓄积。在图7中，有4种变化的ICK表达0RF，说明ERSP对得到正确 折叠的ICK和STA对得到蛋白质蓄积的必要性。条形柱A报告了表达SEQ ID NO: 8即无 任何融合的ω肽（ICK)的FECT表达系统。条形柱B报告了表达SEQ ID NO: 9即与ω肽 (ICK)融合的BAAS ERSP的TRBO表达系统。条形柱C报告了表达SEQ ID NO: 10即与融 合杂合毒素（ICK)的IGER (接头）融合的GFP (STA)的FECT表达系统。条形柱D报告了 表达SEQ ID NO: 11即与融合与杂合毒素（ICK)融合的IGER (接头）的GFP (STA)融合的 BAAS (ERSP)的FECT表达系统。条形柱A和B的检测水平显示可忽略的蛋白质检测。在 条形柱A中，这可能是因在ER中发生的ICK的未正确折叠所致，在条形柱B中，这可能是因 正确折叠但因缺乏STA而无蓄积所致。在条形柱C和D中有可检测水平。当进行条形柱C [(SEQ ID NO: 10)，一种与融合杂合毒素（ICK)的IGER (接头）融合的GFP (STA)]的实 验时，有检出的高水平的GFP荧光（数据未显示），表明了大量TSP是融合蛋白，然而，当进 行ELISA时，只检出0. 01%的TSP，这可能是由于缺乏正确折叠所致，所述正确折叠未发生， 因为这种蛋白质没有导向在其中发生折叠的ER。用于ELISA的抗体只检测正确折叠的蛋 白质的三级结构。当进行条形柱D [SEQ ID N0:11，一种与融合与杂合毒素（ICK)融合的 IGER (接头）的GFP (STA)融合的BAAS (ERSP)]的实验时，有一些检出的GFP荧光和蓄积 0. 1%的TSP即与GFP融合的ICK肽。当条形柱A、B、C和D的数据合在一起时，显然，为了 得到正确折叠，ICK表达ORF中的ERSP是必需的，而对于增加肽的蓄积，STA是必需的。
[0196] 我们证实并记载了在使用设计用于引导表达的不同FECT载体瞬时转化的烟草叶 中GFP-杂合融合蛋白构建体的绿色荧光的GFP发射。我们在使用用于APO (质外体定位） 蓄积的PFECT-BGIH载体、用于CYTO (胞质定位）蓄积的pFECT-GIH载体和用于ER (内质 网定位）蓄积的PFECT-BGIH-ER载体中获得成功。数据未显示。
[0197] 我们证实并记载了用在不同类型的ERSP瞬时转化的烟草叶中GFP-杂合融合蛋白 构建体的绿色荧光的GFP发射。我们在证实用pFECT-BGIH载体的表达、用FECT-EGIH载体 的表达和用pFECT-E*GIH载体的表达中获得成功。数据未显示。
[0198] 我们测量了肽蓄积的水平，这显示于图8和9中。图8是具有不同蓄积定位的烟 草瞬时表达的GFP融合的U-ACTX-Hvla的iELISA检测的％TSP图。APO :质外体定位；CYTO : 胞质定位；ER :内质网定位。图9是使用编码具有3种不同ERSP序列的翻译融合物的FECT 表达载体，烟草叶瞬时表达GFP融合的U-ACTX-Hvla的iELISA检测的％TSP图：BAAS信号 肽（BGIH)、伸展蛋白信号肽（EGIH)和修饰的伸展蛋白信号肽（E*GIH)。
[0199] 采用稳定植物转化技术使蛋白质表达ORF整合至植物基因组 采用稳定植物转化技术，ICK基序蛋白表达ORF还可整合至植物基因组，因此，ICK基序 蛋白可在植物中稳定表达，并世世代代保护转化的植物。对于植物的稳定转化，ICK基序蛋 白表达载体可以是环状的或线性的。几个关键组分必须包括在载体DNA中。为了稳定植物 转化，可根据上述瞬时植物表达中的研究，应仔细设计用于在植物中最佳表达的ICK基序 蛋白表达〇RF。ICK基序蛋白的表达通常受在转基因植物所有细胞的一些中启动转录的启 动子控制。启动子可以是强植物病毒启动子，例如，来自花椰菜花叶病毒（CaMV)的组成型 35S启动子；它也可以是强植物启动子，例如来自拟南芥ClraAiorOAsi1S iAa/iaaa)的氢过 氧化物裂解酶启动子（pHPL)、来自大豆的Glycine max多聚遍在蛋白（Gmubi)启动子、来自 不同植物物种（稻、玉米、马铃薯等）等的遍在蛋白启动子等。植物转录终止子常常出现在 ORF的终止密码子之后以停止RNA聚合酶和mRNA的转录。为了评价ICK基序蛋白表达，报 道基因可包括在ICK基序蛋白表达载体中，例如用于⑶S染色测定的β -葡糖醛酸糖苷酶 基因（GUS)、用于紫外线下的绿色荧光检测的绿色荧光蛋白（GFP)基因等。对于转化植物的 选择，选择标记基因通常包括在ICK基序蛋白表达载体中。标记基因表达广物可提供对特 定抗生素（例如卡那霉素、潮霉素等）或特定除草剂（例如草甘膦等）有抗性的转化植物。 如果农杆菌感染法技术用于植物转化，则T-DNA左边界和右边界序列也包括在ICK基序蛋 白表达载体中以将T-DNA部分转运到植物中。可采用多种转化技术，将构建的ICK基序蛋 白表达载体转化到植物细胞或组织中。农杆菌感染法是一种使用根癌农杆菌菌株或发根农 杆菌菌株转化植物的非常普遍的方法。粒子轰击（亦称基因枪或生物射弹（Biolistics)) 技术也非常普遍地用于植物转化。其它不太常用的转化方法包括组织电穿孔、碳化硅晶须、 DNA直接注射等。在转化后，将转化的植物细胞或组织放入植物再生培养基中，以将转化的 植物细胞或组织成功地再生为转基因植物。转化的植物中ICK基序蛋白表达ORF的整合和 表达的评价可如下进行。
[0200] 转化植物的评价 转化植物的评价可在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平上进行。稳定转化的植物可在所 有这些水平上评价，而瞬时转化的植物通常只在蛋白质水平上评价。为了确保ICK表达基 序蛋白表达ORF整合到稳定转化的植物的基因组中，可从稳定转化的植物组织中提取基因 组DNA用于PCR评价或DNA印迹法应用。稳定转化的植物中ICK基序蛋白的表达可在RNA 水平上评价，即可从转化的植物组织中提取总mRNA，并可将RNA印迹法技术和RT-PCR技术 应用于定性或定量评价ICK基序蛋白的mRNA水平。转化植物中ICK基序蛋白的表达也可 直接在蛋白质水平上评价。存在许多评价在转化植物中表达的ICK基序蛋白的方法。如果 报道基因连同ICK基序蛋白表达ORF转化到植物中，则可进行报道基因测定法以初步评价 转化的ICK基序蛋白表达ORF的表达，例如用于⑶S报道基因表达的⑶S染色测定、用于 GFP报道基因表达的绿色荧光检测实验、用于萤光素酶报道基因表达的萤光素酶测定等。此 夕卜，可从转化的植物组织中提取的表达的总蛋白质用于直接评价转化的植物中的ICK基序 蛋白的表达。提取的表达的总蛋白质样品可用于Bradford测定法以评价样品中总的蛋白 质水平。分析型HPLC色谱技术、蛋白质印迹技术或iELISA测定法可用于定性或定量评价 从转化的植物组织中提取的总蛋白质样品中的ICK基序蛋白。还可在昆虫生物测定中，通 过使用从转化的植物组织中提取的总蛋白质样品，来评价ICK基序蛋白表达。最后，可在昆 虫生物测定中测试转化的植物组织或完整的转化植物以评价ICK基序蛋白表达及其对植 物的保护。
[0201] 我们如下提供了第I部分的详细描述和摘要： 我们描述了包含与富含半胱氨酸的杀虫蛋白（CRIP)例如抑制物半胱氨酸结（ICK) 基序蛋白有效连接的内质网信号肽（ERSP)的蛋白质，其中所述ERSP是所述蛋白质 (ERSP-ICK)的N端。ERSP是将表达的CRIP导向植物细胞的内质网的任何信号肽。CRIP 可以是抑制物半胱氨酸结（ICK)蛋白或非ICK蛋白。ERSP是来源于植物的长度为5-50个 氨基酸的肽，其与翻译稳定性蛋白（STA)有效连接，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端， 并且间插STA序列可在CRIP的N端一侧，CRIP任选为ICK基序蛋白（ERSP-STA-ICK)或非 ICK基序蛋白（ERSP-STA-非ICK);或间插STA序列可在ICK或非ICK基序蛋白的C端一侧 (ERSP-ICK-STA)或（ERSP-非ICK-STA)。ERSP是长度介于3-60个氨基酸之间的肽，或长 度介于5-50个氨基酸之间的肽，或长度介于20-30个氨基酸之间的肽。它可来源于植物， 具有SEQ ID NO 4的大麦α淀粉酶信号肽（BAAS)。ERSP可以是具有SEQ ID NO 18的烟 草伸展蛋白信号肽的肽。ERSP可以是具有SEQ ID NO 19的修饰的烟草伸展蛋白信号肽或 来自aiei的具有SEQ ID NO 27的Jun a 3信号肽。
[0202] 我们描述了一个CRIP实例，其是长度介于16和60个氨基酸之间、长度介于26和 48个氨基酸之间、长度介于30和44个氨基酸之间的ICK基序蛋白，其中它选自具有抑制性 半胱氨酸结基序的任何肽或肽源，或杀虫肽，且其中它是包括澳毒蜘蛛属或属 的任何肽或肽源、来源于rerMia的任何肽，为一种ACTX肽。ICK基序蛋白是 任何杀虫肽及其片段，包括所述肽和序列号的成熟、前肽和肽原形式以及肽区段的任何突 变或缺失或添加但仍保持抑制性半胱氨酸结结构。ICK基序蛋白可以是具有SEQ ID NO: 6 的U-ACTX-Hvla、具有SEQIDN0:24的ω-ACTX-Hvla、κ-ACTX-Hvlc。一种表达0RF，其包 含编码这些肽的任何核苷酸。一种表达0RF，其包含编码整合到转基因植物基因组中的肽的 任何核苷酸。本文所述任何肽或核苷酸在制备或转化植物或植物基因组从而在转化的植物 中表达正确折叠的杀虫肽，和/或制备或转化植物或植物基因组从而在转化的植物中表达 正确折叠的杀虫肽并引起表达和正确折叠的杀虫肽在所述植物中蓄积并使植物对虫害的 抗性提高中的用途。我们描述了使用核苷酸产生具有或表达本文所述任何肽的转基因植物 和转化植物的程序。我们描述了由这些产物和处置方法的任一种制备的转化植物。
[0203] 我们描述了包含与任选为与翻译稳定性蛋白（STA)有效连接的抑制物半胱氨酸 结（ICK)基序蛋白或非ICK蛋白的CRIP有效连接的内质网信号肽（ERSP)的蛋白质，其中 所述ERSP是所述蛋白质的N端，间插翻译稳定性蛋白序列可以在ICK基序蛋白的N端一侧 (ERSP-STA-ICK)或任选（ERSP-非 ICK-STA)或 ICK 基序蛋白的 C 端一侧（ERSP-ICK-STA) 或 ERSP-STA-非 ICK)。
[0204] 我们描述了分子量为12 kD和12 kD以上的这类STA，其中所述STA可以是多种 蛋白质，包括分子量为12 kD和12 kD以上的ICK基序蛋白，或分子量为12 kD和12 kD以 上的与接头肽（L)连接的多个ICK基序蛋白，例如ERSP-ICK-(Li-ICKj) N或ERSP-(ICKj-Li) N_ICK。我们解释了接头肽可以是相同的或不同的。我们表明一种STA是来源于水母的具 有SEQ ID NO 13的绿色荧光蛋白质（GFP)，STA可以是具有SEQ ID NO 28的雪花莲凝集素 凝集素（GNA)，并且 STA可以是具有 SEQ ID NO 26的/仙//?6?/7/5· asAei 蛋白质Jun a 3。
[0205] 我们描述了 LINKER是长度为4-20个氨基酸的任何肽。我们描述了作为含有蛋白 酶识别位点的任何肽的LINKER。我们描述了 LINKER为含有植物蛋白酶切割位点的任何肽。 我们描述了 LINKER是含有 IGER (SEQ ID N0:1)、EEKKN (SEQ ID N0:2)和（SEQ ID NO: 3) 的氨基酸序列的肽。我们描述了 LINKER为可在昆虫消化系统中或在昆虫血淋巴中被切割 的任何肽。我们描述了 LINKER，其中所述LINKER是含有胰蛋白酶切割位点的肽。
[0206] 我们描述了编码所述任何蛋白质的核苷酸，包括包含编码所述肽的任何核苷酸的 表达ORF，以及包含编码所述肽的任何核苷酸的表达ORF，其整合到转基因植物基因组中， 以及转化到植物或植物基因组中从而在转化的植物中表达正确折叠的杀虫肽，以及转化到 植物或植物基因组中从而在转化的植物中表达正确折叠的杀虫肽并引起表达和正确折叠 的杀虫肽在所述植物中蓄积并使植物对虫害的抗性提高。我们描述了产生于这些描述的转 基因植物和具有或表达本文所述任何肽的转化植物。
[0207] 我们解释和描述了包含编码本文所述肽的任何核苷酸的表达ORF以及整合到转 基因植物基因组中的表达0RF，这样做的一个原因是制备或转化植物或植物基因组从而在 转化的植物中表达正确折叠的杀虫肽，且这样做的一个原因是使转化的植物引起表达和正 确折叠的杀虫肽在所述植物中蓄积并使植物对虫害的抗性提高。我们教导了如何使用这些 程序，并表达本文所述肽和本领域的技术人员鉴于本文教导和使用本文所述任何产物和处 置方法使用的任何其它肽，来制备转基因植物。
[0208] 我们教导了如何制备这样的蛋白质，其包含有效连接与有效连接间插接头肽（L) 的翻译稳定性蛋白（STA)有效连接的抑制物半胱氨酸结（ICK)基序蛋白的内质网信号肽 (ERSP)，其中所述ERSP是所述蛋白质的N端，且所述LINKER介于STA和ICK基序蛋白之 间，所述翻译稳定性蛋白可位于ICK基序蛋白的N端一侧（上游）或ICK基序蛋白的C端 一侧（下游），并描述为 ERSP-STA-L-ICK 或 ERSP-ICK-L-STA。我们解释了上述 ERSP、CRIP 和ICK、LINKER、STA可以是本文描述的任何肽和本领域的技术人员鉴于本文教导内容并使 用本文所述任何产物和处置方法使用的任何其它肽。
[0209] 我们教导了如何制备这样的蛋白质，其包含有效连接与有效连接间插接头肽（L) 的翻译稳定性蛋白（STA)有效连接的多个抑制物半胱氨酸结（ICK)基序蛋白结构域（其中 ICK基序蛋白通过间插接头肽（L)彼此连接）的内质网信号肽（ERSP)，其中所述ERSP是所 述蛋白质的N端，所述LINKER介于STA和多个ICK基序蛋白结构域之间，且所述STA可位于 多个ICK基序蛋白结构域的N端一侧（上游）或多个ICK基序蛋白结构域的C端一侧（下 游），并描述为 ERSP-STA-(Li-ICKj)N 或 ERSP-(ICKj-Li)N-STAt5
[0210] 我们教导了如何制备编码这些蛋白质的核苷酸，即表达ORF ;如何制备并将所述 核苷酸整合至转基因植物基因组、嵌合基因、重组载体、转基因宿主细胞、转基因植物细胞、 转基因植物，所述转基因植物为玉米、大豆、棉、稻、小麦、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯、 番茄、烟草、任何绿叶蔬菜或任何果树或本文提及的任何植物和物种和来自这些程序的转 基因植物的种子，其中所述种子包含嵌合基因。 实施例
[0211] 本说明书中的实施例无意且不应用来限制本发明；它们仅供说明本发明。
[0212] 实施例1 两个瞬时植物表达系统之间的表达比较。
[0213] 采用瞬时植物转化技术以快速优化ICK基序蛋白表达ORF用于植物表达。用植物 病毒载体的农杆菌感染法技术因其高效率、简易和便宜而在此处被用于瞬时植物转化。本 文针对植物中的ICK基序蛋白表达，评价了两个病毒瞬时植物表达系统。一个是烟草花叶 病毒过量表达系统（TRBO, Lindbo JA, Plant Physiology, 2007，V145: 1232-1240)。 TRBO DNA载体具有用于农杆菌感染法的T-DNA区域，其含有驱动没有编码病毒外被蛋白的 基因的烟草花叶病毒RNA表达的CaMV 35S启动子。另一个病毒瞬时植物表达系统是FECT 表达系统（Liu Z 和 Kearney CM, BMC Biotechnology, 2010，10:88)。FECT 载体也含有 用于农杆菌感染法的T-DNA区域，其含有驱动没有编码病毒外被蛋白的基因和三基因框的 狐尾草花叶病毒RNA表达的CaMV 35S启动子。两个表达系统使用"无害的"病毒基因组，因 此，可有效地防止病毒植物-植物间的传递。为了有效表达所导入的异源基因，FECT表达系 统还需要共表达P19, 一种来自番茄丛矮病毒的RNA沉默抑制蛋白，以防止所导入的T-DNA 的转录后基因沉默（PTGS)。（TRBO表达系统不需要P19的共表达）。如下文所述，通过烟 草〇Vicoiia/?a 中ICK基序蛋白的瞬时表达，对两个瞬时植物表达系统进行 了测试和比较。
[0214] ICK基序蛋白表达ORF被设计成可编码一系列翻译融合的结构基序，描述如下： Ν' -ERSP-Sta-L-ICK-C'。在此用于表达的ICK基序蛋白是U-ACTX-Hvla，其具有下列氨基 酸序列（Ν'至C'，一字母代码）： QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID NO: 12) 在此所用的ERSP基序为大麦α淀粉酶信号肽（BAAS)，其包含如下所示的24个氨基酸 (Ν'至C'，一字母代码）： MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG (SEQ ID NO: 4) 在该表达ORF中的稳定性蛋白（Sta)是绿色荧光蛋白（GFP)，其具有如下的氨基酸序列 (Ν'至C'，一字母代码）： MASKGEELFTGVVPILVELD⑶VNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCF SRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGNYKTRAEVKro⑶TLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSH NVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVT AAGITHGMDELYK (SEQ ID NO: 13) GFP和U-ACTX-Hvla间的接头肽含有胰蛋白酶切割位点并具有以下所示的氨基酸序列 (Ν'至C'，一字母代码）： IGER (SEQ ID NO: 1) 按照ICK基序表达ORF式，该特定的ICK表达ORF可描述为BAAS-GFP-IGER-杂合体或 BGIH。BGIH ORF通过在其5'端加入Pac I限制位点和在其3'端加入Avr II限制位点来 化学合成。合成BGIH的序列如下： TTAATTAAATGGCTAATAAACACCTGAGTTTGTCACTATTCCTCGTGTTGCTCGGGTTATCTGCTTCACTTG CAAGCGGAGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAAT GGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCAC TACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATC CGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTC AAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAA AGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACA TCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAA CTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGAC ACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGA TTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTT AATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAG AGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 14) 将BGIH ORF克隆至FECT表达载体的Pac I和Avr II限制位点中以产生BGIH表达载 体用于FECT瞬时植物表达系统（pFECT-BGIH)。为了使FECT表达系统中的BGIH表达最大 化，产生表达RNA沉默抑制蛋白P19的FECT载体（pFECT-P19)用于共转化。为了产生用于 TRBO瞬时植物表达系统的BGIH表达载体，进行常规PCR程序以将Not I限制位点加至上述 BGIH ORF的3'端。然后将新的BGIH ORF克隆至TRBO表达载体的Pac I和Not I限制位 点中以产生BGIH表达载体用于TRBO瞬时植物表达系统（pTRBO-BGIH)。
[0215] 通过FECT和TRBO表达系统，将根癌农杆菌菌株GV3101用于BGIH在烟草叶中的 瞬时表达。为了制备感受态GV3101细胞，进行了下列程序：使用GV3101的过夜培养物接种 200 mL Luria-Bertani (LB)培养基。然后使细胞生长到其0D600介于0.5和0.8之间的 对数期。然后通过在4°C下以5000 rpm离心10分钟使细胞沉淀。细胞然后用10 mL预冷 的TE缓冲液（Tris-HCl 10 mM，EDTA ImM，pH8. 0)洗涤1次，然后重新悬浮于20 mL LB培 养基中。GV3101细胞重悬液然后以250 PL部分等分入1.5 mL微管中。然后将等分试样在 液氮中速冻并保存在_80°C冰箱中以备未来转化。
[0216] 然后如下采用冻融方法，将pFECT-BGIH和pTRBO-BGIH载体转化到感受态GV3101 细胞中：将保存的感受态GV3101细胞在冰上融化，然后与1-5 Pg纯DNA (pFECT-BGIH或 pTRBO-BGIH载体）混合。之后将细胞-DNA混合物保持在冰上5分钟，然后转移到-80°C下 5分钟，随后在37°C水浴中温育5分钟。冻融处理的细胞然后被稀释入I mL LB培养基中， 在振动台上在室温下振荡2-4小时。200 PL细胞-DNA混合物的等分试样然后铺于具有适 当抗生素（10 Kg/mL利福平、25 Pg/mL庆大霉素和50 Pg/mL卡那霉素用于pFECT-BGIH转 化和pTRBO-BGIH转化两者）的LB琼脂板上，并在28°C下温育2天。然后挑选出所得转化 体菌落，在6 mL等分的具有合适抗生素的LB培养基的中培养用于转化DNA分析，并制备转 化GV3101细胞的甘油贮液。
[0217] 用3 mL无针注射器进行叶注射来进行烟草叶的瞬时转化。将转化的GV3101细胞 在具有合适抗生素（如上所述）的LB板上划痕，在28°C下温育2天。将转化的GV3101细 胞的一个菌落接种至5 ml LB-MESA培养基（补充10 mM MES、20 μΜ乙酰丁香酮的LB培养 基）和上述相同的抗生素中，在28°C下过夜。通过以5000 rpm离心10分钟收集过夜培养 物的细胞，以1. 〇的最终0D600重新悬浮于诱导培养基（10 mM MES、10 mM MgC12、100 μ M 乙酰丁香酮）中。然后将细胞在诱导培养基中在室温下温育2小时至过夜，然后准备就绪用 于烟草叶的瞬时转化。使用3 mL未附带针的注射器通过注射，使处理细胞侵润AYcoiiaaa 知植物的连接的叶的底面。对于FECT瞬时转化，将等量的pFECT-BGIH转化的 GV3101细胞和pFECT-P19转化的GV3101细胞混合在一起用于通过用3 mL注射器注射侵润 烟草叶。对于TRBO瞬时转化，仅使pTRBO-BGIH转化的GV3101细胞侵润烟草叶。在浸润后 6-8天评价烟草叶中的ICK基序蛋白表达。
[0218] BGIH 表达 ORF 含有 GFP (STA)与 U-ACTX-Hvla (ICK)的融合蛋白，在 GFP 与 U-ACTX-Hvla之间具有IGER (SEQ ID NO: 1)接头肽（LINKER)。如图3所示，在紫外线下 检测用FECT和TRBO载体转化的烟草叶中转基因的表达GFP部分的绿色荧光。引人关注的 是，绿色荧光显得均匀分布在FECT载体转化的烟草叶（维管组织除外）中，而TRBO载体转 化的烟草叶中的绿色荧光显得在维管组织中蓄积，这是由于TRBO保留其病毒运动蛋白而 FECT不保留所致。
[0219] 为了定量评价ICK基序蛋白表达，通过此处所述的下列程序，提取转化烟草叶中 的表达的蛋白质。通过用大开孔的1000 μ?移液管头钻取叶片，来收集100 mg转化的叶组 织圆盘。将所收集的叶组织放入具有532"直径不锈钢磨球的2 mL微管中，并在-80°c下 冰冻1小时，然后使用Troemner-Talboys高通量匀浆器匀浆。将750 PL冰冷的TSP-SEl 提取溶液（磷酸钠溶液50 mM、1:100稀释的蛋白酶抑制剂混合物、EDTA ImM、DIECA 10mM、 PVPP 8%，pH 7.0)加入管中并涡旋混合。然后将微管静置在室温下15分钟，然后在4°C下以 16,000 g离心15分钟。取出100 KL所得上清液，加载到0.45 Mm Millipore MultiScreen 过滤器微量滴定板中的预装填Sephadex G-50的柱中，其底部具有接受Costar微量滴定板 的空间。微量滴定板然后在4°C下以800 g离心2分钟。所得滤液，本文称为烟草叶的总可 溶性蛋白提取物（TSP提取物），准备就绪用于定量分析。
[0220] 采用Pierce Coomassie Plus蛋白质测定法，估算TSP提取物的总可溶性蛋白浓 度。具有已知浓度的BSA蛋白质标准品用来产生蛋白质定量标准曲线。将2 PL的各TSP 提取物混合入Coomassie Plus蛋白质测定试剂盒的200 PL显色试剂（CPPA试剂）中，使 其反应10分钟。然后采用SpectroMax-M2读板仪，使用SoftMax Pro作为控制软件，通过 读取0D595来评价显色反应。来自FECT-BGIH表达叶和TRB0-BGIH表达叶的TSP提取物中 的总可溶性蛋白的浓度分别为0.788 ± 0.20 Pg/^L和0.533 ± 0.03 Pg/^L。这些结果 用来计算在iELISA测定法中TSP (%TSP)中表达的U-ACTX-Hvla的百分比。
[0221] 如下进行间接ELISA (iELISA)测定法以定量评价用FECT和TRBO表达系统瞬时 转化的烟草叶中的ICK基序蛋白。将5 PL叶TSP提取物稀释在Immulon 2HD 96孔板的孔 中的95 PL CB2溶液（Immunochemistry Technologies)中，按需进行系列稀释。然后使来 自提取物样品中的叶蛋白质在室温下避光包被孔壁3小时，随后除去CB2溶液，各孔用200 μ? PBS (Gibco)洗涤两次。之后将150 PL封闭溶液（含5%脱脂奶粉的Block BSA/PBS) 加入各孔中，在室温下避光温育1小时。在除去封闭溶液和PBS洗涤各孔后，将100 PL的 兔抗U-ACTX-Hvla抗体（第一抗体）（1:250稀释于封闭溶液）加入各孔中，在室温下避光 温育1小时。随后除去第一抗体，各孔用PBS洗涤4次。然后将100 PL HRP缀合的山羊抗 兔抗体（第二抗体，按1:1000稀释于封闭溶液中使用）加入各孔中，在室温下避光温育1 小时。在除去第二抗体并用PBS洗涤孔后，将100 PL底物溶液（ABTS过氧化物酶底物溶液 A和溶液B的1:1混合物，KPL)加入各孔中，使显色反应进行直到出现足够的显色。然后将 100 PL过氧化物酶终止溶液加入各孔中以终止反应。使用SpectroMax_M2读板仪，SoftMax Pro用作控制软件，在405 nm处读取板中各反应混合物的吸光度。在iELISA测定中按如上 所述的相同方式，处理系列稀释的已知浓度的纯U-ACTX-Hvla样品以生成质量-吸光度标 准曲线用于定量分析。通过iELISA检测表达的U-ACTX-Hvla，在来自FECT-BGIH转化的烟 草的叶TSP提取物中为3.09 ± 1.83 ng/^L;在来自TRB0-BGIH转化的烟草的叶TSP提取 物中为3. 56 ± 0. 74 ng/^L。或对于FECT-BGIH转化体，表达的U-ACTX-Hvla为0. 40%总 可溶性蛋白（%TSP)，在TRB0-BGIH转化体中为0.67% TSP。
[0222] 综上所述，两个FECT和TRBO瞬时植物表达系统可用来在植物中表达ICK基序蛋 白。两个系统中的ICK基序蛋白表达水平非常接近。然而，在FECT系统中，表达均匀分布 在农杆菌侵润的叶中，而在TRBO系统中，表达蓄积在农杆菌侵润的叶的维管组织中。
[0223] 实施例2 烟草叶中ICK基序蛋白瞬时表达伴随在不同的亚细胞目标中蓄积。
[0224] 植物表达的ICK基序蛋白需要在植物中蓄积到一定水平以有效保护植物免遭虫 害。植物表达的ICK基序蛋白的蓄积水平可受其在植物细胞中的最终定位影响。在该实施 例中，我们研究了植物表达的ICK基序蛋白的不同亚细胞定位对植物中的蛋白质蓄积水平 的影响（使用FECT瞬时植物表达系统）。在该实施例中，研究了 3个亚细胞目标，植物细胞 壁质外体（APO)、内质网（ER)和胞质（CYTO)。
[0225] APO导向的ICK基序蛋白表达ORF被设计成编码一系列翻译融合的结构基序，可如 下描述：N'-ERSP-Sta-L-ICK-C'。本研究中ICK基序蛋白再次为U-ACTX-Hvla，并使用实施 例1的BGIH表达0RF。此处使用与实施例1相同的载体，pFECT-BGIH。
[0226] CYTO导向的ICK基序蛋白表达ORF被设计成编码一系列翻译融合的结构基序，可 如下描述：Ν' -Sta-L-ICK-C'。本研究中，从BGIH表达ORF中剔除编码大麦α -淀粉酶信 号肽的DNA序列，变成GIH表达0RF，其可读框序列如下： ATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAAT GGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCAC TACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATC CGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTC AAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAA AGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACA TCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAA CTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGAC ACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGA TTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTT AATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAG AGCTTAA (SEQ ID NO: 15) 将GIH表达ORF克隆至FECT表达载体的Pac I和Avr II限制位点中以产生GIH表达 载体用于FECT瞬时植物表达系统（pFECT-GIH)，以用于U-ACTX-Hvla的CYTO引导表达。
[0227] 通过在BGIH表达ORF的C'端加入编码ER引导信号肽的DNA序列设计ER导向的 ICK基序蛋白表达0RF，其被命名为BGIH-ER表达0RF。此处所用的ER引导信号肽具有下列 氨基酸序列（氨基酸的一字母代码）： KDEL (SEQ ID NO: 16) BGIH-ER表达ORF的DNA序列如下： ATGGCTAATAAACACCTGAGTTTGTCACTATTCCTCGTGTTGCTCGGGTTATCTGCTTCACTTGCAAGCGG AGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCAC AAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTG GAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGA TCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAA AGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAA AGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATA CATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGT TCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCT GTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGC TGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACC ATGTTCTATTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGT TTATTATTGTAGAGCTAAAGATGAGCTCTAA (SEQ ID NO: 17) 将BGIH-ER表达ORF克隆至FECT表达载体的Pac I和Avr II限制位点中以产生 BGIH-ER表达载体用于FECT瞬时植物表达系统（pFECT-BGIH-ER)，用于U-ACTX-Hvla的ER 导向表达。
[0228] 将所有 3 种载体 pFECT-BGIH、pFECT-GIH 和 pFECT-BGIH-ER 转化至农杆菌 菌株GV3101中，并采用实施例1所述方法，使用所得的转化GV3101细胞瞬时转化至 AYcoiiaaa 叶中。所有3种表达ORF应瞬时表达融合蛋白，其包含GFP融合的 U-ACTX-Hvla，在所述两个结构结构域之间具有胰蛋白酶可切割接头。
[0229] 在瞬时烟草转化6天后，通过检测紫外线下的绿色荧光，初步检查GFP融合的 U-ACTX-Hvla的表达。在所有转化的烟草叶中检测到不同水平的绿色荧光。具有GFP融合 的U-ACTX-Hvla的CYTO导向蓄积的转化叶显示最强的绿色荧光，而具有APO或ER导向的 融合蛋白蓄积的那些叶显示较弱的绿色荧光。因此，结果表明烟草叶中与APO和ER导向表 达相比，CYTO导向表达可促进转基因 GFP融合的U-ACTX-Hv I a蛋白的更大蓄积。在该实验 的3次重复中，具有CYTO导向表达的转化烟草叶总是显示类似或强于具有APO导向表达的 叶的绿色荧光，且用ER导向构建体转化的烟草叶中检出最弱的绿色荧光。这些初步结果表 明CYTO导向表达可蓄积同样或高于APO导向表达的转基因融合蛋白，且ER导向表达产生 最少的蓄积。
[0230] 从用不同FECT载体转化的烟草叶提取总可溶性蛋白样品（方案详细描述于实施 例1)。如实施例1中所述进行Pierce Coomassie Plus蛋白质测定法以测定TSP提取物 中总可溶性蛋白的浓度，对于APO导向、CYTO导向和ER导向表达，分别得到下列浓度估值： 0.31 ± 0.04 Pg/^L、0.31 ± 0.03 Pg/^L 和 0.34 ± 0.05 Pg/^L (N = 3)。
[0231] 然后使用TSP提取物按实施例1中所述进行间接ELISA方案以定量测定 U-ACTX-Hvla蛋白的表达水平为总可溶性蛋白的百分比（%TSP)，对于APO导向、CYTO导向和 ER导向表达，分别得到下列百分比估值：0.126 ± 0.032%、0. 049 ± 0.085%和0.025 土 0.018% (N = 3)。图8概括了上述各种转化烟草叶的表达的U-ACTX-Hvla的量化（为％TSP 值）。这些结果表明APO导向转基因表达导致叶中表达的正确折叠的ICK基序蛋白的最大 蓄积。
[0232] 总的来说，虽然经转化产生CYTO导向的转基因 GFP融合的U-ACTX-Hvla的烟草 叶呈现最强的绿色荧光信号，但实际上iELISA结果发现这些转基因烟草叶中U-ACTX-Hvla 肽最少，大大小于对ER导向表达的转化叶（其具有最弱的绿色荧光信号）所检出的肽。在 iELISA测定法中，第一抗体（兔抗U-ACTX-Hvla抗体）仅可与正确折叠的U-ACTX-Hvla肽 结合。
[0233] 实施例3 用于ICK基序蛋白在植物中表达的替代信号肽。
[0234] 因为ER信号肽可以蛋白质表达水平中起作用，所以使用之前实施例中所述的 FECT表达系统测试了两种其它的ERSP。两种ERSP候选物为烟草伸展蛋白信号肽，本研究 中简写为"E"（Memelink等，the Plant Journal, 1993，V4: 1011-1022)，其变体之一简 写为"E*"（Pogue GP 等，Plant Biotechnology Journal, 2010，V8: 638-654)。它们的 氨基酸序列列举如下（Ν'至C'，一字母代码，非相同的残基用粗体字表示）： 伸展蛋白信号肽（EMGKMASLFASLLVVLVSLSLASESSA (SEQ ID NO: 18) 伸展蛋白信号肽变体（E*) :MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSA (SEQ ID NO: 19) 如下设计编码E的DNA序列用于烟草表达： ATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTTCTCTGCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTTCTGAATCTT CTGCT (SEQ ID NO: 20) 采用寡核苷酸延伸PCR (oligo extension PCR)，用4个合成DNA引物产生E DNA序 列。然后，为了将Pac I限制位点加至其5'端并将GFP 5'端DNA序列的一部分加至其 3'端，使用E DNA序列作为模板进行进一步的PCR，得到117 bp DNA片段。然后使用该 片段作为正向PCR引物以扩增编码来自载体pFECT-BGIH的GFP-IGER接头-U-ACTX-Hvla ORF的DNA序列（参见实施例1和实施例2)，因此在我们的ICK基序蛋白表达ORF之一 设计为ERSP-Sta-L-ICK后，产生编码（自Ν'至C'端）伸展蛋白信号肽-GFP-IGER接 头-U-ACTX-Hvla的U-ACTX-Hvla表达0RF。这个表达0RF，称为"EGIH"，在其5'端具有Pac I限制位点，在其3'端具有Avr II限制位点。EGIH具有下列DNA序列： TTAATTAAATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTTCTCTGCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTT CTGAATCTTCTGCTGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGAT GTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTAT TTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCC GTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATA TCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGA GTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATG TATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCC GTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCT GTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTG CTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGT TCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTA TTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 21) 将EGIH DNA序列克隆至FECT载体的Pac I和Avr II限制位点中以产生pFECT-EGIH 载体用于GFP融合的U-ACTX-Hvla蛋白的瞬时植物表达。
[0235] 如下设计编码变体伸展蛋白信号肽（E*)的DNA序列用于烟草表达： ATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTACTTTTCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTTCTGAATCTT CTGCT (SEQ ID NO: 22) 采用上述用于EGIH ORF的相同技术产生"E*GIH" DNA序列，其编码（自Ν'至C'列 出）变体伸展蛋白信号肽-GFP-IGER接头-U-ACTX-Hvla蛋白的翻译融合物。所得E*GIH ORF具有下列DNA序列： TTAATTAAATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTACTTTTCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTT CTGAATCTTCTGCTGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGAT GTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTAT TTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCC GTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATA TCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGA GTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATG TATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCC GTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCT GTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTG CTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGT TCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTA TTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 23) 将E*GIH DNA序列克隆至FECT载体的Pac I和Avr II限制位点以产生pFECT-E*GIH 载体用于GFP融合的U-ACTX-Hvla蛋白的瞬时植物表达。
[0236] 使用 3 种不同的 FECT 表达载体 pFECT-BGIH、pFECT-EGIH 和 pFECT-E*GIH，在烟草 植物中瞬时表达GFP融合的U-ACTX-Hvla蛋白以评价蛋白质表达水平如何受不同ERSP的 影响。将3种FECT表达载体转化至农杆菌GV3101中，然后采用实施例1中所述技术，将转 化的GV3101注射入烟草叶中用于GFP融合的U-ACTX-Hvla蛋白在烟草叶中的瞬时表达。
[0237] 首先通过视觉检查紫外线下的绿色荧光，评价来自上述3种不同的FECT表达载体 的GFP融合的U-ACTX-Hvla的表达水平。来自3种不同FECT载体的瞬时转化的烟草叶的 绿色荧光是肉眼可见的。所有叶显示相似的绿色荧光水平，表明了所测试的3种ERSP无一 引起GFP融合的U-ACTX-Hvla蛋白表达水平的显著增加。
[0238] 从用上述3种ERSP FECT载体转化的烟草叶提取总可溶性蛋白样品（方案详细描 述于实施例1)。然后进行Pierce Coomassie Plus蛋白质测定法（按实施例1中所述）以 测定所得TSP样品中总可溶性蛋白的浓度，对于对应于BGIH、EGIH和E*GIH表达ORF的样 品分别得到 0.85 ± 0.68 Pg/^L、0.70 ± 0.47 Pg/^L 和 0.76 ± 0.77 Pg/^L 的值（N = 4)。
[0239] 然后使用TSP提取物进行间接ELISA(按实施例1中所述）以定量测定 U-ACTX-Hvla蛋白的表达水平为总可溶性蛋白的百分比（%TSP)，对于对应于具有BGIH、 EGIH和E*GIH表达ORF的FECT载体的样品，分别得到0.39 ± 0.17% (N=3,因为一个数据 点被作为无关项剔除）、0.48 ± 0.26% (N=4)和0.62 ± 0.38% (N=4)的值。图9概括了 对从用上述3种ERSP ORF转化的烟草叶得到的所有样品估算的U-ACTX-Hvla水平，为总可 溶性蛋白的百分比（%TSP)。虽然来自3种FECT载体转化的％TSP数据看上去不同，但通过 Student's t检验它们没有统计学上地不同。换句话说，在瞬时转化的烟草叶中，3种ERSP 在U-ACTX-Hvla的表达水平上并无不同。
[0240] 实施例4 作为与ICK基序蛋白的融合蛋白表达的稳定性蛋白有助于ICK基序蛋白在转化植物中 蓄积。
[0241] 在该实施例中，用于植物表达的ICK基序蛋白是ω-ACTX-Hvla，来源于澳大利亚 布鲁山脉漏斗网蝴蛛rerswia。ω-ACTX-Hvla具有下列氨基酸序列（一字母 代码）： SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO: 24) 使用FECT表达系统在烟草植物AYcoiiaaa 中表达ω-ACTX-Hvla。对编 码不同ω -ACTX-Hvla表达ORF的2种FECT载体进行了工程改造。这些表达ORF之一编码 在其Ν'端具有大麦α淀粉酶信号肽（BAAS)而无任何稳定性蛋白的ω-ACTX-Hvla。将这个 表达ORF (本文亦称"BO"）亚克隆以产生FECT表达载体pFECT-BO。另一种ω -ACTX-Hvla 表达ORF编码ω-ACTX-Hvla与蛋白质Jun a 3的翻译融合物。成熟的Jun a 3是一种约 30 kDa植物防御蛋白，也是某些人的变应原，由aiei乔木产生，并用于该ORF 中作为翻译稳定性蛋白（STA)。下面列出其氨基酸序列（一字母代码）： MARVSELAFLLAATLAISLHMQEAGVVKFDIKNQCGYTVWAAGLPGGGKRLDQGQTWTVNLAAGTASARFWG RTGCTFDASGKGSCQIODCGGQLSCTVSGAVPATLAEYTQSDQDYYDVSLVDGFNIPLAINPTNAQCTAPACKADI NAVCPSELKVDGGCNSACNVFKTDQYCCRNAYVDNCPATNYSKIFKNQCPQAYSYAKDDTATFACASGTDYSIVFC (SEQ ID NO:25) 下面以SEQ ID NO: 26提供成熟的Jun a 3蛋白。
[0242] KFDIKNQCGYTVWAAGLPGGGKRLDQGQTWTVNLAAGTASARFWGRTGCTFDASGKGSCQTCDCGGQLS CTVSGAVPATLAEYTQSDQDYYDVSLVDGFNIPLAINPTNAQCTAPACKADINAVCPSELKVDGGCNSACNVFKTDQ YCCRNAYVDNCPATNYSKIFKNQCPQAYSYAKDDTATFACASGTDYSIVFC (SEQ ID NO: 26) SEQ. ID. 25的ORF中编码的ERSP是Jun a 3天然信号肽，如以下SEQ. ID 27所示。 MARVSELAFLLAATLAISLHMQEAGVV SEQ. ID. 27〇
[0243] 实施例1详细描述了通过在ORF中编码的介于ω-ACTX-Hvla结构域和Jun a 3结构域之间的序列编码的IGER接头。总之，这个ω -ACTX-Hvla表达ORF称为 S-Juna3-IGER-c〇 或 SJI0。同样，SJIO 表达 ORF 所插入的 FECT 载体命名为 pFECT-SJIO。
[0244] 使用2种ω -ACTX-Hvla FECT表达载体pFECT-BO和pFECT-SJIO在烟草植物中瞬 时表达ω-ACTX-Hvla蛋白。采用实施例1中详细描述的技术，将2种FECT表达载体转化 进入农杆菌菌株GV3101，并将所得GV3101转化体注入烟草叶中用于在烟草叶中瞬时表达 ω-ACTX-Hvla。
[0245] 在烟草转化后第6天，收集转化的烟草叶，从叶中提取叶总可溶性蛋白质（有关详 细方法参见实施例1)。然后进行Pierce Coomassie Plus蛋白质测定法以测定叶总可溶 性蛋白质的浓度，对于用编码pFECT-SJIO和pFECT-BO的构建体转化的叶，分别得到3. 047 ± 0· 176 Pg/^L (N=2)和 2. 473 ± 0· 209 Pg/^L 的值（N=2)。
[0246] 然后按实施例1中所述，使用上述TSP提取物进行间接ELISA方案以定量评价 ω-ACTX-Hvla蛋白的表达水平作为总可溶性蛋白的百分比（%TSP)，对于用pFECT-SJIO和 pFECT-BO 载体转化的叶，分别得到 0. 133 ± 0. 014% (N=2)和 0. 0004 ± 0. 0003% 的值 (N=2)。这些数据表明，作为与Jun a 3的翻译融合物表达的ω-ACTX-Hvla蓄积至未以与 Jun a 3蛋白的翻译融合物表达的ω-ACTX-Hvla的300倍以上的较高稳态水平。
[0247] 上述实施例4, STA的作用还可用具有下列序列的雪花莲凝集素（GNA)进行： DNILYSGETLSTGEFLNYGSFVFIMQEDCNLVLYDVDKPIWATNTGGLSRSCFLSMQTDGNLVVYNPSNKPIW ASNTGGQNGNYVCILQKDRNVVIYGTDRWATG(SEQ ID NO: 28) 〇
[0248] 实施例5 ICK基序融合蛋白表达ORF中稳定性蛋白结构域和ICK基序蛋白结构域间的可切割接 头提高在转基因植物中表达的所得ICK基序蛋白的杀虫活性。
[0249] 因为大多数咀嚼式口器昆虫分泌胰蛋白酶进入其肠中以消化食物，我们设计了编 码在融合物的稳定性蛋白结构域和ICK基序蛋白结构域之间的胰蛋白酶可切割接头的融 合蛋白表达0RF，以促进昆虫肠中ICK基序结构域从完整融合蛋白中释放。
[0250] 此处植物表达的ICK基序蛋白是ω-ACTX-Hvla，其氨基酸序列如下（一字母代 码）： SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO: 24)。
[0251] 所使用的ω-ACTX-Hvla表达ORF编码包含下列结构域的融合蛋白（Ν'至C'）： Jun a 3 信号肽：：Jun a 3: : IGER接头：：ω-ACTX-Hvla，如上述结构式 ERSP-Sta-L-ICK 中 一样。Jun a 3的起源和序列如上述实施例4中所述。
[0252] 在此所用的ERSP是Jun a 3天然信号肽，如上文实施例中所述。
[0253] 实施例1详细描述了由在ORF中编码的ω-ACTX-Hvla结构域和Jun a 3结构域 之间的序列编码的IGER接头。总之，这个ω-ACTX-Hvla表达ORF称为S-Juna3-IGER-c〇 或SJI0。同样，SJIO表达ORF所插入的FECT载体命名为pFECT-SJIO。
[0254] 然后使用载体pFECT-SJIO在烟草植物中瞬时表达ω-ACTX-Hvla蛋白。采用实施 例1中详细描述的技术，将载体转化至农杆菌GV3101中，之后将转化的GV3101注入烟草叶 用于在叶中ω-ACTX-Hvla的瞬时表达。
[0255] 烟草叶转化后第6天，收集3.3 g转化的烟草叶，在液氮中研磨。按照实施例1描 述的程序，使用50 mL TSP-Sel缓冲液从研磨叶提取总可溶性蛋白（TSP)。从TSP提取程序 中回收总共26 mL提取物，然后将其均匀地分成2个样品A和B，每组13 mL提取物。通过 在37°C下加入1.3 mL含I mg/mL胰蛋白酶的I mM HC1，用胰蛋白酶处理样品A 1小时以 从融合的Jun a 3蛋白中释放ω-ACTX-Hvla。样品B不通过胰蛋白酶切割处理。为了得到 生物活性浓度范围中的ω-ACTX-Hvla，按如下相同方式将2组浓缩。第一，将提取物加载 到具有10 kD截止值滤膜的浓缩器中，以3200 g离心2小时。然后保存I. 4 mL来自样品 A的截留物和I. I mL来自样品B的截留物以备稍后的试验。12. 5 mL来自样品A的滤液和 12. 5 mL来自样品B的滤液通过具有I kD截止值滤膜的浓缩器以3200 g离心16小时进一 步浓缩。从样品A中回收I. 3 mL截留物，从样品B中回收I. I mL截留物。保存两种I kD 截止值过滤截留物以备稍后的试验。该样品浓缩程序概述于图10。将从pFECT-SJIO转化 的烟草叶的总TSP提取物均匀地分成2个样品。一个样品（A)用胰蛋白酶切割处理，另一 个（B)不处理。两组通过在具有10 kD然后I kD截止值滤膜的浓缩器中离心浓缩，保存自 10 kD和I kD截止值过滤的截留物用于进一步试验。
[0256] SJIO表达ORF表达如下融合蛋白，Jun a 3: :IGER: : ω-ACTX-Hvla，其包含总共 266个氨基酸残基，预测分子量为28, 204. 28 Da。该融合蛋白的胰蛋白酶切割应释放分子量 为 4049. 2 Da 的 ω-ACTX-Hvla 和分子量为 24,155.1 Da 的 Jun a 3:: IGER 融合蛋白。因 此，如果胰蛋白酶切割反应在处理中完成，则预期过滤样品的主要组分如下： 样品A 10 kD过滤截留物Jun a 3: : IGER融合物。
[0257] 样品 A I kD 过滤截留物：ω-ACTX-Hvla。
[0258] 样品 B 10 kD 过滤截留物 Jun a 3: : IGER: : ω-ACTX-Hvla 融合物。
[0259] 样品B I kD过滤截留物：无 SJIO表达的蛋白质。
[0260] 为了定量测定截留物样品中的ω-ACTX-Hvla肽，按实施例1中所述进行iELISA。 样品中所检出的ω-ACTX-Hvla浓度如下： 样品 A 10 kD 过滤截留物：1· 328 ng/^L 的 ω-ACTX-Hvla，共 L 86 Pg。
[0261] 样品 A I kD 过滤截留物：2. 768 ng/^L 的 ω-ACTX-Hvla，共 3. 60 Pg。
[0262] 样品 B 10 kD 过滤截留物：12. 656 ng/^L 的 ω-ACTX-Hvla，共 13. 92 Pg。
[0263] 样品 B I kD 过滤截留物：0· 752 ng/^L 的 ω-ACTX-Hvla，共 0· 83 Pg。
[0264] 如所表明的，在所分析的所有过滤样品中检出ω -ACTX-Hvla。在A组10 kD过滤 截留物中检出的ω-ACTX-Hvla推测主要是因为未切割的融合蛋白的物理保留所致。同样， B组I kD过滤截留物样品中检出的ω-ACTX-Hvla可能是由于未切割的融合蛋白通过10 kD 截止值滤膜的低速率的假过滤所致。
[0265] 为了证实胰蛋白酶-切割反应是成功的，进行了反向高效液相色谱法（rpHPLC)以 分析所保留的过滤样品中的组分。使用具有Onyx 100 monolithic C18柱（4. 6 X 100 mm) 的Varian E218 HPLC系统，使用含0. 1%三氟乙酸的水（溶剂A)和含0. 1%三氟乙酸的乙 腈（溶剂B)为流动相组分，进行HPLC。使用10分钟内10-20%溶剂B的线性梯度，以2 mL/ 分钟的流速，将ω -ACTX-Hvla肽从柱上洗脱。将99%纯的合成ω -ACTX-Hvla的样品用于 rpHPLC以生成标准曲线（使峰面积与所注入的肽质量关联）。图11表示3个不同的洗脱 图11A、11B、11C。如图IlA所示，ω-ACTX-Hvla肽在注入后6.5分钟洗脱出。当将来自B 组I kD过滤截留物的500 PL样品加载到HPLC系统中时，在注入后6和7分钟间，在相应 的HPLC色谱图中没有蛋白质峰（图11Β)。当将来自A组I kD过滤截留物的500 PL样品 加载到HPLC系统中时，在相应色谱图的6. 3分钟保留时间上有峰（参见图11中的虚线）， 这就表示通过胰蛋白酶切割从融合蛋白中释放的ω-ACTX-Hvla (图11C)。该峰的面积相 当于样品A I kD过滤截留物中ω-ACTX-Hvla的浓度介于16-70 ng/^L之间（取决于对峰 积分所采用的方法）。
[0266] 使用储备的过滤样品进行家蝇注射生物测定以测试呈融合蛋白形式和呈从融 合蛋白中释放的形式的《-ACTX-Hvla的活性。家蝇蛹Clfesca 购自Benzon Research，Inc.，并保持在25°C的塑料盒中，盒盖上有气孔，盒中有蝇食物（1:1比率糖和奶 粉）和浸于水中的棉球。成体家蝇羽化的当天，使用〇)2线（CO2 line)将蝇固定，然后使用 CO2浸渍垫（infusion pad)保持不动。选择重为12-18 mg的蝇用于注射生物测定。为了 进行家蝇注射，使用加载了带有30号针的I cc玻璃注射器（其中加载了注射溶液）的微 型给药器（microapplicator)，将0.5 PL剂量递送至蝇的后胸。然后把经注射的蝇放入经 标记的带有气孔的盒中，并对注入后24小时的死亡率评分。给家蝇注射下列样品（10只蝇 的各组用于各样品）： 水注射为阴性对照。
[0267] A组10 kD过滤截留物。
[0268] A组IkD过滤截留物。
[0269] B组10 kD过滤截留物。
[0270] B组I kD过滤截留物。
[0271] 0. 13 mg/mL胰蛋白酶溶液为阴性对照。
[0272] 在注射后24小时，样品A 10 kD过滤截留物和样品A I kD过滤截留物引起100% 的家蝇死亡率，而注射其它样品的蝇观察到〇%死亡率。纯的天然序列ω -ACTX-Hvla显示在 该家蝇注射生物测定中LD5tl为100 pmol/克家蝇；因此，为在该示例中引起100%死亡率，注 射的ω-ACTX-Hvla的浓度必须至少25 ng/^L。这与生物测定结果一致，因为样品A I kD 过滤截留物的HPLC分析表明ω-ACTX-Hvla浓缩物的浓度为16-70 ng/^L。在家蝇注射生 物测定中，不包含用胰蛋白酶切割处理的材料的过滤样品不引起死亡，这表明了与被胰蛋 白酶从融合构建体切除的天然-序列ω-ACTX-Hvla相比，Jun a 3融合的ω-ACTX-Hvla的 活性要小得多。因此，当设计成可切割的，使得ICK融合蛋白的ICK基序结构域可通过蛋白 酶解从蛋白质的其它结构结构域中释放时，植物ICK基序蛋白表达ORF的接头区可显示杀 虫功能提1?。
[0273] 第II部分.高产狀 在商业规模上成功生产具有可再现的肽形成和折叠并具有成本控制的杀虫肽的能力 可能是富有挑战性的。肽的种类繁多、性能独特且性质特殊，结合极其多种的可能的生产技 术，可提供肽生产的众多方法。
[0274] 然而，有不多（如有任何描述的话）描述了如何改变肽使得它将以比改变前通常 生产肽的生产率高得多的生产率在生物系统中生产。在此我们提供了改变肽的组成的方 法，并且如此进行以提高肽生产的速率和量，同时降低肽生产的成本。我们描述了改变或 "转化"一种肽成为一种不同的更有成本效益、但出人意料地仍具有正如其转化前一样毒性 的肽的新方法。
[0275] 我们描述了这些新的转化肽的实例，而且我们表明这些用于改变或转化肽的方法 如何可使肽的产量产生重大改进而不引起其活性显著改变。本文描述并要求保护用于产生 这些肽的新的处置方法、新的肽、新的制剂和新的生物。描述了通过在杀虫肽的N端加入二 肽来增加酵母表达系统的杀虫肽产量的方法。加入二肽不会不利地影响杀虫肽的杀虫活 性。
[0276] 我们描述了这些新的转化肽的实例，而且我们表明这些改变或转化肽的方法如何 可在肽的产量中产生重大改进而不引起其活性显著改变。本文描述并要求保护用于生产这 些肽的新的处置方法、新的肽、新的制剂和新的生物。
[0277] 用于生产高产肽的详细程序。
[0278] 我们描述了可增加肽产量的处置方法和肽。当遵循这些技术时，可通过在天然肽 的N端加入二肽提供转化肽，所述转化肽在3个不同的方面具有比天然肽更好的生产率。第 一，二肽 -天然肽类（dipeptide-native peptide strain)的总平均产量好于天然类的总 平均产量；第二，二肽-天然肽类的中值产量好于天然的中值产量；第三，在较高的生产率 范围下有比对于天然肽类而言更多的二肽类。此处所述方法可用于各种体内系统，包括植 物、动物和微生物。本发明需要在天然肽的N端加入二肽，所述天然肽在加入二肽之前是已 知的肽。已知肽然后被"转化"，并且它随后可以比之前料想的更高产量生产。在一个实施 方案中，杀虫肽与二肽连接。这些二肽-天然肽系统可用于可产生所述肽的植物。植物生 产的肽具有各种用途，从生产到仅产生通过害虫采食而获得的毒肽，因此保护植物或可能 提供其它益处。
[0279] 在一个实施方案中，我们描述了用于通过在杀虫肽的N端加入任何二肽在酵母表 达系统中提高杀虫肽产量的方法。二肽由非极性氨基酸和极性氨基酸组成。非极性氨基酸 可选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。甘氨酸是 优选的非极性氨基酸。极性氨基酸可选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、 组氨酸、色氨酸和酪氨酸。丝氨酸是优选的极性氨基酸。描述了其中非极性氨基酸位于二 肽的N端的处置方法和氨基酸，在一个实施方案中，优选的二肽N端是甘氨酸。描述了其中 极性氨基酸位于二肽的C端的处置方法和氨基酸，在一个实施方案中，优选的二肽C端为丝 氨酸。
[0280] 在本发明的一个实施方案中，二肽为甘氨酸-丝氨酸、gly-ser或GS。这些氨基酸 通常由下列密码子编码：Gly可通过密码子例如GGT、GGC、GGA、GGG编码，Ser可通过密码子 例如 TCT、TCC、TCA、TCG、AGT 和 AGC 编码。
[0281] 设计杀虫肽的转基因使得其转基因序列被优化以用于可能需要的特殊表达。例 如，可优化杀虫肽的转基因用于在酵母、植物、细菌和病毒中表达。本发明的这类用途的实 例可包括作物像玉米和大豆的转基因的工程改造和优化，其目的是保护它们免遭虫害。在 一个实例中，我们设计杀虫肽的转基因，使得其转基因序列被优化用于在酵母表达系统的 特殊表达，例如使用乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母O cYcAia pasioris)和酿酒酵母cererisiae)。其它合适的酵母表达系统是本领域 已知的。二肽例如甘氨酸-丝氨酸（gly-ser)的核苷酸密码子被加在成熟杀虫肽的转基因 序列的5'端。然后将转基因序列与合适的表达载体连接，所述表达载体可提供合适的选择 标记、用于特定酵母表达系统的强启动子-终止子组、用于分泌的信号序列和介于各自的 信号序列和成熟肽序列之间的切割位点。然后通过本领域技术人员已知方法，包括电穿孔 或化学转化方法，将杀虫肽表达载体转化到酵母细胞中，以产生稳定肽表达酵母菌株。当这 些酵母菌株在合适的培养基中生长时，产生通过将二肽序列甘氨酸-丝氨酸加至成熟杀虫 肽的N端而修饰的杀虫肽，其被分泌到生长培养基中。二肽甘氨酸-丝氨酸加到成熟杀虫 肽的N端显著增加杀虫肽的产量，对肽的杀虫活性无不利作用。
[0282] 我们的数据表明，使用我们在此描述了的程序，可制备以比别的方式可能的显著 更高的产量生产的任何富含半胱氨酸的杀虫肽（CRIP)。我们证实了使用我们描述了的高产 量技术，ICK和非ICK两种类型的CRIP的产量可显著增加。在此我们提供了两种非常不同 的CRIP类型的产量引人注目并出乎意料地提高的证据。
[0283] 可被转化的杀虫肽可选自杀虫毒液，例如蜘蛛的毒液。蜘蛛可以是澳大利亚漏斗 网蜘蛛。来自澳毒蜘蛛属或你属的肽是U-ACTX-Hvla及其类似物，并且采用本文 所述程序特别易于制备。本文提供的序列表中描述了来自蜘蛛的具体肽实例。这些肽和其 它肽可采用本文所述程序转化。
[0284] 可转化的杀虫肽可选自海葵毒素例如实施例3描述的ririt/is。海葵 在其正常生境中与澳毒蝴蛛属或属的漏斗网蝴蛛相距甚远，来自J/76WO/76 1 ririt/is的毒液不被视为与来自澳毒蝴蛛属或的有毒肽一样的ICK类型的毒 液，但是虽然海胆的毒液，像U-ACTX-Hvla毒肽和其它杀虫毒液一样，是ICK类型的毒液，但 它们全都是我们称为富含半胱氨酸的杀虫肽或CRIP的毒液类型，并在此首次如此鉴定出。 在所有部分中，本文所述程序预期并被认为与序列表的所有肽和与所述序列有关的本领域 技术人员将理解为是富含半胱氨酸的杀虫肽或CRIP的所有肽一起运作。所有的这类肽和 其它肽可采用本文所述程序转化。
[0285] 除所述方法以外，我们还公开了包含与肽的一端结合的二肽的新的高产肽，本文 为"HP肽"。在我们的实施方案中，所述肽是杀虫肽。在一个实施方案中，将二肽加到肽的N 端。我们证实了生产具有ICK和非ICK CRIP肽两者的高产量菌株的成功。在另一个实施 方案中，二肽由非极性氨基酸和极性氨基酸组成。在另一个实施方案中，非极性氨基酸选自 甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，极性氨基酸选自 丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸和酪氨酸。在一个具体的实 施方案中，HP肽包括被修饰以具有二肽甘氨酸-丝氨酸作为本未修饰的成熟肽的前2个氨 基酸的肽。HP肽可通过将甘氨酸-丝氨酸加到U肽及其类似物以产生HP肽来产生。
[0286] 通过本文所述方法制备的修饰肽是新的，并且分别被要求保护。这些肽通过其全 部性质而不仅仅是其序列来描述。这些肽是新的，并具有独特性质。本文公开并要求保护 HP肽及其制备方法两者。
[0287] 有用肽的实例是众所周知的，并可见于许多参考文献。有用肽的一个类别是杀虫 肽。杀虫肽可通过其肽性质及其活性、通常为口服或注射杀虫活性鉴定。在此我们提供几 个实例以更好地说明和描述本发明，但本发明不限于这些实例。所有的这些实例和在此未 显示的其它实例是对新的材料的描述，在此其首次被描述并要求保护。
[0288] HP (高产）肽在此定义为采用本文所述技术能够以大于正常生产率生产的任何 肽。所述肽可具有杀虫活性。通常，当给昆虫注射时，杀虫肽显示活性，但局部施用于昆虫 时，大多数没有明显活性。以多种方式测定HP肽的杀虫活性。测量的常用方法广为本领域 技术人员所知。所述方法包括但不限于根据各个参数例如瘫痪、死亡率、无法增加体重等的 计分，通过剂量反应图拟合，确定中值反应剂量（例如〇) 5。、^)5(|、^：5(|』05(|)。可针对暴露于 不同剂量的所述杀虫制剂中的昆虫组群进行测量。可通过产生由概率单位分析和/或希尔 方程等限定的曲线进行数据分析。在这种情况下，剂量可通过皮下注射、通过高压输注、通 过提供杀虫制剂作为食物或诱饵样品的一部分等来给予。
[0289] 所公开的用于提供实例的目的且无意以任何方式限制的HP肽的具体实例为来源 于澳大利亚漏斗网蜘蛛毒液的U肽及其同源物。这些肽的描述可参见本文件较早的部分。
[0290] 本说明书中的实例无意且不应用来限制本发明，它们仅供说明本发明。
[0291] 如上所述，许多肽是作为特别制备的处置方法主题的合适候选物。上文、下文和序 列表中所述序列是可特别制备的尤其合适的肽，且这些的一些已按照本发明特别制备，其 结果见下列实例。
[0292] GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A SEQ ID NO: 5 (-字母代码）。
[0293] 命名为"U+2-ACTX-Hvla"，在以下位置具有二硫桥：5-20、12-25、19_39。分子量为 4564. 85道尔顿。
[0294] GSRSC CPCYff GGCPff GQNCY PEGCS GPKV SEQIDN0: 29 (-字母代码）。命名为"Av3+2"，在以下位置具有二硫桥：5-19、6-13、 8-24。分子量为3076. 47道尔顿。
[0295] HP狀的制各 本文所述HP肽可如下制备。设计杀虫肽的可读框（ORF)使得将其核苷酸序列优化用 于物种特异性表达。下面显示的是通过将二肽加至杀虫肽的N端以提高来自酵母表达系统 的杀虫肽产量的方法的一个具体实例。二肽由非极性氨基酸和极性氨基酸组成。非极性氨 基酸可选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，甘氨 酸是优选的非极性氨基酸。极性氨基酸可选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、 酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，丝氨酸是优选的极性氨基酸。在下面的实例中，非极性氨基 酸位于二肽的N端，并且是甘氨酸。在下面的实例中，极性氨基酸位于二肽的C端，并且是 丝氨酸。
[0296] 如下设计杀虫肽ORF用于从宿主酵母细胞中分泌：0RF以信号肽序列开始，接着编 码Kex 2切割位点（赖氨酸-精氨酸）的DNA序列，接着在5'端加入甘氨酸-丝氨酸密码 子的杀虫肽转基因，最后以3'端的终止密码子结束。所有这些元件可在酵母细胞中作为单 一可读框表达成融合肽。α-交配因子信号序列最常用于促进重组杀虫肽通过重组酵母的 内源分泌途径的代谢加工，即表达的融合肽通常进入内质网，在其中α -交配因子信号序 列被信号肽酶活性除去，然后所得杀虫肽原可运输到高尔基体中，上述赖氨酸-精氨酸二 肽在其中被Kex 2内切蛋白酶完全除去，之后在其N端包含另外的非天然甘氨酸-丝氨酸 二肽的成熟的HP杀虫肽从细胞中分泌出来。
[0297] 为了提高杀虫肽在重组酵母细胞中的表达水平，杀虫肽ORF的密码子常被优化以 在特定的宿主酵母菌种中表达。指定宿主生物的内源可读框内观察到的天然存在的密码子 频率不一定被优化用于高效率表达。此外，不同的酵母菌种（例如乳酸克鲁维酵母、巴斯德 毕赤酵母、酿酒酵母等）具有用于高效率表达的不同最优密码子。因此，应对肽ORF包括编 码信号序列的序列元件、Kex2切割位点和杀虫肽，考虑密码子优化，因为它们在重组酵母细 胞中最初作为一个融合肽翻译。
[0298] 然后将密码子优化肽表达DNA连接至合适的表达载体用于酵母表达。有许多可用 于酵母表达的表达载体，包括附加型载体和整合载体，并且它们常被设计成用于特定的酵 母菌株。鉴于将用于肽生产的特定的酵母表达系统，应仔细选择合适的表达载体。我们在 此使用整合载体，其整合至转化酵母细胞的染色体中，并在整个细胞分裂和增殖周期中是 稳定的。
[0299] 表达载体通常含有用于在大肠杆菌中DNA制备的一些大肠杆菌元件，例如大肠杆 菌复制起点、抗生素选择标记等。载体还含有用于目标转基因表达所需的一系列序列元件， 例如转录启动子、终止子、酵母选择标记、与宿主酵母DNA同源的整合DNA序列等。有许多 可利用的合适的酵母启动子，包括天然和改造的启动子。在我们的工作中，使用了酵母启动 子例如pLAC4、pA0Xl、pUPP、pADHl、pTEF、pGall等。我们还使用下列常用的酵母选择标记 ： 乙酰胺原养型选择、zeocin抗性选择、遗传霉素抗性选择、诺尔丝菌素抗性选择、尿啼陡缺 乏选择。还可使用本领域的技术人员已知的其它标记。整合DNA序列与转化酵母菌种中的 定向基因组DNA基因座同源，所述整合序列包括pLAC4、25S rDNA、pA0Xl和TRP2等。杀虫 肽转基因的位置可在整合DNA序列附近（插入载体）或在整合DNA序列内（置换载体）。
[0300] 为了得到更多拷贝的整合至宿主酵母染色体的杀虫肽0RF，可设计并产生含有2 个或3个拷贝的杀虫肽表达盒的表达载体。表达载体中杀虫肽表达盒的每个拷贝可含有包 括启动子、信号序列、Kex2切割序列和杀虫肽转基因、终止密码子、转录终止子的独立和完 整的表达结构。
[0301] 然后将肽表达载体转化至酵母细胞中。首先，表达载体通常通过特定的限制性内 切酶切割线性化以利于通过同源重组的染色体整合。线性表达载体然后通过化学或电穿孔 转化方法转化至酵母细胞中，并通过同源重组整合至酵母基因组的定向基因座。整合可多 次发生在相同的染色体基因座；因此，转化酵母细胞的基因组可含有杀虫肽转基因的多个 拷贝。可利用有利于经工程改造进入表达载体并与杀虫肽转基因共整合至酵母染色体中的 选择标记的生长条件，来鉴定成功的转化体；这类标记的实例包括但不限于乙酰胺原养型、 zeocin抗性、遗传霉素抗性、诺尔丝菌素抗性和尿嘧啶原养型。
[0302] 由于不可预测和可变因素（例如基因和基因网络的后天修饰和进行转化程序的 群体中各个细胞中发生的整合事件数目的变化）的影响，指定转化过程的各个酵母转化体 在其广生转基因杀虫肤的能力上将不同。因此，可针对商广量菌株筛选携带杀虫肤转基因 的酵母转化体。用于这种筛选的两种有效方法（各依赖于转化体的小规模培养物的生长以 提供条件培养基样品用于后续分析），使用反向HPLC或家蝇注射程序以分析来自转化体的 条件培养基样品。
[0303] 转化体培养通常在14 mL圆底聚丙烯培养管（含5-10 mL确定成分培养基加入各 管中）或48孔深孔培养板（含1-2 mL确定成分培养基加入各孔）中进行。确定成分培养 基，不含未加工的蛋白质性提取物或副产物例如酵母提取物或蛋白胨，被用于培养以降低 收获用于稍后筛选步骤的条件培养基的蛋白质背景。培养在最适温度（例如对于乳酸克鲁 维酵母为23.5°C)下进行5-6天，直到达到最大细胞密度。杀虫肽此时由转化体产生，并分 沁到细胞以外进入生长培养基。为了制备用于筛选的样品，通过离心从培养物中除去细胞， 收集上清液作为条件培养基，然后使其通过〇. 22 Mm滤膜过滤澄清，之后使之准备就绪用于 杀虫肽生产菌株筛选，下面描述了所述筛选方法的两个实例。
[0304] 筛选方法之一是转化体的反向HPLC (rpHPLC)筛选。在这种筛选方法中，使用具 有C18键合相的HPLC分析柱。乙腈和水用作流动相溶剂，设置在220 nm处的UV吸光度检 测器用于肽检测。将适量的条件培养基样品加载到rpHPLC系统中，用线性梯度的流动相溶 剂洗脱。HPLC色谱仪中相应的杀虫肽峰面积用来定量测定条件培养基中的杀虫肽浓度。以 相同的HPLC方案，使已知量的纯杀虫肽通过相同的rpHPLC柱运行以证实肽的保留时间，以 生成用于定量的标准肽HPLC曲线。
[0305] 第二种筛选方法是家蝇注射测定法。当以实测剂量通过后胸体壁注射时，杀虫肽 可杀死家蝇。杀虫肽的效能可通过肽的致死剂量中值（LD50)定义，所述死剂量中值引起已 注射家蝇的50%死亡率。纯的杀虫肽通常用于家蝇注射测定法以生成标准剂量反应曲线， 从该曲线中可求出LD50值。利用来自所述纯的杀虫肽的标准剂量反应曲线分析的LD50值， 采用用系列稀释的相应条件培养基进行的家蝇注射测定法，可实现由酵母转化体产生的杀 虫肽的定量。
[0306] 杀虫肽生产菌株筛选可从数百个转化体中鉴定出高产量酵母菌株。当使用优化发 酵培养基和发酵条件时，可将这些菌株在生物反应器发酵以达到高达6 g/L的杀虫肽产量。 与采用在转化前用来生产肽的相同或类似生产方法的转化前的肽可能达到的产量相比，更 高的生产率可以是介于 20-400、20-100、20-200、20-300、40-100、40-200、40-300、40-400、 60-100,60-200,60-300,60-400,80-100,80-200,80-300,80-400,100-150,100-200, 150-200、200-250、250-300、250-350、250-400、300-350、300-400% 和 350-400 或所提供的 任何值的任何范围或甚至更高的产量。
[0307] 利用此处教导的程序和本领域的普通技术人员的知识，来自序列表的任何序列， 和据我们所知任何CRIP全都可用来制备类似于下文所述的我们称其为"U+2"肽的来自 澳大利亚布鲁山脉漏斗网蜘蛛的ACTX基序或我们在以下实施例中教导和描述的毒海葵 的Av3+2肽的高产肽。另外，任何其它合适的CRIP肽都可以类似的方式 用于生产高产肽或加2 (即+ 2)肽。
[0308] 高产狀的实施例 本说明书中的实施例无意且不应用来限制本发明，它们仅供说明本发明。
[0309] 实施例1 天然U和U+2-ACTX-Hvla在乳酸克鲁维酵母中中的表达。
[0310] 待表达的杀虫肤： U+2-ACTX-Hvla ： GSQYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID N0:5)和 天然 U-ACTX-Hvla : QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID N0:6)。
[0311] 为了在乳酸克鲁维酵母中表达上述两种杀虫肽，使用表达载体pKLACl和乳酸克 鲁维酵母菌株 YCT306,其可获自 New England Biolabs，Ipswich，MA，USA。pKLACl 载体是 一种整合表达载体。一旦将U+2和天然U-ACTX-Hvl转基因克隆至pKLACl并转化至YCT306 中，其表达受LAC4启动子控制。所得的转化体产生包含α-交配因子信号肽、Kex2切割位 点和成熟杀虫肽的前肽原（pre-prop印tide)。α-交配因子信号肽引导前肽原完成内源分 泌途径，最后将成熟杀虫肽释放到生长培养基中。
[0312] 在两轮中进行U+2-ACTX-Hv I a表达的密码子优化。在第一轮中，根据高表达DNA序 列的一些共同特征，设计了表达α_交配因子信号肽、 Kex2切割位点和U+2-ACTX-Hvla肽的 肽ORF的33个变体，并在乳酸克鲁维酵母的YCT306菌株中评价其表达水平，得到初步的乳 酸克鲁维酵母表达算法。在第2轮优化中，根据初步乳酸克鲁维酵母表达算法设计了 5个 更多的变体U+2-ACTX-Hvla肽ORF以进一步细调乳酸克鲁维酵母表达算法，并鉴定出用于 在乳酸克鲁维酵母中U+2-ACTX-Hvla肽表达的最佳0RF。该DNA序列具有编码α-交配因 子信号肽、Kex2切割位点和U+2-ACTX-Hvla肽的可读框。使用Hind III和Not I限制位 点，将优化的DNA序列克隆至pKLACl载体，得到U+2-ACTX-Hvla表达载体pLB10V5。
[0313] 为了使更多拷贝的优化U+2-ACTX-Hvla转基因在转化期间能够整合至乳酸克鲁 维酵母基因组，如下进行含有2拷贝的U+2-ACTX-Hvla表达盒的U+2-ACTX-Hvla表达载体 的产生：合成了 3,306 bp完整U+2-ACTX-Hvla表达盒DNA序列，其包含完整LAC4启动子元 件、密码子优化的U+2-ACTX-Hvla肽ORF元件和pLAC4终止子元件。然后将该完整的表达 盒在PLB10V5的pLAC4终止子下游的Sal I和Kpn I限制位点之间连接至pLB10V5载体， 得到双重转基因 U+2-ACTX-Hvla表达载体pLB10V5D。
[0314] 为了产生天然U-ACTX-Hvla表达载体，使用Stratagene位点定向诱变试剂盒，通 过使U+2-ACTX-Hvla转基因区的5'端的甘氨酸-丝氨酸密码子缺失，使pLB10V5载体诱 变。这种诱变得到含有单拷贝的密码子优化的天然U-ACTX-Hvla表达盒的新的载体pLB12。 为了产生双重转基因天然U-ACTX-Hvla表达载体，再次使用Stratagene位点定向诱变试 剂盒，以除去之前合成的3, 306 bp U+2-ACTX-Hvla表达盒转基因中U+2-ACTX-Hvla转基 因区的5'端的甘氨酸-丝氨酸密码子，接着通过连接将该诱变盒在Sal I和Kpn I限制 位点之间插入PLB12载体，得到质粒pLB12D，一种包含2个完整拷贝的密码子优化的天然 U-ACTX-Hvla表达盒的表达载体。
[0315] 然后按照乳酸克鲁维酵母蛋白质表达试剂盒所提供的说明书，使用Sac II限制 性内切核酸酶使双重转基因载体PLBlOVro和pLB12D线性化，并化学转化至乳酸克鲁维酵 母的YCT306菌株中。使所得的转化体在补充5 mM乙酰胺的YCB琼脂板上生长，仅乙酰胺 酶-表达的转化体可有效利用乙酰胺作为氮的代谢源。
[0316] 对于杀虫肽产量评价，从pLBlOVro转化体板中挑选出316个菌落，从pLB12D转化 体板中挑出40个菌落。将菌落的接种物各自培养在6 mL加入2%纯甘油作为碳源的确定 成分的乳酸克鲁维酵母培养基中。在280 rpm下振荡的同时，将培养物在23. 5°C下温育6 天，届时培养物中的细胞密度达到最大水平，如通过600 nm处的吸光度（0D600)所表明。然 后通过以4, 000 rpm离心10分钟，从培养物中除去细胞。所得上清液（条件培养基）通过 0.2 μ m膜过滤用于HPLC产量分析。
[0317] 对于肤产量评价，在配备Onyx monolithic 4. 5 X 100 mm、C18反向分析型HPLC 柱和自动注射器的Agilent 1100 HPLC系统中分析经过滤的条件培养基样品。HPLC级水和 乙腈，两者都含有〇. 1%三氟乙酸，构成用于HPLC分析的两种流动相溶剂。使用HPLC色谱 仪测量天然U和U+2-ACTX-Hvl两者的峰面积，然后用来计算在条件培养基中的肽浓度，然 后进一步将其归一化至相应的最终细胞密度（如通过0D600测量所测定）作为归一化肽产 量。
[0318] 采用家蝇注射生物测定评价肽的杀虫活性。将条件培养基系列稀释以生成来自家 蝇注射生物测定的完整剂量反应曲线。在注射前，成年家蝇你 /?sea 用CO2固 定，选择12-18 mg家蝇用于注射。使用加载Icc注射器和30号针的微型给药器，将0.5μ?7 蝇剂量的系列稀释的条件培养基样品通过后胸体壁给家蝇注射。将经注射的蝇放入具有潮 湿滤纸和盖上有呼吸孔的封闭容器中，在注入后24小时，通过死亡率评分对其进行检测。
[0319] 计算归一化产量。肽产量意指条件培养基中的肽浓度，单位为mg/L。但是肽产量 不总是足以精确比较菌株的生产率。各菌株可能具有不同的生长速率，因此在收获培养物 时，不同培养物的细胞密度可能改变。具有高细胞密度的培养物可能在培养基中产生较高 浓度的肽，即使菌株的肽生产率低于具有较高的生产率的另一个菌株。因此术语"归一化产 量"通过肽产量除以相应培养物中的细胞密度产生，这允许更好地比较菌株间的肽生产率。 细胞密度用600 nm处单位为"A"（吸光度单位）的吸光度表示。
[0320] 表1、图12和图13概括了来自乳酸克鲁维酵母菌株的U+2-和天然U-ACTX-Hvla 归一化肽产量分布。来自乳酸克鲁维酵母菌株的总体平均U+2-ACTX-Hvla归一化肽产量为 4. 06 ± 3. 05 mg/L.A，通过99%置信水平的Stuent's t检验，这统计显著性地高于平均的 天然U-ACTX-Hvla归一化肽产量2.73 ± 1.25 mg/L.A。U+2-ACTX-Hvla乳酸克鲁维酵母 菌株的归一化肽产量中值为9. 36 mg/L. A，这几乎是天然U-ACTX-Hvla菌株产量中值（3. 35 mg/L.A)的3倍。与天然U-ACTX-Hvla菌株相比，在高产量水平下U+2-ACTX-Hvla肽表达菌 株具有高得多的菌株计数比率。所有这些结果表明甘氨酸-丝氨酸二肽加至U-ACTX-Hvla 肽的N端有助于表达该肽的酵母转化体的预测产量的显著增加。
[0321] 表1表示来自乳酸克鲁维酵母菌株的肽产量的比较。
[0322] 表I. U+2和天然U-ACTX-Hvla肽产量比较
【权利要求】
1. 一种包含与富含半胱氨酸的杀虫蛋白（CRIP)例如抑制物半胱氨酸结（ICK)基序蛋 白有效连接的内质网信号肽（ERSP)的蛋白质，其中所述ERSP是所述蛋白质（ERSP-ICK)的 N端。
2. 权利要求1的肽，其中所述ERSP是将表达的CRIP导向植物细胞的内质网的任何信 号肽。
3. 权利要求2的肽，其中所述CRIP是抑制物半胱氨酸结（ICK)蛋白。
4. 权利要求2的肽，其中所述CRIP是非ICK蛋白。
5. 权利要求2的肽，其中所述ERSP是来源于植物的长度为5-50个氨基酸的肽。
6. -种与翻译稳定性蛋白（STA)有效连接的权利要求1的肽，其中所述ERSP是所 述蛋白质的N端，翻译稳定性蛋白（STA)可在任选为ICK基序蛋白（ERSP-STA-ICK)或 非ICK基序蛋白（ERSP-STA-非ICK)的CRIP的N端一侧；或者在ICK或非ICK基序蛋白 (ERSP-ICK-STA)或（ERSP-非 ICK-STA)的 C 端一侧。
7. -种具有添加至已知肽并与所述已知肽有效连接的N端二肽的肽，其中所述N端 二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成，其中所述肽选自 CRIP (富含半胱氨酸的杀虫肽），例如选自ICK肽或非ICK肽。
8. -种具有添加至已知肽并与所述已知肽有效连接的N端二肽的权利要求7的肽，其 中所述N端二肽由二肽N端的一个非极性氨基酸和二肽C端的一个极性氨基酸组成。
9. 权利要求8的肽，其中所述来自N端二肽的N端氨基酸的非极性氨基酸选自甘氨酸、 丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。
10. 权利要求8的肽，所述N端肽的C端氨基酸的极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱 氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸。
11. 权利要求8的肽，其中所述来自N端二肽的N端氨基酸的非极性氨基酸选自甘氨 酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，所述N端肽的C端氨 基酸的极性氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪 氨酸。
12. 权利要求11的肽，其中所述二肽由甘氨酸-丝氨酸组成。
13. -种包含至少两种类型的杀虫蛋白或肽的组合物，其中一种类型是成孔杀虫蛋白 (PFIP)，另一种类型是富含半胱氨酸的杀虫肽（CRIP)。
14. 权利要求13的组合物，其中所述CRIP是ICK，任选所述ICK源自于或来源于 Fersyte 或布鲁山脉漏斗网蝴蛛、Jtraz 包括称为 U-ACTX 多肽、U-ACTX-Hvla、rU-ACTX-Hvla、rU-ACTX-Hvlb 的毒素或突 变体或变体。
15. 权利要求14的组合物，其中所述CRIP是非ICK CRIP，任选所述非ICK CRIP源自 于或来源于具有非ICK CRIPS的动物，例如海葵、海胆和海蛤蝓，任选包括名为 hrit/i的海葵，任选包括名为Av2和Av3的肽，尤其类似于Av2和Av3的肽，包括序列表所 列出的这类肽或突变体或变体。
16. -种使用权利要求13的组合物控制Bt抗性昆虫的方法，所述方法包括产生至少两 种类型的肽的组合物，其中一种类型的肽是成孔杀虫蛋白（PFIP)，另一种类型的肽是富含 半胱氨酸的杀虫肽（CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白选自权利要求1和本文描述的任何组合物 和序列表提供的任何蛋白质；然后将所述组合物施用于昆虫所在地。
17. -种包括保护植物免遭Bt抗性昆虫在内的控制Bt抗性昆虫的权利要求16的方 法，所述方法包括产生表达至少两种正确折叠的肽的组合的植物，其中一种类型的肽是成 孔杀虫蛋白（PFIP)，另一种类型的肽是富含半胱氨酸的杀虫肽（CRIP)，且PFIP和CRIP蛋 白选自本文所述的任何组合物和选自序列表提供的任何蛋白质。
18. 权利要求16的方法，其中在PFIP影响昆虫肠内衬期间的任何时间给予CRIP。
19. 权利要求18的方法，其中在测试昆虫的Bt抗性后给予CRIP，且其中所述昆虫的Bt 抗性测试为阳性。
20. 将呈固体或液体形式的本文所述任何化合物施用于昆虫、昆虫所在地，或作为植物 结合杀虫剂施用。
【文档编号】A01N63/02GK104411714SQ201380024489
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年3月8日 优先权日:2012年3月9日
【发明者】R.M.肯尼迪, W.特德福德, C.亨德里克森, R.维纳布尔, C.富涅, J.麦金泰尔, A.卡尔森, 鲍林 申请人:韦斯塔隆公司