转基因植物的制作方法

发明技术领域

本发明涉及表型性状提高的转基因植株，包括盐害胁迫下植物长势明显增强，并对本发明中涉及到的方法、应用、核酸分离及载体克隆作了介绍。

背景技术：

盐碱地含有较高浓度的可溶性盐类，当土壤ece值超过4ds/m时，则可将其定义为盐碱土，相当于植物遭受约40mmnacl的盐胁迫，对应约0.2mpa的渗透压力。对盐碱地定义依据的ec值，是以对大多数农作物产量产生显著影响的数值为标准(munns&tester2008)。

盐害已经成为制约农业生产中种植面积扩大、产量增加的主要因素(shaoetal.,2005；rengasamy&marchuk,2011)，剖析盐胁迫下基因应答响应的分子机制，并将相关基因推广应用在提高农作物耐盐性上，由此可以应对逐渐增加的人口所带来的食品和能源安全问题。

由于高盐胁迫含有较高浓度的na⁺离子，对植物的胁迫可分为两个类型：胁迫早期的非生物胁迫和胁迫后期的离子毒害。盐害早期的非生物胁迫会引起植物组织和细胞的生理干旱现象，而接下来胞质中累积过量的na⁺和高的na⁺/k⁺比值，则使细胞功能紊乱，达到离子毒害程度。因此，植物耐盐机制的实质是维持细胞水平和整株水平的钠/钾平衡。为此，在细胞水平上，植物通过将na⁺离子排出细胞外及将胞质中过量的na⁺离子存储在液泡中，来维持细胞水平上的钠/钾平衡。在整株水平上，植物通过卸载根木质部中钠离子含量，减少其向地上部分的运输，来维持植株叶片中较低的na⁺含量，即排钠作用(munns&tester2008)。

高盐胁迫下，钠离子通过无选择性离子通道(nsccs)顺浓度梯度进入细胞。之后，钠离子通道关闭，由于钠离子竞争高亲和性及低亲和性的钾离子转运载体上的结合位点，导致胞质内的钾离子降低，看来在na⁺胁迫下，保持较高的k⁺转运可以有效维持钠/钾平衡，达到耐盐效果。

高亲和性钾离子转运蛋白基因(high-affinitypotassiumtransporter)编码膜转运蛋白，为trk/ktr/hkt蛋白家族成员，在高等植物钠、钾离子转运中起重要调节作用。hkt蛋白家族成员较多，结构和功能各异，具有钠钾协同转运或高亲和性与低亲和性钠离子选择转运功能。亚家族1中成员具有na⁺选择转运功能，尤其重要的是不同突变位点的hkt蛋白可能具有不同的功能特性以及不同的钠钾离子的亲和特性。根据hkt蛋白的结构和功能可划分为亚家族1和亚家族2，关于钾离子转运的氨基酸基序尚不清楚。基于此，蛋白功能特性的预测尤其是钠钾离子的选择特性，仅从氨基酸序列结构上推测较为困难。

双子叶模式植物拟南芥(arabidopsis)中仅含有一个hkt蛋白家族成员athkt1:1，被证明在非洲爪蟾卵母细胞(xenopuslaevisoocyte)中具有na⁺选择转运特性。athkt1:1可调控na⁺在植株地上部与地下部的分布，通过卸载根部木质部中na⁺离子向上运输和加载叶片中na⁺离子向韧皮部中回流至地下部，来减少地上部na⁺离子的积累。在农作物上，hkt蛋白的耐盐机理主要是减少地上部叶片中钠离子的积累。在水稻(oryzasativus)中发现提高植株耐盐性的主要功能基因skc1，通过对nonabokra×koshihikari杂交分离群体进行qtl定位找到该功能位点。skc1位点编码hkt转运蛋白oshkt1；5，具有na⁺离子转运特性，可降低na⁺离子进入植物蒸腾体系，进而减少其向叶片中的运输。在小麦(durumwheat)中也分离得到耐盐的功能位点nax2基因，命名tmhkt1；5-a，降低木质部中na⁺离子含量减少向叶片中的运输，相比该位点缺失的近等基因系，含nax2位点的株系在盐碱地中小麦产量可提高25％(munnsandtester2008)。

亚家族2成员在有关na⁺离子进入植物外层细胞方面起作用。在小麦(triticumaestivuml.)根中克隆的tahkt2；1为第一个被发现的亚家族2成员，介导na⁺-k⁺离子协同运输。后来发现在高盐胁迫下，tahkt2；1对钾离子的转运被限制，而是介导根部低亲和性的钠离子吸收(gassmannetal.,1996)。

保持细胞中钾离子执行正常生理功能的浓度是一个重要的植物耐盐机制。在大多数农作物中高nacl浓度会引起钾离子外流，且对钾离子的吸收比较困难。然而，一些盐土植物中，如盐芥(thellungiella)和星星草(puccinelliatenuiflora)中hkt蛋白，相比钠离子而言，对钾离子具有较强的选择吸收特性，这与淡土植物中hkt具有显著区别(wangetal.,2002；wangetal.,2004)。绝大多数粮食作物和重要的生物质能源植物，包括高粱(sorghumbicolor)都属于淡土植物。盐土植物具有高na⁺离子胁迫下，维持k⁺平衡的竞争优势，而在淡土植物中，在nacl存在的条件下，hkts家族成员是否仍对钾离子具有选择吸收特性的研究较少。

培育较强耐盐特性且具有较高产量的农作物非常必要，本发明则应对这一需求而研发。发明人研究了高粱hkt基因家族的成员sbhkt1；4基因的功能特征。与已报道的一些农作物中hkt的功能不同，在酵母异源表达系统中，在外界高na⁺条件下sbhkt1；4仍具有较明显的钾离子转运活性；转基因拟南芥株系也被证明具有在高na⁺条件下对钾离子的转运。高粱sbhkt1；4基因可被用来提高作物耐盐性研究上。

技术实现要素：

发明人从高粱基因组中分离克隆出hkt蛋白家族成员4个，而在高na⁺和充足k⁺离子的条件下，仅sbhkt1；4基因表现出明显的上调表达。同时，发明人发现sbhkt1；4具有显著的高钠条件下吸收钾离子的功能，这与盐土植物中hkt蛋白对钾离子的选择特性较为类似。其余高粱hkt蛋白家族成员则不具备该功能。

在本发明的第一个方面，涉及转基因植株的组成，包括转基因载体中目标核苷酸序列seqidno.1或序列突变造成功能变异的序列，但其与seqidno.1的同源性需达75％以上。

在第二方面，本发明涉及此处提及到的植株所衍生出来的结果。

在另一方面，本发明提供一种增加植物耐盐性的方法，包括提出及在植物中表达一段核苷酸序列结构或者其发生功能突变的序列结构，其中功能突变序列和seqidno.1序列同源性达75％以上。

在又一方面，本发明提供一种提高生长量或产量的方法，包括提出及在植物中表达一段核苷酸序列结构或者其发生功能突变的序列结构。

在另一方面，本发明提供一种盐胁迫下调控钾离子吸收的方法，包括提出及在植物中表达一段核苷酸序列结构或者其发生功能突变的序列结构，其中功能突变序列和seqidno.1序列同源性达75％以上。

在又一方面，本发明提供一种转基因的方法，包括提出及在植物中表达一段核苷酸序列结构或者其发生功能突变的序列结构，其中功能突变序列和seqidno.1序列同源性达75％以上。

在另一方面，本发明涉及通过此处提及的方法所获得和可能获得的植株。

在又一方面，本发明提供一种分离克隆的核苷酸序列seqidno.3。

在另一方面，本发明提供一种载体构建，包括将序列seqidno.3或对其碱基替换后发生功能突变的序列，此处突变后序列与seqidno.1的同源性达75％以上，构建入载体中。

在又一方面，本发明提供一种载体构建，包括将序列seqidno.1或对其碱基替换后发生功能突变的序列，此处突变后序列与seqidno.1的同源性达75％以上，构建入载体中。

在另一方面，本发明提供一种分离的宿主细胞，根据声明29中提到的宿主细胞指一类植物细胞或细菌细胞。

在又一方面，本发明提供一种利用一个分离克隆的核苷酸序列或上述提及构建的载体，来提高植物耐盐性，并在盐害胁迫下，维持植株体内钠钾平衡，以增加植物的长势和产量。

附图说明

本发明通过下列图表进一步阐述。

图1.高粱(sorghumbicolour)高亲和性钾离子转运蛋白的特征。a，sbhkts基因的结构。b，高粱hkt蛋白编码区保守区序列比对分析。“*”代表pa-pd保守位点的甘氨酸或丝氨酸。“●”代表tshkt1；2中与k⁺转运相关的保守位点asp-207，asp-238。“#”代表tahkt2；1中与耐盐功能相关的保守位点ala-240，leu-247，gln-270，asn-365，glu-464。

图2.hkt蛋白家族最小进化关系聚类分析(10,000重复)。缩写：at:拟南芥(arabidopsisthaliana)；bo：甘蓝(brassicaoleracea)；cn：新型隐球菌(criptococcusneoformans)；ec:赤桉(eucalyptuscamaldulensis)；hv：大麦(hordeumvulgare)；kp：(komagataellapastoris)；mc：冰叶日中花(mesembryanthemumcrystallinum)；mt：蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)；nc：粗糙脉孢菌(neurosporacrassa)；os：水稻(oryzasativa)；pha：芦苇(phragmitesaustralis)；pp：小立碗藓(physcomitrellapatens)；pt:杨树(populustrichocarpa)；put:星星草(puccinelliatenuiflora)；sab:海蓬子(salicorniabigelovii)；sb:高粱(sorghumbicolor)；sc：酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)；sm：江南卷柏(selaginellamoellendorffii)；so：酵母(schwanniomycesoccidentalis)；sp：粟酒裂殖酵母(schizosacchromycespombe)；ss：盐地碱蓬(suaedasalsa)；ta：普通小麦(triticumaestivum)；ts：(thellungiellasalsugenia)；tm：一粒小麦(triticummonococcum)；vv：葡萄(vitisvinifera)；wc：威克汉姆西弗酵母(wickerhamomycesciferrii)；yl：解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)；zm：玉米(zeamays)。辐射树形图通过hkts的氨基酸序列比对，由mega软件作图。比例尺为代表0.1个单位。

图3.高粱耐盐品种与盐敏感品种盐处理后表型分析。a，200mmnacl处理14天的地上部盐害表型(2007，耐盐品种；ji2731，盐敏感品种)。发芽5天的幼苗转移至液体培养基生长1周后，挑选12株生长一致植株，加入5m的nacl至200mmnacl.b，两高粱品种的第三片叶盐害表型。c,，地上部干重比、鲜重比及叶绿素含量。nacl处理两周后，取各品种30个植株的地上部，进行鲜重、干重的测量。柱形图数据以平均值±标准偏差(mean±sd)表示。d,e,f，地上部及根中na⁺、k⁺含量及na⁺/k⁺比值。nacl处理3天后，取地上、地下部分作为检测样品，采用电感耦合等离子体发射光谱仪(icp,inductivecoupledplasmaemissionspectrometer)进行离子含量测定，数值以平均值±标准偏差(mean±sd)表示。实验重复三次，不同的小写字母代表p＜0.05差异显著水平(duncan测验)。

图4.sbhkt1；4基因的表达模式。a，高粱耐盐品种2007与盐敏感品种ji2731的不同组织部位hkt基因rt-pcr分析。于抽穗期分别取根(r),茎(s)，叶(l)，叶鞘(sh)，叶脉(v)部位提取rna，反转录成cdna文库。b，高粱hkt蛋白在烟草(nicotianabenthamiana)表皮细胞瞬时表达的亚细胞结构定位。

图5.qrt-pcr分析胁迫1h,12h,24h高粱sbhkt1；4基因在高粱耐盐品种2007及盐敏感品种ji2731中的表达。1/2hoagland营养液添加200mmnacl及200mmnacl+5mmkcl进行胁迫处理。数据显示means±sd。两次重复。

图6.高粱hkt(sbhkt1；3,sbhkt1；5和sbhkt2；1)，na⁺/h⁺逆转运蛋白nhx和sos基因家族在高粱耐盐品种2007及盐敏感品种ji2731地上部(a)、根部(b)胁迫下表达分析。处理12h采样进行反转录pcr。数据显示means±sd。两次重复。基因：sbnhx1,sb02g042190；sbnhx2,sb05g025700；sbnhx4,sb09g003590；sbnhx3,sb10g012140；sbsos1,sb08g023290.

图7.酵母突变体中sbhkt1；4基因的功能分析。a，g19(mata,his3,leu2,ura3,trp1,ade2,andena1::his3::ena4)突变菌株酵母异源表达sbhkt1；4，athkt1；1，atkat1及空载体pyes2的菌株的生长抑制试验。b，图3-19高粱sbhkt1；4基因及阳性对照nchak(neurosporacrassa)在w△6(mataade2ura3trp1trk1d::leu2trk2d::his3)突变菌株中的互补实验。转化子培养在ap培养基添加不同浓度的钠钾离子。菌液初始浓度od600为0.7，依次以10倍浓度梯度稀释。30℃培养四天，取照记录。实验重复三次。

图8.sbhkt1；4基因表达在非洲爪蟾卵母细胞中产生时间依赖性的激活电流。a,b，sbhkt1；4离子选择性。电解液中依次加入10mmli⁺，na⁺，k⁺，cs⁺或nh4⁺，设定膜电压为-60mv时，记录出现稳态电流振幅。柱形图中数值为means±sd(n＝5)。c,d，代表性的电压依赖性的细胞电流变化。对表达sbhkt1；4基因的非洲爪蟾卵母细胞，灌注含有10mmnacl,6mmmgcl2,1.8mmcacl2,185mmmannitol和10mmmes-tris的电解液，以水作为对照，记录超激化电流脉冲。电流电压关系图为5个细胞在电压由-100mv至+40mv的变化范围内，相应产生的电流变化推断得出。e,f，sbhkt1；4介导钠离子的内流。膜电位设定在-60mv，依次灌注含有1，3，8mmna⁺的电解液，记录稳态电流振幅。数值代表means±sd(n＝5)。

图9.sbhkt1；4的电导作用依赖外界na⁺/k⁺比值而变化。a,c，依次向表达sbhkt1；4基因的非洲爪蟾卵母细胞，灌注含有10mmk⁺,5mmna⁺,10mmk⁺+5mmna⁺的电解液(a),含有50mmk⁺,5mmna⁺,50mmk⁺+5mmna⁺的电解液(c)，所产生的稳态电流振幅。膜电位为-60mv，持续50秒。b,d，灌注不同离子含量电解液的稳态电流振幅平均值(n＝3)。电解液组成分别同a,c。数值代表平均值±标准偏差(mean±sd)。

图10.sbhkt1；4转基因植株的na⁺胁迫实验。col-gl1为野生型，06l6-2，06l2-14及06l8-7代表三个单独的sbhkt1；4基因在突变体athkt1-1中过表达的转基因植株。a，转基因植株中sbhkt1；4基因的表达及不同离子组合(图示nacl,kcl,licl浓度，单位mm)胁迫处理下的表型分析。上为rt-pcr检测的sbhkt1；4基因在三个转基因株系的表达量。10天大的幼苗在胁迫培养基上的表型监测，胁迫7天照相记录。b，sbhkt1；4转基因植株，athkt1-1突变体及野生型col-gl1的地上部鲜重。每组数值统计至少20株幼苗，三次重复，数值代表平均值±标准偏差(mean±sd)。c-e，sbhkt1；4转基因植株，athkt1-1突变体及野生型col-gl1的na+(c)，k+(d)及na+/k+比(e)。1/2ms培养基中发芽三周的幼苗，进行2天液体培养后，于培养液中加入2mnacl和2mkcl的母液，直至调整营养液的浓度至75mmnacl,75mmnacl+5mmkcl，以分别进行两种胁迫处理。液体基本培养基作为对照。48小时处理后，每个株系取50株幼苗的地上部分，烘干进行离子含量测定。不同字母代表一个转基因株系在三种处理间的差异显著性p＜0.05水平(duncan测验)，实验重复两次。

图11.缺钾胁迫下col-gl1,athkt1-1突变株及sbhkt1；4转基因植株的表型分析。06l6-2，06l2-14及06l8-7代表三个单独的sbhkt1；4转基因植株。a，植株缺钾响应。sbhkt1；4转基因植株在20mmnacl+0mmkcl及20mmnacl+5mmkcl离子组合胁迫处理下的表型分析。处理12天拍照记录，比例尺为1cm。b，处理12天后，取各株系至少20株幼苗地上部进行鲜重测量。三次重复，数值代表平均值±标准偏差(mean±sd)。(c)na⁺含量，(d)k⁺含量及(e)na⁺/k⁺比值采用icp测定。离子含量测定取材方法同图10注释，小写字母代表一个转基因株系在两种处理间的差异显著性p＜0.05水平(t测验)，实验重复三次。

具体实施方式

现将本专利进一步描述。接下来的段落中，专利的不同方面将被详细阐述。所述专利的每个方面可能连同任何其他方面一起在内，除非说明明显与之相悖。尤其，作为首选或者有利的任何特征都可能连同其他优点一起包括在内。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、dna重组及生物信息学技术。这些技术在文献中进行了充分解释。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的dna分子(例如，cdna或者基因组dna)，rna分子(例如，信使rna)，自然类型，突变类型，合成的dna或rna分子，核苷酸类似物组成的dna或rna分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的dna核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cdna中的编码序列，和/或包括cdna及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cdna。

术语“缩氨酸”、“多肽”及“蛋白”，此处可以互换使用，指通过肽键连接起来，不同长度的氨基酸聚合物。

本专利中所提及到的“基因转移”，“转基因”或者“重组体”主要是指，一段核苷酸序列、表达组件、基因或者包括一段核酸序列的载体，或在有机体中表达一段核苷酸序列、表达组件、基因或者包括一段核酸序列的载体。它们都是通过重组的方法获得的，主要有以下方法：a)专利中涉及到的核酸序列编码蛋白质的方法，b)基因组控制，如本专利中提到的在核酸序列中加入启动子序列，c)或上述两种重组序列。这些核酸序列都不是在自然的遗传环境中存在，而是通过重组修饰的方法获得的。通过这种改造可以得到如下修饰，即：替换、添加、删除、转位或插入一个或多个核苷酸残基。自然的遗传环境有助于在基因文库中理解自然基因或染色体位点在原始的植物中的意义或存在形式。对于基因组文库而言，自然的遗传环境最好的保留了大部分有用的核酸序列。在核酸侧翼序列的一侧有至少50bp或500bp、1000bp、5000bp的核酸序列。自然表达组件——例如本专利的方法中用到的天然组合的启动子与相应的核酸序列编码多肽的组合。当用人为的方法对这些表达组件进行修饰，它就成为了一种转基因表达构建，如定点突变处理。这种方法在us5,565,350和wo00/15815中均有描述。

因此转基因植株在本专利中的意义，如上，专利方法中提及的核酸序列不在该植物基因组的自然位点，其异源或同源性表达是可能的。然而，如上所述，转基因也指当在不同实施例中，核酸位于植物基因组的天然位置时，对天然序列或其调控序列进行了修饰。专利中提到的转基因是指基因组非天然部位的核酸序列的表达，如同源或异源表达系统。根据本专利，转化基因稳定地整合到植物基因组中，并且使用其纯合的转基因植株进行后续研究。

本专利中涉及dna重组技术和依据传统的育种方法获取转基因植物的方法。

根据在高盐环境下植物生长情况的不同，可将植物分为盐土植物和淡土植物两大类(munnsandtester2008)。然而，大多数植物都属于淡土植物，很容易遭受钠离子胁迫，盐土植物则是一种相反类型的植物，至少可以耐受200mmnacl胁迫，它们可在高盐胁迫下维持胞质中的k⁺/na⁺平衡。

在实施例中陈述的sbhkt1；4是从淡土植物高粱中分离得到的hkt亚家族1中的成员，在钠离子胁迫下可以介导钾离子的转运，参与植物体内钠钾离子平衡的调节，从而维持植物在高钠胁迫条件下的长势。因此，sbhkt1；4对高盐条件下高粱的生长具有重要的调节作用。

值得关注的是，研究者并没有从高粱中分离到的其他hkt家族的成员中发现类似sbhkt1；4的功能。同时，在小麦等其他作物中的sbhkt1；4的同源基因，也未见这种类似的功能。tahkt2；1是小麦hkt亚家族1的成员，其介导钾离子的转运功能被抑制，而产生低亲和性的钠离子吸收功能(gassmannetal.1996)。玉米与高粱的亲缘关系较近，但从中只分离得到了zmhkt1；5和zmhkt2；1两个成员，并没有找到sbhkt1；4的同源基因。

在本实施例中sbhkt1；4具有高亲和的钠离子吸收特性。例如，该基因过表达的转基因植株可以吸收钠离子，使钠离子含量升高从而抑制植株的生长，加速其衰老和死亡。可以使用不同的方法，将这种具有高亲和的钠离子吸收特性的sbhkt1；4加以利用，从而增强植株的耐盐性。在实施方案中，利用组织特异性的启动子将sbhkt1；4在植物中表达，如利用在木质部特异表达的启动子使该基因在根部薄壁细胞表达从而卸载根中的钠离子防止其向地上部运输。除此之外，sbhkt1；4还可以在高钠条件下介导钾离子的吸收，从而减轻高盐胁迫对植物的危害。酵母功能互补实验表明，在外源添加低浓度的钾离子的条件下，sbhkt1；4具有互补钾离子吸收缺陷菌株w△6的能力。转基因植株的试验也同样证明了这一点。将sbhkt1；4/athkt1-1植株种植在生长培养基上，在高钠条件下添加足量钾离子，转基因植株可以吸收更多的钾离子，维持na⁺/k⁺平衡。因此，sbhkt1；4可以介导植物在高钠条件下对钾离子的吸收，从而减轻盐土中较高钠离子对植物的负面影响。因为盐土中同样含有钾离子，所以这一发现意义重大。含有该基因的植物在高盐条件下可以吸收钾离子，表现出较好的耐盐性，产量和生长情况也较为理想。然而，大多数作物表现出盐敏感性，由于其没有sbhkt1；4的同源基因，可能缺少高钠条件下钾离子吸收的能力。

由于高钠条件下钾离子的吸收特性对于维持植物体内的na⁺/k⁺平衡、增加耐盐性具有重要意义，与对照相比，本专利中的sbhkt1；4的转基因植株对有钾条件下，应对盐胁迫的抗性更强。

因此，在本发明的第一个方面，转基因植物表达一核酸序列结构包括编码sbhkt1；4蛋白的序列。表达的核酸序列结构包括sbhkt1；4基因组序列(seqidno.1)及其发生功能突变的序列，sbhkt1；4的cdna序列(seqidno.3)及其发生功能突变的序列。同时包括与sbhkt1；4氨基酸序列(seqidno:2)，同源性达到75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％，82％,83％,84％,优选同源性达85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％，92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,和99％的基因序列，首选同源性95％以上的序列。

本专利提及的一段核酸或多肽序列的“功能突变体”术语，例如有关seqidno:1中序列，是指保留了完整的生物功能的非变异的sbhkt1；4核酸或肽序列的一个变种基因序列或部分基因序列。如在转基因植物中表达后植株的耐盐性提高。一个功能性的变异也包含感兴趣的基因的一部分氨基酸的改变不影响产生的蛋白质的功能，如在非保守残基中的变异。同时，也存在一种大体上相同的变异，如与野生型序列相比，突变体中只有部分序列发生变异，如非保守区，但其生物学活性仍然存在。

因此，本专利提及的方法和用途不仅包括sbhkt1；4(核酸序列seqidno:1，氨基酸seqidno:2)，同时也包括sbhkt1；4的变体，如seqidno:1和2中所列出的序列信息，它们的变化并没有影响蛋白的生物学活性与功能。已有研究发现，核酸序列的改变使得蛋白某一位点的氨基酸序列发生改变，但最终并没有影响其所编码的多肽的功能。例如，将疏水性氨基酸丙氨酸的密码子用疏水性弱的甘氨酸或疏水性强的缬氨酸、赖氨酸或异亮氨酸代替。

同样的，将一个带负电荷的氨基酸突变为另一个(如天冬氨酸突变为谷氨酸)，或将一个带

有正电荷的氨基酸突变成另一个(如赖氨酸突变为精氨酸)也可以得到功能相似的产物。每一种设想的改造都可以通过常规方法获得，同时保留它们所编码的产物的生物学功能。但这些改造不包括对蛋白保守结构域和信号元件的突变。

综合本专利的各个方面，sbhkt1；4功能突变体的核酸或多肽序列与野生型的同源性至少达75％以上，采用本领域公认同源性比对技术，优选与idsno.1，3和2中的序列同源性到85％,86％,87％,88％,89％,90％,92％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的同源性的序列。

本专利中涉及的方法和用途，不仅包含sbhkt1；4，也包括其中一些片段。这些“片段”可能是核苷酸、氨基酸或蛋白序列的一部分。核苷酸片段编码了蛋白片段，保留了天然蛋白的生物学活性，因此可以调节植物对盐胁迫的响应。

本专利中所提到的盐胁迫可分为中度和重度盐胁迫，中度或轻度胁迫条件也可以表达为不严重的胁迫。换句话说，中度胁迫与重度胁迫不同，它并不会引起植物死亡。中度胁迫是不会致死的胁迫条件，野生型植株可以在其中存活，但其生长速率和种子产量都会降低，当然，长期中度胁迫也会引起植物发育停顿。这种减少可以达到5％-50％或者更多。植物对重度胁迫的抗性可以用成活率来度量，中度胁迫并不影响成活率，而是对生长率有所影响。中度胁迫的准确定义因植物种类和气候带而异，但总的说来，它不会导致植物死亡。

盐胁迫是一种盐离子存在下的中度或重度胁迫。盐土通常的naci浓度接近40mm，ece值为4ds/m，渗透压接近0.2mp。大部分植物可以忍受4到8ds/m的胁迫，但其较适生长条件和产量将会受到影响。对水稻而言，一般认为土壤盐度接近4ds/m为中度胁迫，若超过8ds/m则太高了。ph8.8-9.2可以认为是没有受到胁迫，ph9.3-9.7为中度胁迫，ph大于等于9.8则为重度胁迫。因此，盐胁迫条件主要是指ece值大于等于4ds/m(如4ds/m到8ds/m)，或者nacl浓度大于等于40mm(如40mm到100mm或200mm)的条件。

hkt蛋白由4个保守的mpm基序组成。第一个跨膜mpm基序的p-loop中保守位点含一个甘氨酸或丝氨酸残基，它们可以决定阳离子的转运特性。根据第一个p-loop区域保守位点氨基酸的不同，hkt基因家族可分为两个亚家族：亚家族1的第一个跨膜mpm基序的p-loop中保守位点为丝氨酸(ser-gly-gly-gly)，为na⁺特异性转运载体；亚家族2的第一个跨膜mpm基序的p-loop中保守位点为甘氨酸(gly-gly-gly-gly)，具有na⁺-k⁺协同转运特性。hkt基因家族的蛋白结构均含有保守的trkh结构域(pfamaccessionnumberpf02386)，与钾离子的转运相关。sbhkt1；4的突变体保留了一个或多个这种保守结构。

seqidno.2中列出了本专利中涉及的sbhkt1；4的多肽序列，同时也有与其同源度达到90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的氨基酸序列，且具有mpm基序的p-loop中保守位点为丝氨酸(ser-gly-gly-gly)。图1显示了sbhkt1；4的mpm基序信息，其中s121，g503和g279位点为保守位点。q303，n398和e495位点与已报道的tahkt2；1中的功能位点q270,n365和e464相对应，这些位点在钠离子转运中具有重要作用。

有实验证据表明，第一个p-loop区域保守的甘氨酸位点是亚家族2的特征，这一位点与k⁺的选择吸收特性密切相关。图1b列出了与钾离子转运密切相关的保守位点，其中，星号代表保守的甘氨酸和丝氨酸位点。tshkt1；2中的asp-207,asp-238位点与钾离子转运相关在图中用黑点标出。tahkt2；1中用#标出的ala-240,leu-247,gln-270,asn-365,glu-464位点与该基因的耐盐性相关。

然而，最近的研究还表明,k⁺的运输亲和特性不能仅仅用保守位点的甘氨酸来判别。一些hkt亚家族1中的成员也具有较强的钾离子亲和性(liu等，2001；ali等，2012)。我们研究发现亚家族1的成员sbhkt1；4具有明显的钾离子吸收特性。这些结果表明，除了甘氨酸残基之外，其他位置的氨基酸也有可能与钾离子的吸收有关。

在盐生植物盐芥中，定点突变获得tshkt1；2的d207n和d238n的突变体，表明这两个位点与钾离子的转运有关(ali等，2012)。然而，序列比对结果显示sbhkt1；4的ser-227和asn-308位点分别与tshkt1；2的d207和d238相对应。比较有趣的是，sbhkt1；4中ser-227和asn-308位点与赤桉e.camaldulensisechkt1；1和echkt1；2蛋白中相应位置的氨基酸相同。此外，这些位点在毕氏海篷子、冰叶日中花和盐地碱蓬的hkt亚家族1成员中也是保守的。

在tahkt2；1中分别点突变a-240,l-247,q-270,n-365,e-464后，转基因酵母的耐盐性得到提高(rubio等，1995,1999；diatloff等，1998)。sbhkt1；4蛋白具有与tahkt2；1中q-270,n-365,e-464一致的氨基酸，可以推测这些位点在sbhkt1；4中也具有重要的na⁺结合功能。

本发明专利中涉及到任何单子叶或双子叶植物均可表达sbhkt1；4。因此,获得sbhkt1；4的转基因高粱植株是可行的。倘若可以将sbhkt1；4转到其他植物中以提高它的耐盐性，那将是一个很好的应用。需要指出的是，研究者发现，在双子叶植物拟南芥中sbhkt1；4是有功能的，但在其他物种中的功能似乎与高粱中的sbhkt1；4功能不同。

可以将双子叶植物从亚家族中选择出来，但不限于菊科、十字花科(如芸苔属植物)、藜科、葫芦科、豆科(苏木科,含羞草科,蝶形花科或豆科)、锦葵科、蔷薇科和茄科。例如，可能从以下植物中进行选择：生菜、向日葵、拟南芥、花椰菜、菠菜、西瓜、南瓜、白菜、西红柿、土豆、山药、辣椒、烟草、棉花、秋葵、苹果、玫瑰、草莓、紫花苜蓿、大豆、蚕豆、豌豆、扁豆、花生、鹰嘴豆、杏、梨、桃、葡萄树或柑橘类物种。油料作物包含其中，还包括生物燃料和生物能源作物,如油菜、甘蔗、甜高粱、柳枝稷、亚麻籽、羽扇豆和柳树、杨树、芒草或裸子植物，如火炬松。还包括有以下用途的作物：青贮饲料(玉米)、牧草或饲料(禾本科植物、三叶草、红豆草、苜蓿),纤维(如棉、亚麻),建筑材料(如松树、橡树)，制浆(如杨树),化工原料(如高芥酸油菜,亚麻籽)和舒适的目的(如高尔夫球场草坪草),公共和私人花园观赏植物(如金鱼草、矮牵牛、玫瑰、天竺葵、烟草)和家庭切花(非洲紫罗兰、秋海棠、菊花、天竺葵、彩叶吊兰、龙血树、橡胶)。

单子叶植物，从中选择的棕榈科，石蒜科或禾本科较为适宜。该植物可以是谷类作物，如小麦，水稻，大麦，玉米，燕麦，高粱，黑麦，粟，荞麦，草坪草，意大利黑麦草，甘蔗或羊茅，也可以是洋葱，韭菜，山药和香蕉等。农作物较为理想，对于满足人类和动物消费具有重大的经济效益。其中最为理想的植物是玉米，水稻，小麦，油菜，高粱，大豆，马铃薯，番茄，烟草，葡萄，大麦，豌豆，菜豆，羽扇豆，莴苣，棉花，甘蔗，甜菜，西兰花或其它芸薹属植物或白杨。

本专利中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们感兴趣的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

本专利包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

本专利还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

在一个实施方案中，核酸构建中包括一个调节元件。

术语“调控元件”可理解为本专利中用到的“控制序列”、“启动子”以及其它调控基因表达的元件，可以影响基因的表达。“启动子”通常是指一个基因的转录起始位点上游的核酸控制序列，用来识别和结合rna聚合酶或其他蛋白质，从而引导核酸的转录。上述术语是典型的真核生物的转录调节序列(包括tatabox，转录精确起始所必需，含有或没有一个ccaatbox序列)和额外的调节元件(如上游的激活序列、增强子和沉默子)，它们在植物生长发育过程和应对外界刺激时影响基因的表达或表现出组织特异性。本专利中也涉及一类经典的原核基因表达序列转录调节因子。

术语“调节元件”也包括生物合成的融合分子或激活、增强核酸分子表达的细胞、组织或器官。“植物启动子”包含调节元件，它可以调节植物中基因的表达。启动子不仅可以是植物来源的，也可以源自病毒或微生物，例如，用病毒浸染植物细胞。“启动子”也可以源自植物本身，例如本专利中用于转化的核酸序列。启动子上游的核酸序列在本专利中也具有重要作用。可以在不影响启动子功能的前提下对其核苷酸进行替换、插入或缺失突变，对开放阅读框(orf)或3'调节区如终止子或其他远离orf区域的3'调节区进行修饰。可以通过上述途径增强启动子的活性，也可以用活性更强甚至是异源的启动子来替换它以增强活性。如前所述，核酸分子必须与相应的启动子连接，这样可以确保基因在植物中正确的时空表达。为了鉴定启动子的功能、强度和表达模式，可以将候选启动子与报告基因连接，并在不同植物组织中测定其表达水平和模式。比较常用的报告基因有β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶。

术语“有效连接”是指将启动子与候选基因连接以后可以使相应基因得以有效表达并发挥功能。例如使用过表达启动子使基因过量表达。本专利中提到的“过量表达”是指转基因植株中相应基因的表达量比其内源性启动子驱动下的表达量要高的情况。过量表达可以使用强启动子，如组成型启动子。“组成型启动子”是指在大多数情况下具有转录活性，但不一定是大多数环境的条件下生长发育所必需的一类启动子。典型的组成型启动子有花椰菜病毒启动子(camv35s或19s)，水稻actin启动子，玉米ubiquitin启动子，羧化酶小亚基，玉米或苜蓿h3组蛋白，ocs，sad1或2，gos2或其他可以增强基因表达的启动子。可以使用转录或翻译增强子来增强基因的表达。此外，也可以使用诱导型启动子，其表达是受环境诱导的(例如胡椒病原体诱导膜蛋白基因capimpi或脱水应答元件(dre)的启动子，编码向日葵hd-zip蛋白的基因hahb4的启动子是由水分胁迫、高盐、aba或化学诱导(如类固醇或乙醇诱导型启动子系统)的。同时也存在组织特异性启动子。启动子的类型如上所述，当然还存在其他合适的启动子或诱导系统。

另一方面，也可以使用根部特异性表达的启动子。这类启动子主要在植物根部具有转录活性，基本上可以排除其在植物其他部位的表达情况。根部特异性启动子包括在根部特异表达基因的启动子，如：rcc3,拟南芥pht1，苜蓿磷酸盐转运蛋白,拟南芥pyk10,烟草生长素诱导基因,微管蛋白,lrx1，alfs,exp7,lbd16,arf1，烟草rd2,sireo,pyk10和pspr10。

在某一实施方案中，启动子为组成型启动子或强启动子。在某一优选实例中，调节序列为诱导型启动子、胁迫诱导型启动子或组织特异性启动子。胁迫诱导型启动子首选盐胁迫诱导型启动子。

在某些实施方案中，启动子是内源sbhkt1；4基因的启动子。在另外实例中，为盐胁迫诱导的启动子，例如osaba2、hahb1、sbusos1或rab16a。优选实例中的启动子介导基因在根木质部的表达，例如roic和raid。根特异性和木质部薄壁细胞特异性启动子在本领域应用广泛，例如在wo2006/024291中发表的。

另一方面，本研究提出了一种用于提高植物耐盐性的方法，转入表达一核酸序列，由seqidno.2中氨基酸序列及其功能突变体组成，例如突变序列与原序列同源性达75％以上或至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％的同源性序列。此核酸序列也可能为seqidno.1或3所示序列及其功能性突变体序列。

此发明中的对照植物没有按照本专利中所述上述方法进行修饰，其未表达seqidno.1序列无遗传修饰。在一实施方案中，对照是一野生型植株。在另一实施方案中，对照是未进行本专利中提及的基因转化，但可以是转化其他基因的株系。作为对照的植物，与转基因株系应是同一个物种，最好是同一基因型的用来作比较。

研究者已验证了sbhkt1；4比其它hkts蛋白有更高的na⁺亲和性。电生理实验表明，转sbhkt1；4基因的卵母细胞中的内流性na⁺流比oshkt1；1,oshkt1；3以及oshkt2；4中的都高。

本方法也包括专利中所提及植株的获得及其衍生后代的各步骤。

本方法进一步也包括筛选转化基因及提高耐盐性的植株的方法，以及筛选耐盐性提高的植物的方法。在另一实施方案中，进一步的方法步骤指测定植株后代中的耐盐性指标，与对照植株进行比较。较为理想的是外源基因在植株后代中稳定遗传，本专利中的方法也包括鉴定外源基因在植株后代中是否稳定遗传。专利中方法也包括在植株后代中收集种子的方法。

在另一方面，本发明专利中涉及盐害胁迫下增加植物产量和长势的方法。包括转化和表达编码sbhkt1；4的氨基酸序列seqidno.2及其发生功能突变的序列，例如氨基酸序列同源性与seqidno.2,seqidno.1序列达90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％以上。转化的序列也包括序列seqidno.1或3，以及其功能突变体。

术语“增加”“改善”“增强”意思相近。例如，与对照相比转基因植株产量至少增加了3％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，有的甚至25％、30％、35％、40％、15％、50％或更多。一般来说，“产量”指的是一种可测量的经济价值，通常与特定的作物、地区、以及一段时间相关。单株产量与籽粒的数量、大小和或重量有关，实际产量指某特定作物每年每平方米的产量，通过除以每平方米作物总产量(包括实际收获和预估产量值)来衡量。单株“产量”与植株生物量(根和地上部生物量)、生殖器官或繁殖体(如种子)有关。因此本发明，产量包括一个或多个指标：增加单株植物的种子产量、增加种子灌浆率、增加收获指数、增加种子/果荚/棒子的大小或数量，也可以促进分化来增加产量，如增加花序分枝。产量增加是一个相对值。生长速率可通过测量下胚轴或茎的伸长量来衡量。

在另一方面，本发明专利中关于盐害胁迫下，调节植株体内钾离子吸收的方法，包括转化和表达一核酸结构，其中核酸序列为sbhkt1；4蛋白的氨基酸序列seqidno.2及其发生功能突变的序列，例如，与植物中seqidno.2列表中序列同源性达90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％以上。转化的序列也包括序列seqidno.1或3，以及其功能突变体。此处所指的盐胁迫为中度或重度盐害。

在另一方面，本发明专利中关于盐害胁迫下，维持植株体内钠钾离子平衡的方法，包括转化和表达一核酸结构，其中核酸序列为sbhkt1；4蛋白的氨基酸序列seqidno.2及其发生功能突变的序列，例如，与植物中seqidno.2列表中序列同源性达90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％以上。转化的序列也包括序列seqidno.1或3，以及其功能突变体。此处所指的盐胁迫为中度或重度盐害。

在另一方面，本发明专利中涉及转基因植株的构建方法。包括两部分：

a)在植物中转化和表达一核酸结构，其中核酸序列为sbhkt1；4蛋白的氨基酸序列seqidno.2及其发生功能突变的序列，例如，与植物中seqidno.2列表中序列同源性达90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％以上。

b)从a中获得转基因植株及其后代的方法步骤。

转化的序列也包括序列seqidno.1或3，以及其功能突变体。

在某一实施方案中，此处所提及的方法中，核酸结构也包括上述提及的调控序列。目标植物，优选粮食作物和生物能源植物，如玉米、水稻、小麦、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、菜豆、字段豆、莴苣、棉花、甘蔗，甜菜，西兰花或其它蔬菜或杨树。

本发明也涉及通过所述方法获得或可能获得的植物。

在另一方面，本发明中关于一段分离的核酸序列包括seqidno.3序列。在另一方面，本发明中关于载体包括seqidno.3序列连接一段调节序列。调节序列可以是本专利中所述调节序列。

在另一方面，本发明中关于载体包括seqidno.1和seqidno.3序列连接一段调节序列。调节序列可以是本专利中所述调节序列。在某一实施方案中，所说的调控序列不是内源性启动子。

本发明专利包括含有上述载体的农杆菌或植物宿主细胞。所说的宿主细胞是一细菌细胞，例如，农杆菌，或者是一植物细胞。本发明也涉及宿主细胞正常生长和扩繁的培养基。

本发明专利涉及利用上述分离的核酸序列或载体，应答盐胁迫维持钠钾离子平衡的用途。本发明专利涉及利用上述分离的核酸序列或载体，提高盐害下植株的产量和长势的用途。

这些核酸或载体，采用本领域公认的转化方法，被用来进行转基因植株构建。因此本专利中许多方面中提及的分离的核酸序列包括seqidno.1或3及其功能突变序列，作为转移基因转化植物。通过转化的方法，核酸序列被转入植物基因组中。术语“引入”或“转化”指将外源多核苷酸序列转入宿主细胞。植物组织可以通过器官发生或胚胎发育进行后续一系列的克隆性增值，植物组织可以与本发明中的遗传构建体同时转化，继而进行完整植株的再生。克隆性增殖系统不同，选择的具体组织也不同。视情况选择最适宜转化的特异组织。例如，特异性靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、已有的分生组织(例如，顶端分生组织，腋芽和根分生组织)以及诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。所述多核苷酸序列可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以维持非整合状态，如质粒。另外也可以被整合到宿主基因组中。用本领域已知的技术方法进而将所得的转化细胞用于植物再生。

将外源基因转移到植物基因组中的技术称为转化。植物转化现在是一种应用广泛的常规技术。任何的一种转化方法可以将目的基因导入合适的靶细胞。植物的转化和再生方法可以用于瞬时转化或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电击、化学转化来增加游离dna的摄入，也可将dna直接注射入植株、用粒子枪轰击、病毒或花粉的显微注射转化。转化技术有：用于原生质体转化的钙/聚乙二醇方法、原生质体电穿孔、显微注射进植物材料、dna或rna包被的粒子轰击、病毒侵染(非整合的)的方法。转基因植物，包括转基因作物，优先选用农杆菌介导的方法转化。

转化植株的筛选。一般通过选择性的培养条件来区分转化和非转化苗。例如，利用上述方式获得的种子进行播种，经过初始培育后通过喷洒合适的选择剂。另一种方法，将种子灭菌后，播种在含有选择剂的琼脂平板上，只有转化植株可以进行后续的生长。或者转化的植物可通过选择标记来筛选。dna转化和再生后，需要对转基因植株进行评估，利用southern分析技术检测目的基因片段是否转化成功以及检测其拷贝数，另外利用northern或western技术来检测目的基因的表达水平，northern或western杂交都是本领域很成熟的技术方法。

转基因植株可以通过多种方式进行繁殖，如用克隆繁殖方法或传统育种技术。例如第一代(t1)转化植物可以进行自交，然后选择纯合的第二代(t2)转化体，并且t2植物随后可以进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化体有多种形式，例如，它们可以是转化细胞或非转化细胞的嵌合体、克隆转化体(例如，所有的转化细胞都表达目的片段)、转化和未转化组织的嫁接(例如，在植物中，转化的砧木嫁接到未转化的接穗上)。

另一实例中，涉及由seqidno.4序列构成的核酸序列。在另一方面，本专利中载体也包括由seqidno.4调控序列与目的基因连接后的组成结构，本发明也构建了包含连接有目的基因的序列的载体。调控基因表达的序列见seqidno.4所示，其特征是具有七个顺式作用元件：cactftppca1，eboxbnnapa，acgtaterd1，rootmotiftapox1，taaagstkst1，wboxatnpr1和wrky710s。

本发明专利也涉及在宿主细胞中表达一段分离核酸序列或载体结构。核酸序列包括seqidno.4序列，载体包括上述提到的seqidno.4调控序列与目的基因连接后的组成结构。所说的宿主细胞是一细菌细胞，例如，农杆菌，或者是一植物细胞。

本发明专利也涉及在植物中表达一段分离核酸序列或载体结构，在应答盐胁迫、调控钠钾离子平衡及增加植物产量和长势上的用途。核酸序列包括seqidno.4序列，载体包括上述提到的seqidno.4调控序列与目的基因连接后的组成结构。

以上信息概述了本发明的总体大纲，包括方法、最佳研究模式以及如何利用此发明，下面将会对本发明做进一步的完整描述，以供本领域的研究人员更好的使用此方法。

然而，本领域的技术人员不应将这些实例的细节理解为对本发明的限制，本发明的范围应根据其公开后的权利要求书及其等同物来解读。本发明可供本领域技术人员借鉴。

在本说明书中提及的所有文献都通过引用整体并入本文。

本文所用的“和/或”，指两个特征分开或独立公开。例如，“a和/或b”是要公开(i)a，(ii)b以及(iii)a和b，就像本文每次所载为独立的。

除非上下文另外指示，上文涉及的特征的描述和定义不局限于本发明的任何特定方面或实例，这些说明同样适用于其它所有方面和实例。

本发明专利将在接下来的实例中进一步阐述。

实施例

材料和方法

植物材料，生长条件和盐胁迫处理

收集56个高粱品系进行高粱耐盐性筛选评价，筛选出两个高粱品种用于下述研究报告中(耐盐高粱品种2007，盐敏感高粱品种ji2731)。2007是甜高粱品种，源产地美国，ji2731是典型的中国籽实高粱品种。种子先用70％酒精表面消毒1分钟，然后用3％naclo消毒10分钟，用蒸馏水冲洗完全，与培养皿中发芽，培养皿中放置浸满蒸馏水的滤纸。室内条件下，高粱幼苗水培营养液是1/2霍格兰德(hoagland)营养液(ca(no3)22mm,kno32.5mm,nh4no30.5mm,kh2po40.5mm,mgso41mm，ki5μμ，h3bo30.1mm，mnso40.13mm，znso40.03mm,na2moo41.033μμ，znso40.1μμ，cocl20.105μμ，fena-edta0.1mm)。室内生长培养条件，白天26℃，黑暗培养18℃，光照培养16小时，光强70μmolm^-2sec^-1。拟南芥种子，4℃黑暗层积处理3天，打破休眠。3％naclo表面消毒灭菌10分钟，100％酒精消毒1分钟，无菌水冲洗3遍以上，与1/2ms(duchefa)添加1％蔗糖和0.8％琼脂的培养基中发芽培养。植株表型分析采用基本培养基和k⁺离子缺乏培养基(rusetal.2004)。拟南芥培养室的温度为21℃，70％相对湿度，设置60μmolm^-2sec^-1光强，16h光照时间(jingetal.,2002)。烟草生长条件22℃，70％相对湿度，光周期16h/8h。

hkt基因克隆和序列分析

总rna提取利用rna纯化提取试剂盒(tiangen)，反转录引物为oligodt，反转录酶为toyobo反转录酶。在高粱基因组数据库(sorghumphytozome)中，采用athkt1；1序列进行blastx分析，得出高粱中4个hkt基因家族成员。pcr扩增出目标基因片段，通过invitrogen公司的topota克隆试剂盒，首先连接到载体pcr8/gw/topo载体中。成功克隆出目的片段的引物序列参见表1中列表。聚类关系树是由mega软件，依据最小进化关系法，重复1000次计算得出。(kumaretal.,2008)。

烟草瞬时表达

高粱sbhkt1；4基因的编码区与绿色荧光蛋白gfp构成融合蛋白，连接在camvs35s启动下的表达载体ph7wgf2.0中。将构建好的重组质粒，转化到农杆菌a.tumefaciens(gv3101)菌株中。转化农杆菌的ph7wgf2.0-gfp-sbhkt阳性克隆及含有p19质粒的农杆菌株的重悬液等体积比混合，用注射器将其注射入生长旺盛，表面平整的烟草(nicotianabenthamianal.)幼叶上。注射后的烟草在23℃条件下生长2-3天，剪取0.5cm²面积的叶片，置于玻片上，盖上盖玻片。激光共聚焦/tirf显微镜(leicatcssp5)，60×视野，明场及488nm的激光波段下观察，并照相。

半定量pcr和实时荧光定量pcr

高粱和拟南芥中，半定量pcr的引物参见表1。以高粱和拟南芥中actin基因为内标。qpcr的引物参见表1中列表，采用sybrprimescriptrt-pcrkit(toyobo,japan)试剂盒进行实时荧光定量pcr实验。每个样品三次重复。利用ct值(2^-△△ct值)比较法来计算各处理样品中基因的相对表达量变化。

酵母培养基、菌株和转化

大肠杆菌escherichiacolidh5α菌株，用于常规的质粒dna增殖。用于酵母生长抑制试验和k⁺缺陷互补试验的酵母菌株分别是g19(mata,his3,leu2,ura3,trp1,ade2,andena1::his3::ena4)和w△6(mataade2ura3trp1trk1d::leu2trk2d::his3)菌株。将sbhktcdna克隆至载体pyes2，进一步转化到对应菌株中进行表型实验分析。酵母转化子筛选培养基是sc-u(minimalsd培养基：0.67％酵母氮源基础，0.6％蔗糖，2％琼脂，添加2％半乳糖，100mmkcl和尿嘧啶营养缺陷型组分)。30℃过夜培养，至菌液od600达0.7,吸取1微升，10倍浓度梯度稀释培养在含有2％蔗糖、尿嘧啶营养缺陷且含有不同钠钾离子浓度的ap培养基中。

非洲爪蟾卵母细胞的电生理实验

sbhkt1；4亚克隆至pgemhe载体中。在t7rna聚合酶作用下，利用mmessagemmachinekit试剂盒。非洲爪蟾卵母细胞从6只青蛙中分离获得，18℃，nd-96oocyte培养液中保存1-2天待用。先将32nlcrna其溶解在无rna酶水中，之后注射到非洲爪蟾卵母细胞中，注射后2天，记录电压钳实验结果(liuandluan2001)。数据分析采用axoninstrumentsdigidata1440alow-noise数据获取系统。灌注液包含6mmmgcl2,1.8mmcacl2,185mmd-mannitol和10mmmes-tris(ph5.6)，及不同浓度的钠钾离子含量。

sbhkt1；4基因的拟南芥转基因植株

利用gateway载体系统，已构建的pcr8/sbhkt1；4载体和pmdc32载体通过lr反应，重组成pro35s:sbhkt1；4植物表达载体。经测序验证无误后，电击转化至农杆菌gv3101菌株中。待转基因株系athkt1；1为拟南芥at4g10310的t-dna插入突变株系，蘸花法构建转基因植株(cloughandbent1998)。在含有50μgml^-1的1/2ms培养基上筛选出的抗性植株，获得转基因植株纯系用于后续实验中。

icp-oes离子含量测定

植物材料采集冲洗后，置于65℃烘干2天。取100毫克，加入6ml0.1mhno3中过夜处理，之后添加2mlh2o2，于微波消煮仪(cemmarsmicrowaveacceleratedreactionsystem)中消煮一小时。消煮后的溶液，加蒸馏水定容至50ml容量瓶中。k⁺，na⁺离子含量测定采用电感耦合等离子体发射光谱6300(icp,inductivecoupledplasmaemissionspectrometer)。

结果

高粱sbhkt基因的克隆和特征分析

利用blast工具在高粱中找到4个hkt基因家族成员。根据拟南芥中athkt1；1的氨基酸序列，在高粱基因组数据库(www.phytozome.net)中进行比对搜索，找到4个较高同源性的序列，sb03g12590,sb04g005010,sb06g027900和sb10g029000，分别分布在四个不同的染色体上。根据序列同源性比对结果和植物hkt蛋白家族公认的命名方法，4个基因分别命名为，sbhkt1；5(sb03g012590)，sbhkt1；3(sb04g005010)，sbhkt1；4(sb06g027900)及sbhkt2；1(sb10g029000)。

图1显示4个高粱sbhkt的基因结构。高粱中4个hkt基因的结构类似，均由three-exon-two-intron结构组成，比较特殊的是sbhkt1；4基因有个2246bp长度的内含子(图1a)。4个基因的cdna全长分别是sbhkt1；31899bp,sbhkt1；41692bp,sbhkt1；51497bp,sbhkt2；11638bp。sbhkt1；3，sbhkt1；4，sbhkt1；5，sbhkt2；1蛋白与相应的水稻中的hkt家族成员oshkt1；3，oshkt1；4，oshkt1；5，oshkt2；4蛋白氨基酸序列同源性(identity)较高，分别为70％，75％，65％，58％。图1b显示高粱中hkt蛋白编码区氨基酸序列对比分析。高粱hkt基因家族4个成员的蛋白结构保守，由4个跨膜的mpmmotif组成，具有trkh家族转运蛋白的保守结构特征。pa，pb,pc,pd中的丝氨酸或甘氨酸较为保守。图1b同样也显示了hkt蛋白中在盐胁迫条件下点突变研究中涉及到的氨基酸残基的位置。

为进一步了解高粱hkt蛋白家族和其他物种之间的聚类关系，特别是在盐生植物中，我们分别用高粱中4个hkt蛋白在genebank和phytozome数据库中进行protein–proteinblast搜索，搜索得到43个植物中hkt-like的蛋白，包括在盐生植物中所有报道的hkt蛋白。搜索结果用来构建已公开的hkt蛋白的进化树，结果显示可以分成3个进化分支(图2)。依据在第一个p-loop区pa氨基酸残基的位置，hkt蛋白可以分成2个亚家族(corratge-faillie等，2010)。高粱中sbhkt1；3,sbhkt1；4及sbhkt1；5离子转运蛋白属于亚家族1，分别在pa的位点即第94^th,121^st,26^th的位置具有丝氨酸，为na⁺-na⁺type的转运蛋白，而sbhkt2；1属于第二亚家族，在pa的位点即第80^th的位置为甘氨酸，具有k⁺-na⁺type的转运蛋白特性(maser等，2002b)。据报道，pa位点保守的甘氨酸决定了k⁺的选择性(yoolandschwarz1991；uozumietal.1995)，但最新研究表明，hkt-type的离子转运蛋白的k⁺的选择性可能不仅仅决定于gygfilter的结构(rodriguez-navarro2000)。

将高粱hkt蛋白与拟南芥，作物以及盐生植物同源hkt蛋白的亲缘关系分析，4个高粱hkt被分成不同分支并与玉米和水稻相近，说明蛋白家族的功能分化在物种分化之前已经形成。有趣的是，玉米中只有两个同源序列，缺少hkt1；3andhkt1；4相对应的成员，这也可能是高粱比玉米较耐盐的一个原因。

我们在place数据库中分析了hkt基因上游2-kb的序列，找到了参与盐胁迫和其他生物胁迫的多个顺式作用元件。7个顺式作用元件已被证明在非生物逆境胁迫的中起重要调控作用，分别是cactftppca1，eboxbnnapa,acgtaterdi，rootmotiftapox1，aaagstksti，wboxatnpr1和wrky710s(kreps等，2002)。对不同hkt基因上游的启动子元件的差异进行聚类分析，发现聚类结果和利用氨基酸聚类的结果比较相似。换句话说，hkt基因启动子中存在的顺式作用元件同它的生物学功能一同进化而来，同时可能反映了一个相似的转录调控模式。aba响应元件abreosrab21和ryrepeatvfleb4,被报道在许多aba信号途径中胁迫响应基因的启动子区(marcotteetal.1989)，在高粱hkt基因家族中仅存在于sbhkt1；4基因的启动子区。说明sbhkt1；4基因相比其它成员，在高粱抵御盐胁迫中起重要作用，因此我们研究的重点放在了sbhkt1；4上。

盐胁迫下sbhkt1；4在耐盐品种和盐敏感品种中的表达差异

研究了不同地理来源的46个高粱自然品系进行耐盐遗传多样性评价。在200mmnaci处理两周测定了干物质积累量以及相对含水量。2007和ji2731表现突出，2007耐盐，ji2731盐敏感，因此用来做进一步的基因表达分析。如图3a,尽管与对照相比生长均受到抑制，200mmnaci处理两星期后，2007长势强于ji2731幼苗。200mmnaci处理后2007相对干鲜重较高，失水较少，而ji2731相对干鲜重较低，失水较多，表现出明显的受胁迫特征，包括叶绿素含量降低，叶片衰老甚至死亡(图3b,c)。

在很大程度上，两个品种生长的差异与组织中的离子含量有关。对照中茎和叶的na⁺含量在2-5mg/g，两个品种之间并没有明显差异。200mmnaci处理3天后导致茎和根中的na⁺的积累和k⁺流失。ji2731中na⁺积累量比2007高，因此大部分的k⁺流出根部，进入培养基中(图3d,e)，因此在耐盐品种2007中na/k比较低(p<0.05)。我们的结果表明耐盐品系比敏感品系能够维持高k⁺含量，在高盐条件下平衡细胞内的na/k比例。在高盐条件下保持适宜的na/k比值可能是高粱在细胞水平和植株水平抗盐的一个重要机制。

我们又分析了两个品种na⁺、k⁺转运子的表达情况。如图4a,所有部位中sbhkt1；4表达都较低，但在两个品种之间有一定的差异。2007的根、叶鞘以及叶脉中表达量相对较高，为了进一步证实sbhkt1；4的蛋白定位，将sbhkt1；4-gfp瞬时转化烟草，60倍视野下观察发现在叶表皮细胞的周围中发现荧光。如图4b,对照中gfp荧光蛋白在细胞周围和细胞核中均有表达，但是表达了sbhkt1；4-gfp的细胞中，荧光信号主要分布在细胞膜周围。这与在线数据库(www.softberry.com)网站上预测的蛋白亚细胞定位的结果一致。

为了验证sbhkt1；4的表达是否受外界na⁺、k⁺离子水平的影响，在含有不同浓度的k⁺、na⁺的水培条件下处理1h,12h和24h的材料，提取根茎中的总rna,如图5，与ji2731相比，2007的根茎中的sbhkt1；4的表达上调。在处理后1h，相比盐敏感品种ji2731，在耐盐高粱品种2007中迅速上调表达，尤其表现在根中。说明2007中sbhkt1；4基因比ji2731中提前表现出响应外界高na⁺胁迫的表达调控。同时，高钠条件下添加足量k⁺(10mmkcl)后，2007中sbhkt1；4在三个时间点均能保持较高上调表达水平，说明在盐胁迫条件下sbhkt1；4的表达对于k⁺的转运比较重要。

我们还检测了不同外源na⁺、k⁺离子对2007和ji2731中hkt其他成员以及其他na⁺转运子(即sbnhx和sbsos)的表达影响。大部分基因在2007和ji2731中没有明显差异，除了sbhkt1；5，sbhkt2；1和sbnhx3。200mmnacl胁迫处理下，hkt基因家族成员sbhkt1；5在耐盐高粱2007的地上部显著上调，与对照组相比上调了21倍。sbhkt2；1在盐敏感品种ji2731中表现上调。在盐处理下，2007的根茎中sbnhx3的表达高出ji2731两倍。然而，在外界高钠且添加足量k⁺(10mmkcl)的条件下，除根中sbnhx3基因表达量差异较大，其余基因在两个品种间的表达差异不存在。

综上所述，在高k⁺和na⁺同时存在下，2007中sbhkt1；4被诱导表达上调明显，特别是在根中，预示着在高粱耐盐中起重要作用。

高粱hkt基因酵母中的na⁺和k⁺互补及生长抑制实验

为了较好的分析sbhkt1；4在高na⁺胁迫下对k⁺的转运能力，我们研究了其在酵母系统中的na⁺和k⁺转运能力。na⁺的吸收特性是利用酵母g19的生长抑制试验,酿酒酵母g19菌株由于突变了编码na⁺-extrudingatpases结构的ena1-ena4序列，为钠离子敏感菌株(quintero等，1996)。过表达tahkt1；1,athkt1；1oroshkt2；1的g19菌株，在含有较高浓度nacl的培养基上，表现生长受抑制的表型，与在蛙卵细胞中过表达后检测到的na⁺内流的电化学指标相一致(rubio等，1995；uozumi等，2000；horie等，2001；yao等，2010)。本实验中以athkt1；1和atkat作为阳性对照。如图7a,，转化有空载pyes2的菌株和转化有sbhkts的菌株在ap+0.1mmkcl的培养基上均正常生长。当培养基中添加150mmnacl时，除表达空载体菌株外，所有转化菌株，均表现出生长受抑制的表型。有趣的是，同表达有athkt1；1的菌株相似，表达sbhkt1；4菌株相对表现更重的盐害导致的生长抑制现象(图7a,中间)。这些结果表明sbhkt1；4基因使得菌株通过增加钠的转运能力对钠更加敏感。

为进一步确定sbhkt1；4对钠的敏感性是否是钾离子依赖性的。含有150mmnacl的培养基中加入10mmkcl，表达有sbhkt1；4的菌株的生长又恢复至表达空载菌株的生长水平，说明与athkt1；1不同，sbhkt1；4可能在高na⁺条件下促进k⁺的吸收(图7，右)。

与上述结果相似，结果表示sbhkt1；4也可能有钾转运的能力。因此，我们在trk1和trk2的突变株w△6中过表达sbhkt1；4以互补k⁺摄取不足。克隆k⁺转运蛋白基因nchak(haro等,1999)作为阳性对照对照，在100mmk⁺高浓度下，生长没有明显的差异(图7b上)。我们逐渐减少钾的供应，10mm，1mm，0.1mm，分别发现sbhkt1；4能恢复具有生长缺陷突变体的长势，达到阳性对照nchak基因的互补水平(图7b上)。这意味着，sbhkt1；4具有很高的k⁺转运能力。同时，na⁺对sbhkt1；4介导的k运输能力在钠钾胁迫同时存在下明显提高。在200mmnacl存在下，k⁺供应从10mm减少到1mm，并不影响钾吸收缺陷突变体的生长。250mmnacl下获得了类似的结果(图7b下)。因此，sbhkt1；4在酿酒酵母作为一种钾转运体，这样的能力是不受影响的高na⁺的浓度的影响，显示出较强的类似nchak的钾吸收活性。

非洲爪蟾卵母细胞中sbhkt1；4的离子选择吸收能力

在上述实验中，我们验证了sbhkt1；4在酵母中的钠离子和钾离子的转运活力。最近，hkt转运被认为是对多种离子具有一定的选择特异性(horie等，2011)。我们下一步检查了sbhkt1；4在爪蟾卵母细胞中单价离子的选择特性。合成sbhkt1；4的crna，表达在卵母细胞中，对已灌注的卵母细胞进行电流记录，灌注液依次分别辅以10mmli⁺，na⁺，k⁺，cs⁺，nh4⁺盐。在灌注各离子前后，除了一个大的内向整流钠的电流峰，其余离子未检测明显的电流峰值，表现出较明显的高钠离子渗透率(图8a)。如图8b，在-60mv，分别加入10mm的li⁺，k⁺，cs⁺和nh4⁺到电解缓冲溶液中，在表达sbhkt1；4的卵母细胞中产生了单独的限制电流，而平均灌注na⁺引起的电流比其他离子至少大10倍。此外，表达sbhkt1；4crna的卵母细胞具有较大的电压依赖性的内向整流电流(图8c，d)。钠的运输能力进一步检查通过不同浓度的na⁺添加到灌注溶液。如图8e和8f，随sbhkt1；4可随外界na⁺离子浓度的变化，来调节细胞内外的稳态电流振幅。这些结果有力地证明sbhkt1；4是一种高亲和力的na⁺转运载体。

虽然最初的分析表明，注射sbhkt1；4crna的卵母细胞在10mmk⁺的灌注后，没有产生明显的电流变化，我们下面进一步研究了其k⁺转运能力。我们初步测试了同时加入钾离子和钠离子的影响，并注意到相比单独灌注na⁺，k⁺，在同时灌注10mmk⁺和5mmna⁺后电流信号信号会进一步增强(图9a，b)。图9c，d表明，我们注意到灌注50mmk⁺产生的信号与灌注5mmna⁺产生的电流振幅信号相当，两个离子同时加入会累积增强。这些结果说明：(1)sbhkt1；4在增加外源k⁺含量的情况下，则具有k⁺的转运能力；(2)外界k⁺，na⁺含量对sbhkt1；4的转运能力具有相互影响。

sbhkt1；4拟南芥转基因株系中能够调节na/k比以维持生长

为了研究sbhkt1；4在植物中的耐盐性，构建了35s启动子下sbhkt1；4基因的拟南芥转基因株系，此株系为拟南芥athkt1；1t-dna插入的突变体(maser等,2002a)。拟南芥athkt1-1突变体对nacl敏感(gong等，2004；rus等，2004；sunarpi等，2005；davenport等，2007；moller等，2009)。经三代自交纯化，共筛选出6个独立的转基因株系，选择其中三个转基因株系，其sbhkt1；4基因表达量各不相同。如图10a所示，所有转基因植株能正常生长，没有差异。加入75mmnacl时，sbhkt1；4转基因株系表现出更严重的生长迟缓，地上部鲜重明显降低，类似于已报道的hkt1-1突变体株系，组成型表达athkt1；1的钠敏感表型(all等,2012)。这些结果表明，表达sbhkt1；4基因使拟南芥athkt1-1突变株系对na⁺胁迫更敏感。既然我们已经发现sbhkt1；4转运载体在酵母和卵母细胞系统的具有钾离子转运活性，我们研究了在高钠胁迫下，提高外界钾离子含量，地上部的表型和鲜重变化。有趣的是，sbhkt1；4转基因植株在75mmnacl胁迫下生长迟缓，5mmkcl加入后生长恢复。此外，图10a、10b显示5mmlicl的加入不会改变k⁺对na⁺的缓解。总之，sbhkt1；4转基因株系表现出较高的na⁺敏感表型，但钠离子的敏感性可以通过增加外界钾离子的含量得以缓解。

为了分析转sbhkt1；4基因的植株在na⁺胁迫下生长受抑制的原因，接着测定了植物组织na⁺和k⁺的离子含量。可以明显看出75mmnacl存在下，与ahhkt1-1相比，sbhkt1；4转基因植株吸收较高的na⁺和较低的k⁺含量(图10c，d)。过表达sbhkt1；4可以增加地上部na/k比，导致生长受抑制。但是，在高钠条件下增加k⁺含量时，sbhkt1；4三个转基因株系地上部均含有较高的na⁺浓度，但是k⁺含量增加，使na/k比降低，生长恢复(图10，e)。

为进一步分析sbhkts基因在调节植株体内k⁺平衡中的功能，对高粱sbhkts的拟南芥转基因株系进行缺钾胁迫处理。图11a所示，在缺少kcl并添加20mmnacl的培养基上，sbhkt1；4转基因植株相比athkt1-1突变体，表现出生长受抑制的明显表型，地上部干重积累较低。在添加足量kcl后，sbhkt1；4转基因植株体内na⁺/k⁺恢复正常,生长也恢复正常。在缺钾培养基上，添加的20mmnacl并不影响一般植物的生长，而三个转基因株系地上部na⁺/k⁺比值显著增加，添加5mmkcl后，转基因植株中体内na⁺减少，k⁺增加，钠钾比例达到平衡(图11，c，d，e)。因此，k⁺的增加缓解了转基因植株的生长情况，与酵母中的试验结果一致。

表1引物列表

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