道地丹参的培育方法
【专利摘要】本发明涉及一种道地丹参的培育方法。步骤是经过建立丹参种质资源圃、从中评选出代表性的道地丹参种质资源、鉴定道地丹参基因组核型结构、确定道地丹参DNA条形码、进行人工诱变成同源四倍体、进行有性杂交获得三倍体丹参永久杂种、脱毒处理、组培苗克隆增殖、瓶苗移栽、移栽苗的管理、新品种评比试验、药材产量和主要药物有效成分测定、道地丹参新品种认定和品种鉴定。本发明是迄今为止唯一具有自然界二大优势，即：多倍体优势和杂种优势的种群，其优势表现出巨大性和不可替代性。因此，本发明是利用中药道地功能基因组及其特征基因，依据道地中药本身固有的基因，培育对生物及非生物胁迫能力强的道地中药的有效方法。
【专利说明】道地丹参的培育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物新品种的培育方法，特别是一种绿色超级道地丹参的培育方法。
【背景技术】
[0002]丹参miltiorrhiza Bunge)是我国传统医药中应用最早、最广泛的中药之一，是著名的活血化淤药，在临床上被广泛用于治疗冠心病、心绞痛、缺血性中风等疾病。随着我国人口老龄化，心血管疾病成为危害人类健康的主要疾病，发病率逐年上升，对药物需求量增大。目前我国以丹参为原料生产的复方中药有100多种，涉及的企业有100多家，对优质丹参药材的需求量巨大。然而，我国至今还没有一个统一的道地丹参栽培品种。近年来，农业界为迎接第三次绿色革命，继袁隆平的“超级稻”之后又提出培育“绿色超级稻”的奋斗目标。在这种启发下，作者提出培育“绿色超级道地丹参”的奋斗目标。
[0003]实际上，与农业种质资源相比，我国中药种质资源更丰富，对培育绿色超级物种更具有优势。传统中药在我国应用历史悠久，在全国各地分布着一批具有独特功能的药用植物，它们是经过长期的自然选择和人工选择的积累而形成的特殊种群，具有特征性功能基因组，是培育绿色超级道地中药最宝贵的基因库。很多道地中药都是长期生长在极端特殊的自然环境条件下，积累了能抵抗各种外界胁迫能力的基因，因此，尽快的挖掘、保全和利用道地中药材中的特殊功能基因组，不仅对培育绿色超级道地中药有利，对我国中药现代化发展也具有引领作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种绿色超级道地丹参的培育方法，它是依据道地中药丹参本身固有的道地功能基因组和基因，抵抗外来生物及非生物的胁迫，达到增加药材产量，提高主要药物有效成分含量的目标，实现不打农药，不施或少施化肥的目的。
[0005]本发明的目的是提供一种绿色超级道地中药丹参的培育方法包括以下步骤: 首先是收集全国野生丹参种质资源，建立中国丹参种质资源圃。
[0006]第二，从形态学、细胞生物学(染色体)、分子生物学不同层面对我国丹参种质资源进行研究，评选出具有代表性的道地丹参种质资源，并从基因组染色体结构和DNA分子条形码技术对道地丹参进行鉴定。
[0007]第三，将一个具有隐性标记性状的二倍体道地丹参和一个具有显性标记性状的二倍体道地丹参，分别进行人工诱变成同源四倍体(4x，含有4个相同的道地丹参功能基因组)。
[0008]第四，三倍体丹参杂交转育，分别将具有隐性标记性状(如白花)和具有显性标记性状(如紫花)的四倍体丹参，分别与具有相对标记性状的二倍体道地丹参(2x，含有2个相同道地丹参功能基因组)进行有性杂交(4x早Χ2χ ?或2x早Χ4χ ?)，获得三倍体丹参永久杂种(3χ，含有3个相同道地丹参功能基因组)。
[0009]第五，脱毒处理:以三倍体丹参杂交当代种子幼苗茎尖或新生幼叶为外植体，用75%酒精和0.1 %升汞进行脱毒处理。
[0010]第六，组培苗克隆增殖:将脱毒处理好的外植体接种在MS + 6BA1.5mg/L培养基上，在光周期14小时/天，光强度3000LUX，室温20— 25°C条件下进行光照培养，待接种材料切割面产生丛生芽，转入1/2MS + 6BAlmg/L培养基上，进行克隆增殖。
[0011 ] 第七，瓶苗移栽，待瓶苗新根长1-2公分时，进行瓶苗移栽，移栽前2天先打开瓶盖练苗。
[0012]第八，移栽苗管理，刚移出的苗要半遮光，保持45-55%的湿度，加强管理成活率可达90%以上。
[0013]第九，新品种评比试验，按常规新品种评比试验要求进行。
[0014]第十，药材产量、药物主要有效成分含量测定:根据《中华人民共和国药典》规定，对丹参酮II A、丹酚酸B和隐丹参酮进行测定。
[0015]第十一，绿色超级道地丹参新品种认定:按上述程序，依据得到的丹参药材产量和主要药物有效成分含量，可培育出综和生物学性状好，抗生物及非生物胁迫能力强的绿色超级道地丹参新品种(药村产量和主要药物有效成分含量全面提高50%以上)。
[0016]第十二，绿色超级道地丹参新品种鉴定:通过基因组染色体鉴定，可以确定新培育出来的绿色超级道地丹参是一个具有3个相同基因组的三倍体丹参(2n=3x=24)，通过道地丹参亲本标记性状和DNA条形码可以确定被固定的道地丹参功能基因组的来源。 [0017]通过本发明以上程序选育出来的丹参新品种，与常规的有性杂交育种不同，它是将已知的道地丹参功能基因组及其所有特征基因，以三倍体丹参形式被“永久”的固定下来，三倍体不能行正常有性生殖，在“空间”上与其他物种形成了生殖隔离，没有有性后代分离，是“永久F1”永久杂种，是迄今为止唯一具有自然界二大优势，即:多倍体优势和杂种优势的种群，其优势表现出巨大性和不可替代性。因此，本发明是利用中药道地功能基因组及其特征基因，依据道地中药本身固有的基因，培育对生物及非生物胁迫能力强的绿色超级道地中药的有效方法。
[0018]本发明提供的绿色超级道地中药丹参新品种的培育方法，与以往的常规有性杂交育种不同，所谓绿色中药(丹参)是不施或少施化肥，不打农药，它完全是依据道地中药(丹参)自身固有的特征功能基因组和基因，抵抗外来生物及非生物胁迫，达到提高药材产量，增加药物有效成分含量，促进中药可持续性生产。它一不靠化肥，二不靠农药，三不靠外来基因，完全靠道地中药自身固有的特征功能基因组和基因，实现绿色健康中药产业化。所谓超级丹参，也不是靠外来异源基因，它是依据高等植物主要进化途径一一基因组多倍化与杂交相结合，将3个以上同源道地功能基因组聚合在一起，充分显示出道地丹参特征基因组的剂量效应。通过生殖隔离，形成一个永久杂种，将多倍体优势和杂种优势永久的被保存下来，并固定在一个品种中，使其成为具有迄今为止自然界唯一具有的两大优势一杂种优势和多倍体优势的种群。因此，本发明提供的绿色超级道地丹参的培育方法，是挖掘和利用我国道地中药功能基因组的重要途径，对我国中药新品种培育和可持续发展具有重要意义和应用价值。
[0019]【专利附图】
【附图说明】[0020]图1:中国丹参种质资源圃。
[0021]图2:丹参基因组染色体结构:(a)2x，(b)3x, (c)4x。
[0022]图3-1:丹参显性、隐性标记性状:(a)紫花，(b)白花。
[0023]图3-2:道地丹参三联密码DNA条形码。
[0024]图4:绿色超级道地丹参大田种植生长势。
[0025]图5:绿色超级道地丹参新品种根部药材。
[0026]【具体实施方式】: 本发明可从下述实例中得以体现，但它不会对本发明作任何限制。
[0027]本发明提供的绿色超级道地丹参的培育方法包括以下步骤:
⑴建立中国丹参种质资源圃，收集全国野生丹参种质资源；
⑵从形态学、细胞生物学、分子生物学、化学(药物成分测定)层面对我国丹参种质资源进行研究，评选出具有代表性的道地丹参种质资源。
[0028]⑶对评选出的道地丹参种质资源的基因组染色体结构进行鉴定。
[0029]⑷利用AFLP分子标记技术(王冰等:中国中药杂志32 (19) 2007.10))确定道地丹参DNA条形码。
[0030](5)三倍体杂交转育:分别将具有隐性标记性状和具有显性标记性状的四倍体丹参，分别与具有相对标记性状的二倍体道地丹参(2x，含有2个相同道地丹参功能基因组)进行杂交(4x早Χ2χ ?或2x早Χ4χ ? )，获得三倍体丹参永久杂种(3x，含有3个相同道地丹参功能基因组)。
[0031](6)脱毒处理:以三倍体丹参杂交当代种子幼苗茎尖或新生幼叶为外植体，用75%酒精和0.1 %升汞进行脱毒处理。
[0032](7)组培苗克隆增殖，将脱毒处理完的外植体接种在1/2MS + 6BA1。5mg/L培养基上，在光周期14小时/天，光强度3000LUX，室温20— 25°C条件下进行光照培养，待接种材料切割面产生丛生芽，转入1/2MS + 6BAlmg/L培养基上，进行扩大繁殖。
[0033](8)瓶苗移栽:待瓶苗新根长2— 3公分时，进行瓶苗移栽，移栽前2天先打开瓶盖
练苗；
⑶移栽苗管理:刚移出的瓶苗要半遮光，保持50%左右的湿度，加强管理成活率可达90%以上。
[0034](10)新品种评比试验:按常规新品种评比试验要求进行。
[0035]除按一般常规新品种评比试验要求进行外，本发明提供的绿色超级道地中药丹参，只施2000公斤/亩农家有机肥，全程不施或少施化肥，不打农药，完全依靠绿色超级丹参本身所具有的道地功能基因组，对生物及非生物胁迫的抵抗能力。
[0036](11)药材产量、药物主要有效成分含量测定:根据《中华人民共和国药典》规定，对丹参酮II A、丹酚酸B和隐丹参酮进行测定。
[0037](12)绿色超级道地丹参新品种认定:按上述程序，可培育出综合生物学性状好，抗生物及非生物胁迫能力强，药材产量和主要药物有效成分含量高的绿色超级道地丹参新品种(全面提高50%以上)。
[0038]通过基因组染色体鉴定，可以确定新培育出来的绿色超级道地丹参是一个具有3个相同基因组的三倍体丹参(2n=3x=24)，通过道地丹参亲本标记性状和DNA条形码可以确定被固定的道地丹参功能基因组的来源。
[0039]按照上述的步骤进行，2004— 2012年从全国12个省、市采集了 36个不同地理居群丹参，并在天津市北部山区蓟县建立了中国丹参种质资源圃(图1)。
[0040]经2005— 2007年从形态学、化学、细胞生物学和分子生物学不同层面的研究，评选出33号、I号、135号种质资源为我国道地丹参种质资源。
[0041]随后应用AFLP分子标记技术，以三联密码法(3个引物法)确定这3个道地丹参DNA条形码，并以“紫花”和“白花”作为显性与隐性形态性状标记，随后将33号(白花)和I号(紫花)道地丹参人工诱变成同源四倍体(2n=4x=32)，然后与相对标记性状的二倍体丹参进行有性杂交，获得同源三倍体丹参永久杂种(2 η = 3 X = 24)。例如:以白花隐性性状的四倍体杂交，不论是做父本或是母本，其Fl三倍体均为紫花，即:白花4χ早X紫花2χ ? —3χ紫花，或紫花2χ早X白花4χ ? —3χ紫花。这样，通过紫花与白花标记性状和DNA条形码就可知道其基因组来自哪个道地丹参亲本。表1为采用高效液相色谱法测定其含量，绿色超级道地丹参主要药物有效成分测定结果。
[0042]表1:
代号根条数/株根长根粗根重Kg/株丹参酮II A mg/g丹参酮I mg/g稳丹参酮mg/g丹酸酸B mg/g RY3 50.25 57.50 18.20 2.4206.3891.07952.04662.992 注解:《中华人民共和国药典》2005年版规定:丹参酮II A含量为0.2%，丹酚酸含量为3%。
【权利要求】
1.一种道地丹参的培育方法，其特征在于包括以下步骤: 1)收集全国野生丹参种质资源建立丹参种质资源圃，建立具有中国代表性的丹参种质资源圃； 2)从形态学、细胞生物学(染色体水平)、分子生物学水平对中国丹参种质资源进行研究，评选出具有代表性的道地丹参种质资源； 3)对评选出的道地丹参种质资源的基因组染色体结构进行鉴定； 4)利用AFLP分子标记技术确定道地丹参DNA条形码； 5)将一个具有隐性标记性状的二倍体道地丹参和一个具有显性标记性状的二倍体(2x)道地丹参，分别进行人工诱变成同源四倍体:4x，含有4个相同的道地丹参功能基因组； 6)三倍体丹参杂交转育，分别将具有隐性标记性状(白花)和具有显性标记性状(紫花)的四倍体丹参，分别与具有相对性标记性状的二倍体道地丹参，2x，含有2个相同道地丹参功能基因组，进行杂交转育:4x早Χ2χ ?或2x早Χ4χ ?，获得具有标记性状的三倍体丹参永久杂种:3χ，含有3个相同道地丹参功能基因组； 7)脱毒处理:取三倍体丹参杂交当代种子幼苗茎尖或新生幼叶为外植体，用75%酒精和0.1%升汞进行脱毒处理； 8)组培苗克隆快繁:将脱毒处理完的材料接种在1/2MS+ 6ΒΑ1.5mg/L培养基上，在光周期14小时/天，光强度3000Lux，室温20— 25°C条件下进行培养，待材料切割面产生丛生芽，转入含1/2MS + 6BAlmg/L培养基上进行扩大繁殖； 9)瓶苗移栽，待瓶苗新根长2—3公分时，进行瓶苗移栽，移栽前2天打开瓶盖练苗； 10)移栽苗管理，刚移出的瓶苗要半遮光，保持50%左右的湿度，加强管理成活率可达90%以上； 11)新品种评比试验，按常规新品种评比试验要求进行； 12)药材产量、药物主要有效成分含量测定，根据《中华人民共和国药典》规定，对丹参酮II A、丹酚酸B和隐丹参酮进行测定； 13)道地丹参新品种认定:按上述程序，依据得到的丹参药材产量和主要药物有效成分含量，可培育出综合生物学性状好，抗生物及非生物胁迫能力强，全面提高50%以上的道地丹参新品种。
2.按照权利要求1所述的培育方法，其特征在于步骤8)所述的扩大繁殖采用每瓶接种5—10棵苗。
3.按照权利要求1所述的培育方法，其特征在于步骤9)所述的瓶苗移栽是用长摄子取出瓶苗，洗净培养基，直接移栽在经过事先堆积发酵好的磨姑泥与砂土 3:1混合营养钵中。
4.一种道地中药丹参的培育方法，其特征在于包括以下步骤: O收集全国野生丹参种质资源，建立具有代表性的丹参种质资源圃； 2)从形态学、细胞生物学(染色体水平)、分子生物学水平对丹参种质资源进行研究，评选出具有代表性的道地丹参种质资源； 3)对评选出的道地丹参种质资源的基因组染色体结构进行鉴定； 4)利用AFLP分子标记技术确定道地丹参DNA条形码； 5)将一个具有隐性标记性状和一个具有显性标记性状的二倍体(2x)道地丹参，分别进行人工诱变成同源四倍体:4x，含有4个相同的道地丹参功能基因组； 6)三倍体丹参杂交转育，分别将具有隐性标记性状(如:白花)和具有显性标记性状(如:紫花)的四倍体丹参，分别与具有相对标记性状的二倍体道地丹参(即2x，含有2个相同道地丹参功能基因组)进行杂交转育:4x早Χ2χ ?或2x早Χ4χ ?，获得具有标记性状的三倍体丹参永久杂种:3χ，含有3个相同道地丹参功能基因组； 7)脱毒处理:以三倍体丹参杂交当代种子幼苗茎尖或新生幼叶为外植体，用75%酒精和0.1%升汞进行脱毒处理； 8)组培苗克隆快繁:将脱毒处理完的外植体接种在1/2MS+ 6ΒΑ1.5mg/L培养基上，在光周期14小时/天，光强度3000Lux，室温20— 25°C条件下进行培养，待材料切割面产生丛生芽，转入1/2MS + 6BAlmg/L培养基上，进行扩大繁殖，每瓶可接种5 —10棵苗； 9)瓶苗移栽:待瓶苗新根长1-2公分时，进行瓶苗移栽，移栽前2天先打开瓶盖练苗，用长摄子取出瓶苗，洗净培养基，直接移栽在经过事先堆积发酵好的磨姑泥与砂土 3:1混合营养钵中。 10)移栽苗管理:刚移出的苗要半遮光，保持45-55%的湿度，按常规方法加强管理； 11)新品种评比试验:按常规新品种评比试验要求进行； 12)药材产量、药物主要有效成分含量测定:根据《中华人民共和国药典》规定，对丹参酮II A、丹酚酸B和隐丹参酮进行测定； 13)道地丹参新品种认定:按上述程序，依据得到的丹参药材产量和主要药物有效成分含量，培育出综和生物学性状好，抗生物及非生物胁迫能力强的道地丹参新品种。
5.按照权利要求4所述的培育方法，其特征在于步骤5)所述的隐性标记性状为白花，显性标记性状为紫花。
6.按照权利要求4所述的培育方法，其特征在于步骤6)所述的三倍体丹参杂交转育是:将白花道地丹参和紫花道地丹参人工诱变成同源四倍体:2n=4x=32，然后与相对标记性状的二倍体丹参进行有性杂交，获得同源三倍体丹参永久杂种:2 η = 3 X = 24，即以白花隐性性状的四倍体杂交，不论是做父本或是母本，其Fl三倍体均为紫花: 白花4χ早X紫花2χ ? — 3χ紫花，或紫花2χ早X白花4χ ? — 3χ紫花。
【文档编号】A01H1/02GK103828705SQ201410013083
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】陈瑞阳 申请人:陈瑞阳