专利名称：：丹参est-ssr分子标记的制备方法、特异引物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中药材的生物技术、分子遗传学研究
技术领域：
，尤其是丹参EST-SSR分子标记的制备方法、特异引物及其应用。
背景技术：
：丹参是著名的活血化瘀药，《中华人民共和国药典》收载的唇形科鼠尾草属植物5Wf/s肌7〃orr力/^3是其唯一的基源植物，以干燥的根及根茎入药，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效，用于治疗心绞痛、冠心病等症，是我国传统医药学中应用最早而且最广泛的药物之一。近年来，对丹参的化学成分、药理作用等研究日趋深入，但对其群体遗传多样性、种质分类鉴定、个体基因组构成等方面的相关研究报道相对较少。特别是在丹参研究中能够应用的分子标记技术十分有限，仅有少数应用RAPD(郭宝林，林生，冯毓秀，赵杨景.2002.丹参主要居群的遗传关系及药材道地性的初步研究.中草药，33(12):1113-1116.)、ITS(汪红，王强.2005.丹参及鼠尾草属植物的rDNAITS序列分析.中草药，36(9):1381-1385.)、AFLP(王冰，张勇，陈成彬，李秀兰，陈瑞阳，陈力.2007.中国不同地理居群丹参遗传多样性分析.中国中药杂志，32(19):1988-1991.)及ISSR(徐红,王燕燕，魏丹红，王峥涛.2007.不同产地丹参药材的ISSR分析与鉴别.中药新药与临床药理，18(6):454-457.)通用引物进行多样性研究的报道，尚未开发出能够应用于丹参种质鉴定、遗传图谱构建、功能基因定位等研究的简便、高效、稳定且具有种属特异性的分子标记体系。简单重复序列(simplesequencerepeat,SSR),是指DM分子中1-6个核普酸的串联重复，广泛分布于真核生物基因组的编码区和非编码区(MorganteM，HanafeyM,PowellW.2002.Microsatel1itesarepreferentiallyassociatedwithnonrepetitiveDNAinplantgenomes.NatureGenetics,30(2):194-200)。由于SSR具有随机分布、多态性丰富、共显性遗传、重现性好、特异性强等特点，被广泛用于遗传作图、功能基因定位、遗传多样性研究及DNA指紋图谱构建等诸多方面，具有公认的优越性和应用前景。但传统SSR标记的开发通常需经过文库构建，包括SSR克隆的筛选、测序、引物设计和PCR扩增与分析等步骤，要投入大量的人力物力，开发成本很高。从表达序列标签(expressedsequencetag,EST)中开发的SSR标记(EST-SSR)是近年发展起来的新型分子标记，与基因组SSR相比，它反映了基因组的编码区域，可以直接获得基因表达的信息，为功能基因提供"绝对"的标记，这有可能对决定重要表型性状的等位基因进行直接鉴定；省去了SSR引物开发过程中的克隆和测序步骤，充分利用了现有测序数据，降低了开发成本；在不同物种间通用性好，具有4交高的转移性(KantetyRV,LaRotaM,MatthewsDE,SorrellsME.2002.Dataminingforsimplesequencerepeatsinexpressedsequencetagsfrombarley,maize,rice,sorghumandwheat.PlantMolecularBiology,48(5-6):501-510.)。自2000年起,已相继在水稻、小麦、马铃薯、柑橘、甜瓜、莴苣、鹰嘴豆等多种植物中开展了EST-SSR标记开发，并广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、功能基因定位、比较作图等研究中。截止2009年1月16曰，在GenBank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/)中释放有鼠尾草属植物EST共11748条，其中包括10288条丹参EST,但目前还没有利用这些EST开发SSR标记的报道。
发明内容本发明的主要目的是提供一种丹参EST-SSR分子标记的制备方法，对GenBank中登录的丹参EST序列进行整理，挖掘SSR位点信息，依据SSR位点侧翼序列进行PCR引物设计，构建丹参种属特异性EST-SSR标记体系，为丹参遗传多样性分析及种质鉴定等研究奠定基础。本发明的另一个目的是提供一系列上述丹参EST-SSR分子标记制备方法中设计的特异引物。本发明的又一个目的是提供上述？1物的应用。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下丹参EST-SSR分子标记的制备方法，包括下述主要步骤(1)丹参EST序列的获得及预处理乂人GenBank(http//:www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)中下载丹参EST序歹l);采用VecScreen及RepeatMasker或其它类似软件去除载体污染和重复序列，以EST-trimmer或其它类^U欠4牛除去5'端或3'端的polyT或polyA,以Phrap或CAP3或ClastalX等类似软件进行EST重叠群分析和聚类、去除冗余EST序列，并去除长度小于lOObp(bp是指基因(碱基对)序列长，lbp-l碱基对)的EST序列,拼接后得到非冗余Uni-EST序列。由于登录于GenBank的丹参EST序列在进行cDNA文库构建、序列测定、结果分析及序列登录等环节均会存在一定的偏差，最终公布的EST序列信息存在测序载体污染、polyA或polyT富集、序列冗余等问题。对登录的EST序列进行包括去除载体污染和重复序列、去除末端polyT或polyA、去除冗余EST序列及序列长度过短的EST序列等在内的预处理，是进行SSR位点正确检索的首要程序，也是SSR位点检索分析严谨性的必要保证，更是最终能否开发有效EST-SSR标记的关键之一。因此，本发明中预先对GenBank中登录的丹参EST序列进行严格标准的预处理，最终获得的非冗余Uni-EST序列，可保证EST-SSR标记开发后续工作的有效进行。(2)丹参EST序列中SSR位点的筛选釆用SSR位点检索专用软件(如可任意选用SSRIT、SSRhunter、SSRPrimer、MISA等)，在上述步骤(1)得到的非冗余Uni-EST序列中检索SSR位点，检索的限制条件包括不同重复基元的SSR其总重复序列长度》20bp;二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸至少重复次数分别为10次、7次、5次、4次、4次；中间被《5bp的间隔碱基打断的不完全重复SSR计为一个SSR位点；才企索得到一系列EST-SSR位点。本步骤中①由于扫描得到的单核苦酸重复基本为A/T重复，且主要位于EST序列末端，存在为EST序列残存polyA或polyT的可能性，其可靠性有待进一步确认，因此，本发明未对单核苷酸重复SSR位点进行分析；②同样，对"不同重复基元的SSR其总重复序列长度》20bp"的限定，也是为了通过严格限定SSR位点检索条件，以增加检索结果的可靠性及对引物开发的有效性。(3)丹参EST-SSR引物的设计与合成依据上述步骤(2)得到的EST-SSR侧翼区域序列，应用软件(如Primer3.0或PrimerPremier5.0等软件)进行引物设计，引物设计主要参数包括GC含量40y。-60。/a,Tm(退火温度)值45°C-65°C，引物长度18bp-23bp，预期扩增产物长度120bp-350bp;得到的引物序列经Blastn比对，根据结果重点对3'端碱基及正反向引物间隔进行调整，使引物3'端碱基与扩增位点相一致，得到一系列EST-SSR位点特异引物。51物设计完成后进行合成。在目前现有技术的研究中，在筛选到SSR位点后，依据其侧翼序列进行引物设计的工作主要由计算机软件实现，其优点是高效、快捷。但由于PCR引物对于3'端的严格要求、生物基因组序列多态性的存在以及丹参居群间高水平遗传多样性的表现，如果仅依据GenBank登录的单一基因型的丹参EST序列进行引物设计，将会导致EST-SSR标记在丹参不同居群间的应用以及在鼠尾草属近缘物种间的通用性分析中的扩增效率明显降低。因此，本发明在以专业引物设计软件进行EST-SSR引物初次筛选的基础上，利用EST序列的保守性，进行Blastn比对分析，依据比对结果，重点对初筛的EST-SSR引物3'端碱基及正反向引物间隔进行调整，使引物3'端碱基与扩增位点相一致，以保证丹参EST-SSR标记的扩增有效性及通用性。(4)丹参EST-SSR引物的筛选采用上述步骤(3)合成的引物，以丹参或者其它鼠尾草属近缘物种样品的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，根据扩增结果，筛选得到可有效扩增的丹参EST-SSR引物。对各种样品的基因组DNA进行PCR扩增时，可采用下述扩增体系25jaL扩增体系中含有:lxPCRbuffer、MgCl21.5隱ol/L、dNTPs200jamol/L、正反向引物各O.5jumol/L、基因组模板DNA50ng以及TaqDNA聚合酶0.5U。以热循环仪进行扩增，PCR扩增程序可为①94。C预变性3min;②94。C变性30s、65。C退火30s，每循环降rC,72。C延伸60s,IO个循环；③94。C变性30s、55。C退火30s、72。C延伸60s、23个循环；④72。C延伸7min。PCR扩增反应完成后，向产物中加入6xloadingbuffer5jaL混匀，于8%非变性连续PAGE(Acr:Bis=39:1)、150V恒压电泳2h左右，采用4艮染方法显带，记录结果。依据扩增结果，分析丹参EST-SSR引物有效性及通用性，筛选出可有效扩增的丹参SET-SSR引物。通过上述丹参EST-SSR分子标记的制备方法，依据EST-SSR侧翼区域序列设计、并经过PCR扩增检测筛选得到的一系列EST-SSR位点扩增特异引物，见图1中的83对正反向引物。上述一系列EST-SSR位点扩增特异引物的应用可用于丹参及鼠尾草属近缘物种的遗传多样性评价、亲缘关系或种质鉴定、遗传连锁作图、分子标记辅助选择、基因定位克隆、功能基因组分析以及相关研究等。与现有技术相比，本发明的有益效果是根据本发明提供的丹参EST-SSR分子标记的制备方法，针对丹参EST进行SSR位点挖掘，对这些EST-SSR在丹参转录组中的分布特征进行全面分析，可依据SSR位点侧翼序列进行PCR引物设计，并在此基础上构建丹参种属特异性EST-SSR标记体系；为丹参及鼠尾草属近缘物种的遗传多样性评价、亲缘关系或种质鉴定、遗传连锁作图、分子标记辅助选择、基因定位克隆、功能基因组分析以及相关研究奠定基础。图1:依据丹参EST中SSR位点侧翼序列设计并经PCR扩增筛选的EST-SSR引物序列及相应的重复基序；图2:实施例1、2中涉及的用于EST-SSR标记检测的丹参及鼠尾草属近缘物种材料信息；图3:丹参EST-SSR标记Sm-ES019在供试材料中的扩增结果(1-23:供试材料编号，详见图2;M:DNA分子量标准)；图4:丹参EST-SSR标记Sm-ES051在供试材料中的扩增结果(l-23:供试材料编号，详见图2;M:DNA分子量标准)；图5:依据EST-SSR检测结果得到的供试材料聚类结果；图6:依据EST-SSR检测结果得到的供试材料主成分分析结果。具体实施例方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。应当指出的是，以下例举的实施例旨在进一步阐述本发明相关内容，但并不对本发明的保护范围构成任何限制，即不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。实施例1本实施例为丹参EST-SSR分子标记的制备方法(及扩增效率分析)，其制备方法包括下述主要步骤(1)丹参EST序列的获得及预处理2008年12月，从GenBank(http〃www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)中以FASTA才各式下载共计10288条丹参EST序列。采用VecScreen及RepeatMasker去除载体污染和重复序列，以EST-trimmer除去5'端或3'端的polyT或polyA,以Phrap进行EST重叠群分析和聚类去除冗余EST序列，并去除长度小于1OObp的EST序列。对GenBank中登录的丹参EST序列进行整理后，拼接后共获得总长约2026kb的4192条非冗余Uni-EST序列，其中contigs1276条、singletons2916条。(2)丹参EST序列中SSR位点的筛选采用SSRIT软件，在上述步骤(l)得到的4192条非冗余Uni-EST序列中检索SSR位点，检索的限制条件包括不同重复基元的SSR其总重复序列长度>20bp;二核苦酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苦酸、六核香酸至少重复次数分别为10次、7次、5次、4次、4次；包括中间被<5bp的间隔碱基打断的不完全重复SSR计为一个SSR位点；检索得到一系列EST-SSR位点。(3)丹参EST-SSR引物设计与合成依据上述步骤(2)得到的EST-SSR侧翼区域序列，应用Primer3.0软件进行引物设计，引物设计主要参数包括GC含量40°/。-60°/。，Tm值45°C-65°C,引物长度18bp-23bp,预期扩增产物长度120bp-350bp。设计的引物序列经Blastn比对，根据结果重点对3'端碱基及正反向引物间隔进行调整，使引物3'端碱基与扩增位点相一致，得到一系列EST-SSR位点特异引物。引物设计完成后，由Invitrogen公司(Invitrogen,America)进行合成。(4)丹参EST-SSR引物的筛选选取13份丹参材料，包括7份野生居群和6份栽培居群，同时选取10份鼠尾草属近缘物种用于检测丹参EST-SSR标记的通用性，具体信息详见图2。每个样本随机选取3个单林，采幼叶等量混合，取0.2-0.5g新鲜幼叶于液氮中研成粉末；将粉末转至1.5mL离心管中，力。500jaL预热提取緩沖液(2%CTAB、lOOmMTris-HCl,pH8.5、50mMEDTA，pH8.0、lOOmMNaCl)，65。C水浴60min，其间混勻ft次；加等体积氯仿异戊醇(24:1),3000r/min离心20min;取上清，加2/3体积预冷异丙醇沉淀DNA,加200jaL超纯水溶解；加RNA酶至200ng/|jL，37。C处理60min;加等体积氯仿异戊醇(24:1)抽提2次；取上清，加2倍体积预冷无水乙醇于-20。C下沉淀DNA,70%乙醇洗涤2~3次，室温干燥后溶于适量超纯水。DNA纯度和浓度用0.8°/。琼脂糖凝胶和BioSpec-mini分光光度仪(Shimadzu，Japan)检测。采用上述步骤(3)合成的引物，首先以丹参样品样品基因组DNA进行扩增，以检测引物设计的可靠性、扩增^^莫式及其可用性。然后进一步以不同鼠尾草近缘物种基因组DNA进行PCR扩增，检测丹参EST-SSR标记在鼠尾草属种间的通用性；根据扩增结果，筛选得到可有效扩增的丹参EST-SSR引物(如图1所示)。本实施例中，对各样品的基因组DNA进行PCR扩增时，采用下述扩增体系25jaL扩增体系中含有1xPCRbuffer、MgCl21.5mmol/L、dNTPs(Sigma，America)200jamol/L、正反向引物各0.5jumol/L、基因组模板DNA50ng以及TaqDNA聚合酶(Takara,Japan)。5U。在I-Cycler热循环仪(Bio-RAD，America)进行扩增，PCR扩增程序为①94。C预变性3min;②94。C变性30s、65。C退火30s，每循环降rC，72。C延伸60s,IO个循环；③94。C变性30s、55。C退火30s、72。C延伸60s、23个循环；④72。C延伸7min。扩增反应完成后，向PCR产物中加入6xloadingbuffer5inL混匀，于8°/。非变性连续PAGE(Acr:Bis=39:1)、150V恒压电泳2h左右，采用银染方法显带，拍照、记录结果。依据扩增结果，分析丹参EST-SSR引物有效性及通用性，筛选出可有效扩增的丹参SET-SSR引物83对(图1)。实施例2本实施例为实施例1所得的引物用于丹参的遗传多样性分析及种质鉴定1、供试材料选取13份丹参材料，包括7份野生居群和6份栽培居群，同时选取10份鼠尾草属近缘物种用于^r测丹参EST-SSR标记在遗传多样性分析及种质鉴定应用中的有效性，具体信息详见图2。2、DNA提取每个样本随机选取3个单林，采幼叶等量混合，取Q.2-0.5g新鲜幼叶于液氮中研成粉末；将粉末转至1.5mL离心管中，力。500yL预热提取緩冲液(2%CTAB、lOOmMTris-HC1,pH8.5、50mMEDTA,pH8.0、lOOmMNaCl)，65。C水浴60min,其间混匀^t次；加等体积氯仿异戊醇(24:1),3000r/min离心20min;取上清液，加2/3体积预冷异丙醇沉淀DNA，加200juL超纯水溶解；加RNA酶至20Qng/|jL,37。C处理6Gmin;加等体积氯仿异戊醇(24:1)抽提2次；^Ji清，加2倍体积预冷无水乙醇于-2(TC下沉淀DNA，70%乙醇洗涤2~3次，室温干燥后溶于适量超纯水。DM纯度和浓度用0.8%琼脂糖凝胶和BioSpec-mini分光光度仪(Shimadzu,Japan)检测。3、EST-SSR扩增以筛选鉴定的丹参EST-SSR引物对供试材料进行PCR扩增；PCR扩增反应体系为25iaL扩增体系中含有:1xPCRbuffer、MgCl21.5mmol/L、dNTPs(Sigma,America)200jumol/L、正反向引物各0,5|amol/L、基因组模板DNA50ng以及TaqDNA聚合酶(Takara，Japan)0.5U;PCR扩增在I-Cycler热循环仪(Bio-RAD,America)进行，PCR扩增反应程序如下①94'C预变性3min;②94。C变性30s、65。C退火30s，每循环降rC，72。C延伸60s，IO个循环；③94。C变性30s、55。C退火30s、72。C延伸60s、23个循环；④72。C延伸7min。向PCR产物中加入6xloadingbuffer5juL混匀，于8°/。非变性连续PAGE(Acr:Bis=39:1)、150V恒压电泳2h左右，采用银染方法显带，拍照、记录结果(见图3、4)。在13个丹参居群中，EST-SSR引物共扩增出279个位点，平均每对引物产生3.88个位点，而且所有EST-SSR引物在供试丹参样品中均显示多态性扩增(图3、4)。同时，大多数丹参EST-SSR引物在供试的其他IO个异源鼠尾草属物种中同样能进行有效扩增，可转移率为50%-100%,平均为85%,丹参EST-SSR在鼠尾草属中具有很高的可转移性，可用于进一步的多样性分析、比较基因组学等研究中(图3、4)。4、EST-SSR扩增结果数据转化及分析EST-SSR为共显性标记，按照扩增条带的有无分别记为1和0，只选用150bp-500bp间且在两次重复中均出现的清晰条带记分。其结果为一个0、1二元矩阵，将其输入NTSYS-pc软件处理分析，以SIMQUAL子程序计算样本间的Jaccard相似系数。之后，基于遗传相似系数矩阵，依据UPGMA算法并以SHAN子程序进行聚类分析(图5)。同样，基于遗传相似系数矩阵，以DCENTER和EIGEN子程序进行主成分分析(PC0)，生成前2个主成分的二维图(图6)。以UPGMA算法对所有供试材料进行聚类分析，结果表明EST-SSR分析可明确区分丹参及其他鼠尾草属近缘物种，所有分析材料可聚为两大类一I:丹参；II:其他鼠尾草属近缘物种(图5)。将Jaccard相似性系数做DCENTER转换，进行主成分分析，结果显示供试丹参居群间存在丰富的多样性，野生居群与栽培居群间分化明显(图6)。权利要求1、丹参EST-SSR分子标记的制备方法，包括下述主要步骤(1)、丹参EST序列的获得及预处理从GenBank中下载丹参EST序列；去除载体污染和重复序列，去除5’端或3’端的polyT或polyA，进行EST重叠群分析和聚类、去除冗余EST序列，并去除长度小于100bp的EST序列，拼接后得到非冗余Uni-EST序列；(2)、丹参EST序列中SSR位点的筛选采用SSR位点检索专用软件，在上述步骤(1)得到的非冗余Uni-EST序列中检索SSR位点，检索的限制条件包括不同重复基元的SSR其总重复序列长度≥20bp；二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸至少重复次数分别为10次、7次、5次、4次、4次；中间被≤5bp的间隔碱基打断的不完全重复SSR计为一个SSR位点；检索得到一系列EST-SSR位点。(3)、丹参EST-SSR引物的设计与合成依据上述步骤(2)得到的EST-SSR位点的侧翼区域序列，进行引物设计，引物设计主要参数包括GC含量40％-60％，Tm值45℃-65℃，引物长度18bp-23bp，预期扩增产物长度120bp-350bp；得到的引物序列经Blastn比对，根据结果重点对引物的3’端碱基及正反向引物间隔进行调整，得到一系列EST-SSR位点扩增特异引物；引物设计完成后进行合成；(4)、丹参EST-SSR引物的筛选采用上述步骤(3)合成的引物，以丹参或者其它鼠尾草属近缘物种样品的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，根据扩增结果，筛选得到可有效扩增的丹参EST-SSR引物。2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)中，进行PCR扩增时，采用下述扩增体系25jaL扩增体系中含有:lxpCRbuffer、MgCl21.5mmol/L、dNTPs200jimol/L、正反向引物各O.5|amol/L、基因组模板DNA50ng以及TaqDNA聚合酶0,5U。3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)中，进行PCR扩增时，采用的PCR扩增程序为①94。C预变性3min;②94。C变性30s、65。C退火30s，每循环降1'C,72。C延伸60s,10个循环;③94"C变性30s、55。C退火30s、72。C延伸60s、23个循环；④72。C延伸7niin。4、根据权利要求1所述的制备方法得到的EST-SSR位点特异引物，分别包括下列表格中的83对引物序列:<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>5、权利要求4所述的引物的应用，包括用于丹参及鼠尾草属近缘物种的:(1)遗传多样性评价；(2)亲缘关系鉴定；(3)种质鉴定；(4)遗传连锁作图；(5)分子标记辅助选择；(6)基因定位克隆；(7)功能基因组分析。全文摘要本发明公开了一种丹参EST-SSR分子标记的制备方法，主要包括丹参EST序列的获得及预处理、丹参EST序列中SSR位点的筛选、丹参EST-SSR引物的设计与合成、丹参EST-SSR引物的筛选等步骤。该方法针对丹参EST进行SSR位点挖掘，依据SSR位点侧翼序列进行PCR引物设计，并在此基础上构建丹参种属特异性EST-SSR标记体系；为丹参及鼠尾草属近缘物种的遗传多样性评价、亲缘关系或种质鉴定、遗传连锁作图、分子标记辅助选择、基因定位克隆、功能基因组分析以及相关研究等奠定基础。本发明还公开了依据上述丹参EST-SSR分子标记制备方法得到的EST-SSR位点特异引物及其应用。文档编号C12P19/00GK101684481SQ20091005874公开日2010年3月31日申请日期2009年3月30日优先权日2009年3月30日发明者任正隆,勇张,彭金华,熊丙全,赵晓楠,邓科君申请人:电子科技大学