水稻组织特异性脆秆控制基因tsbc1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水稻组织特异性脆秆控制基因TSBC1编码的蛋白质，该蛋白质具有Seq?ID?No：2所示的氨基酸序列。本发明还公开了编码该蛋白质的基因，该基因具有Seq?ID?No：1所示的核苷酸序列。本发明还公开了含有上述基因的质粒、植物表达载体和宿主细胞。本发明还公开了培育植物脆秆的方法：用上述植物表达载体转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株。本发明从水稻组织特异性脆秆突变体中克隆的新基因TSBC1，编码具有两个SANT结构的DNA结合域的MYB类转录因子，主要通过调控水稻细胞壁组分合成代谢来控制植株的脆秆性状。
【专利说明】水稻组织特异性脆秆控制基因TSBC1及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及水稻组织特异性脆杆控制基因TSBCl及其应用，主要应用于植物基因工程。
【背景技术】
[0002]植株茎杆的支撑力是植物，尤其是农作物的重要农艺性状。而茎杆的支撑力又与茎杆组织中相关细胞的细胞壁厚度直接有关。植物细胞壁是一种强的纤维网络结构，由不同的高聚多糖，芳香族物质和蛋白质高度有序地组成，其结构对保持细胞形态，维持植株直立生长的机械支撑力具有重要作用[1]。植物细胞壁的生物合成是一个非常复杂的代谢过程，涉及纤维素、木质素和一些非纤维素成分的合成途径。因此，细胞壁中纤维素、木质素等主要成分的合成与分布以及沉积是影响植株茎杆支撑力的主要影响因素。对不同细胞壁突变体的研究是揭示与茎杆支撑力有关的细胞壁生物合成生理生化以及分子生物学机理有效途径。
[0003]对于大麦茎杆突变体(brittle culm)的细胞学和生物化学研究发现这些突变体脆杆的特征源于细胞壁变薄，纤维素含量减少，尤其是纤维素合酶复合体在质膜上分布数量的减少，证明该性状与纤维素的合成有关[2]。拟南芥不正常木质部突变体((irregularxylem) irxl和irx3进行了详细的研究发现,这些突变体的成熟莖硬度均明显降低,有的甚至不能保持茎杆直立，同时木质部发育也不正常。图位克隆分离了突变体相对应的基因表明它们编码纤维素合酶的催化亚基，证明了植物茎杆的支撑力与纤维素的合成有关[3’4]。在水稻种也一些脆杆基因的研究。水稻BCl基因编码了主要在厚壁组织细胞和维管束中表达的类-cobra蛋白，降低了细胞壁厚度和纤维素含量，增加了木质素的含量[5]。BClO通过调节细胞壁纤维素合成和阿拉伯半乳聚糖蛋白含量，控制水稻植株的机械强度，同时影响植物的生长和发育[6]。Bcl2参与了水稻的细胞周期进程、纤维素微纤维的积累和细胞壁组分的构成[7]。Bcl4编码水稻核苷酸糖转运蛋白OsNSTl,是一个定位于高尔基体的转运蛋白，为基质多糖的形成提供了葡萄糖基底物，进而调控纤维素的生物合成M。上述结果表明除了直接参与纤维素和木质素合成的基因外，调控纤维素和木质素有序分布与沉积以及细胞壁厚度的基因对植株的支撑力也有影响。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供水稻组织特异性脆杆控制基因TSBC1。
[0005]本发明是通过以下技术方案来实现的。
[0006]一种水稻组织特异性脆杆控制基因TSBC1，上述基因TSBCl所编码的蛋白质具有如序列表所示的氨基酸序列。
[0007]进一步地，上述氨基酸序列还添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸 序列或衍生物。
[0008]进一步地,上述基因TSBCl,具有如序列表所不的核昔酸序列。[0009]进一步地，上述核苷酸序列还添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
[0010]本发明还提供了含有上述基因的质粒。
[0011]本发明还提供了含有上述基因的植物表达载体。
[0012]本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有基因序列。
[0013]作为本发明的宿主细胞的改进:该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
[0014]本发明还提供了一种培育植物脆杆的方法，包括用上述植物表达载体转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株。
[0015]作为本发明的培育方法的改进:转化采用农杆菌介导法或基因枪法。
[0016]具体的说:本发明所提供的从水稻组织特异性脆杆突变体中克隆的新基因TSBC1，具有如图4和Seq ID No:1所示的DNA序列。也包括在取代一个核苷酸而产生的突变体等位基因，还含具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。
[0017]本发明中Se ID No:2所示的蛋白质属于SANT类的MYB-DNA结合域的转录因子蛋白家族，其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸所获得的功能类似物。TSBCl与拟南芥AtMYB103蛋白同源性为66% ；AtMYB103蛋白编码一种名为SNDl家族的转录因子，也具有MYB-DNA结合域，并调节S木质素单体的合成。
[0018]本发明所提供的含有图4和Seq ID No:1所示序列的基因或部分基因片段的载体，如图7所示，该载体可以表达由上述核苷酸序列编码的多肽或同源类似物。
[0019]本发明所提供的植物脆杆的培育方法，是一种用TSBCl进行高效植物遗传转化的方法；具体地说，是利用植物表达载体转化植物细胞以影响农作物茎杆机械强度方法。
[0020]本发明的优选实施方式包含以下步骤:
[0021]一、水稻组织特异性脆杆突变体tsbcl的分离和遗传分析:
[0022]本发明所采用的水稻组织特异性脆杆突变体是将粳稻品种(Japonica)“秀水110”经重离子12C6+ (能量:80MeV/u ;剂量:80Gy)辐照处理后，再通过大量筛选而得到的表型稳定的脆杆突变体tsbcl。该突变体与野生型相比，茎杆表现出明显脆性，而叶片和穗部枝梗等表现正常，株高略微降低，穗型变成弯穗，如图1所示。大量的杂交实验证明，我们所得到的是一个符合单基因控制遗传规律的隐性突变体。
[0023]二、图位克隆控制水稻组织特异性脆杆的TSBCl基因:
[0024](一)为了分离TSBCl基因，本发明首先建立了一个大的多态性高的定位群体，由突变体tsbcl (粳稻)与南京11品种(籼稻)杂交而形成的F2群体，再通过图位克隆的方法，并利用SSR等分子标记对TSBCl位点进行初步定位，将其初步定位在第8染色体短臂上，并介于SSR标记RM8018和RM5068之间，见图2。
[0025]( 二)TSBCl基因的精细定位及物理定位:
[0026]通过已测序的TSBCl位点区域的基因组序列，发展新的标记进行精细定位，最终将TSBCl基因定位于SSR标记RM5647和RM22392间的102kb范围之内(图2A)。通过分析此区段的开放阅读框(ORF)推测候选基因，即对该范围内的候选基因进行序列分析，测序后发现只有TSBCl候选基因的序列在野生型与tsbcl突变体之间存在差异，而其它14个的序列在野生型与tsbcl突变体间均无差异。
[0027](三)TSBCl基因的鉴定和功能分析:[0028]将TSBCl基因构建到常规植物表达载体并转化到水稻脆杆突变体tsbcl中，结果表明本发明获得了使tsbcl突变体恢复正常表型的转基因水稻(图7B);证明了本发明正确克隆了 TSBCl基因(图3)。
[0029]本发明的有益效果:
[0030]在水稻中，TSBCl基因功能的丧失造成茎杆的纤维素含量减少，半纤维素含量增加，厚壁组织细胞变薄，机械支撑力下降而形成脆杆性状。进一步的实验表明，该基因编码具有2个SANT-DNA结合域的Myb类转录因子，主要通过调控细胞壁的成份变化来影响植物茎杆的机械强度。该基因在揭示细胞壁次生代谢的分子机理，了解植物机械轻度的形成机理等方面具有重要的理论价值。机械强度是作物的重要农艺性状，在品种改良和秸杆利用中占有重要的地位。利用转基因技术可以对植物的机械强度进行改良，培育具有脆而不倒、高产优质的新品种，对于解决秸杆焚烧难题、实现秸杆就地还田、保护环境等方面具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1是水稻野生型秀水110 (WT)与脆杆突变体tsbcl的表型图；
[0032]图2是TSBCl在水稻第8染色体上的定位图(A)、基因预测(B)和基因结构(C)；
[0033]图3是TSBCl基因的DNA序列；
[0034]图4是TSBCl基因的cDNA序列；
[0035]图5是TSBCl基因编码的氨基酸序列；
[0036]图6是载体骨架(A)和互补载体构建质粒图谱(B)；
[0037]图7是空白载体转基因植株(A)`和恢复野生型表型的转基因植株(B)。
【具体实施方式】
[0038]下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
[0039]实施例1:水稻组织特异性脆杆控制基因TSBCl的克隆
[0040]1、TSBCl基因的初步定位:
[0041]水稻(Oryzasativa L.)组织特异性脆杆突变体 tissue-specific brittleculml (tsbcl)，表现为茎杆脆嫩，易折断，叶片及其他组织不表现脆性或脆性微弱；野生型材料为粳稻品种“秀水110”。纯合的tsbcl突变体和籼稻品种南京11号进行杂交，Fl代自交，得到F2群体，并从中选出84个具有脆杆表型的单株作为定位群体。在拔节期每株取I克左右的嫩叶，用来提取总DNA。
[0042]采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因DNA。取大约200mg水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于200 μ I超纯水中。每一个SSR反应用2 μ I DNA样
品O
[0043]在TSBCl基因的初步定位阶段，对由84个F2单株组成的小群体进行SSR分析，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选用水稻12条染色体上相距约20cM的多态性SSR弓丨物进行连锁分析，根据已知的反应条件进行PCR扩增，经4%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭(EB)染色，检测PCR产物的多态性，结果表明第8染色体短臂端上的分子标记RM408和RM310与突变基因有明显的连锁关系，交换率分别为12.5%和3.6%，分子标记基因型分析表明TSBCl基因定位于两者之间。在两标记之间进一步发掘多态性分子标记，将TSBCl基因定位在SSR标记RM8018和RM5068之间约990kb基因组区间内。(引物序列见表1)
[0044]2、TSBCl基因的精细定位:
[0045]在初步定位的两个标记RM8018和RM5068之间进一步发掘了新的多态性SSR标记(引物序列见表1 )，通过扩大定位群体，选取2307个F2脆性单株组成精细定位群体，基因型分析最终将TSBCl基因精细定位在SSR标记RM5647和RM22392间102Kb区间范围内(图2A)。
[0046]表1、用于TSBCll基因定位的SSR标记
[0047]
【权利要求】
1.一种水稻组织特异性脆杆控制基因TSBC1，其特征在于，所述基因TSBCl所编码的蛋白质具有如序列表所不的氣基酸序列。
2.根据权利要求1所述的水稻组织特异性脆杆控制基因TSBC1，其特征在于，所述氨基酸序列还添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
3.根据权利要求1所述的水稻组织特异性脆杆控制基因TSBC1，其特征在于，所述基因TSBCl，具有如序列表所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的水稻组织特异性脆杆控制基因TSBCl，其特征在于，所述核苷酸序列还添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
5.一种与权利要求1-4任意项所述基因TSBCl相关的质粒，其特征在于，所述质粒具有所述基因TSBCl。
6.一种与权利要求1-4任意项所述基因TSBCl相关的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体具有所述基因TSBCl。
7.一种与权利要求1-4任意项所述基因TSBCl相关的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞具有所述基因TSBCl。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞中的任意一种。
9.一种培育脆性植物的方法，其特征在于，将具有所述基因TSBCl的植物表达载体转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株。
10.根据权利要求9所述的培育脆性植物的方法，其特征在于，包括步骤: (1)将粳稻品种Japonica“秀水110”经重离子12C6+在能量:80Mev/u ;剂量:80Gy的辐照处理后，再通过大量筛选而得到的表型稳定的脆杆突变体tsbcl ； (2)将所述脆杆突变体tsbcl与南京11品种(籼稻)杂交而形成的F2群体，通过图位克隆，并利用SSR等分子标记对TSBCl位点进行初步定位，将其初步定位在第8染色体短臂上，并介于SSR标记RM8018和RM5068之间； (3)通过已测序的TSBCl位点区域的基因组序列，发展新的标记进行精细定位，最终将TSBCl基因定位于SSR标记RM5647和RM22392间的102kb范围之内； (4)将TSBCl基因构建到常规植物表达载体并转化到水稻脆杆突变体tsbcl中。
【文档编号】A01H5/00GK103695440SQ201410013353
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】刘斌美, 吴跃进, 叶亚峰, 傅向东, 陶亮之 申请人:中国科学院合肥物质科学研究院