石斑鱼仔鱼三联复合免疫增强剂及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种石斑鱼仔鱼三联复合免疫增强剂及其制备方法，涉及基因工程和生物【技术领域】。具体而言，特指将组成石斑鱼溶菌酶、凝集素和干扰素的基因共同构建到多顺反子供体质粒上；在大肠杆菌DH10Bac中和家蚕杆状病毒DNA发生重组；在Sf-9细胞中制备3种基因组合的重组病毒；感染宿主昆虫家蚕，在家蚕体内进行多蛋白复合物的表达；收集感染后的家蚕体液或整体匀浆，经分离纯化后获得目的产物。所制备的三联复合免疫增强剂可应用于仔鱼保健和疾病防治，具有生产成本低、使用方便，应用领域广泛等特点。
【专利说明】石斑鱼仔鱼三联复合免疫增强剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程和生物【技术领域】，具体而言，特指应用家蚕生物反应器制备三联复合免疫增强剂的方法，在同一生产工艺流程中，可生产出溶菌酶、凝集素和干扰素3种功能成份，通过联产工艺制成一种三联复合免疫增强剂，可明显提高石斑鱼稚鱼的免疫力和疾病抵抗力，从而提高石斑鱼鱼苗全周期养殖的成活率。
技术背景 [0002]石斑鱼，属鲈形目鯧科鱼类，其生长速度快，价格昂贵，经济价值高，已成为我国南方地区具有重要经济价值的一种海水养殖鱼类。但是，有一个因素严重制约了石斑鱼养殖产业的发展，这个限制因素就是:石斑鱼种苗的成活率非常低，仅为14.67%。其成活率低的原因除了生产管理因素之外，主要是因为仔鱼在孵化后的一定时间内，其自身的免疫系统尚不完善，不能针对养殖水体中各种病原体产生有效的抵抗力。引起仔鱼疾病的病原菌主要是条件致病菌而不是特异性的致病菌，因此可以用免疫增强剂提高仔鱼的非特异性免疫力。
[0003]溶菌酶(Lysozyme)是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β -1, 4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。鱼类溶菌酶存在于鱼类的粘液、血清、吞噬细胞和单核细胞的胞浆内。鱼类溶菌酶的活性受季节影响，夏季的活性比冬季增加2-3倍，这可能是鱼类的季节性疾病发生的原因之一。溶菌酶通过酶解病原体细胞壁的粘多糖将其杀死，因此溶菌酶的水平和活性直接关系到鱼类的免疫能力和健康。
[0004]凝集素(Agglutinin)是一种对特异糖残基有闻度未合力的蛋白质。目如有关鱼类凝集素的研究报道较少，仅从草鱼、欧洲鲤鲡和虹鳟的血清以及淡水叉尾鲴的分泌液和鲶鱼皮肤、粘液中检查出对某些细菌和红血球具有凝集作用的自然凝集素。早在1979年toss等发现大麻哈鱼卵中含有母源性凝集素，并进行了纯化和活性研究，发现此凝集素具有抑制鱼类病原性细菌的生长。关于鱼类卵中凝集素的功能，据推测与调节碳水化合物代谢、阻止多精入卵、形成受精膜、促进受精卵的有丝分裂、调理病原体以及杀菌等作用。从进化的角度来看，鱼类虽然已可产生抗体，但仅有IgM，且功能也尚未完善，凝集素的存在可能在一定程度上弥补了这方面的不足.它能有效地识别和凝集异已成分，从而有利于异物的清除。因此，有可能作为防止感染性微生物侵入的第一道防线，起着防御作用。
[0005]干扰素(Interferon, IFN)是脊椎动物体内的能诱导细胞产生抗病毒蛋白质的一种可溶性蛋白，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。自1965年首次发现鱼类干扰索恬性物质以来，陆续在鲦鱼、虹鳟、鯧科鱼类、大麻哈鱼、鲤鱼、草鱼、金鱼、斑鲴鱼等鱼体和培养细胞系检测到干扰素，它主要由巨噬细胞分泌，生成速度受温度影响。近年来的研究表明，鱼类干扰素的抗病毒机制类似于哺乳动物的干扰素，表现出在同种细胞上具有广谱的抗病毒活性，对鱼类和非鱼类病毒、RNA和DNA病毒都有抑制作用，还有影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。
[0006]目前生产溶菌酶、凝集素和干扰素的方法很多，但将三者同时表达纯化制成一种既能提高机体免疫抗病能力又能促进细免疫器官发育的复合免疫增强剂产品至今未见报导。相关研究报道表明，仔鱼可通过卵黄获得母源抗体从而得到强有力的被动免疫，提高其自身的抗病能力。在鱼类卵母细胞或胚胎中存在凝集素、溶菌酶和IFN，由于卵母细胞、受精卵和胚胎都不可能合成凝集素、溶菌酶和IFN，所以这些物质被认为是来源于母体的自然免疫物质，它们在硬骨鱼类胚胎发育和早期胚后发育中可能起着重要的免疫保护作用。因此，及时向体内补充血清溶菌酶、凝集素和干扰素三种具有不同免疫功能的生物活性成份是预防和治疗疾病的有效途径。主要用于增强仔鱼期的免疫力和抗病力，同时促进仔鱼免疫系统的发育和功能完善，从而提高鱼苗养殖全周期的成活率，具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，首次提出石斑鱼仔鱼三联复合免疫增强剂，及应用家蚕生物反应器高效、廉价、大规模制备出溶菌酶、凝集素和干扰素三联复合免疫增强剂的方法。
[0008]本发明技术方案的总体描述:将完整的石斑鱼溶菌酶、凝集素和干扰素cDNA克隆到一种新型能实现多基因的同时表达的多顺反子载体PFBDM上，获得重组供体质粒pFBDM-Ly-Lectin-1FN。在经过改造的大肠杆菌DHlOMultiBacCr/AcMNPV中和家蚕AcMNPV-Bacmid于Tn7转座子上发生转座，通过蓝白斑筛选出带有正确基因的克隆，随后在Sf-9细胞中制备含 该3种基因的重组病毒。用获得的重组病毒感染宿主昆虫家蚕，收集含表达了石斑鱼溶菌酶、凝集素和干扰素蛋白复合物的家蚕幼虫的体液或整体匀浆，在裂解缓冲液存在下经超声波裂解，4°C下进行高速离心，收集的上清应用透析和分子筛层析的方法进行分离纯化，最终获得到纯化后的产物。
[0009]本发明所述的石斑鱼仔鱼三联复合免疫增强剂，是应用家蚕生物反应器制备的溶菌酶、凝集素、干扰素三联复合免疫增强剂。
[0010]所述三联复合免疫增强剂通过下述方法制备:将赤点石斑鱼溶菌酶、凝集素和干扰素的基因构建到多顺反子载体PFBDM上，获得重组供体质粒pFBDM-Ly-Agl-1FN，在经过改造的大肠杆菌DHlOMultiBacCr/AcMNPV中和家蚕AcMNPV-Bacmid杆状病毒DNA于Tn7转座子上发生转座，通过蓝白斑筛选出带有正确亚基的克隆，随后在Sf-9细胞中制备该3种基因组合的重组病毒，用获得的重组病毒感染宿主昆虫家蚕，在宿主昆虫家蚕体内表达并包装成多蛋白复合物的溶菌酶、凝集素、干扰素经分离纯化后获得。
[0011]本技术方案所述的石斑鱼溶菌酶、凝集素和干扰素相应的cDNA分别源自赤点石斑鱼基因EaLys、EaAgrjP EaIfn ;所述的杆状病毒是家蚕杆状病毒AcMNPV ;所述的宿主昆虫为家蚕(Bombyx mori),品种为306 ;所述的宿主昆虫感染时间是五龄期幼虫；所述的感染方法是经昆虫表皮注射接种感染；所述的杆状病毒供体质粒是PFBDM，所制备的重组家蚕杆状病毒是 pFBDM-Ly-Lectin-1FN。[0012]本技术方案所述的分离纯化是指:收集的家蚕幼虫的体液或整体匀浆经超声波裂解、高速离心后含表达了多蛋白复合物的上清，经过透析和分子筛层析柱分离纯化出高纯度的目的产物。更具体的是指收集含表达了溶菌酶、凝集素和干扰素多蛋白复合物的家蚕幼虫的体液或整体匀浆，在裂解缓冲液存在下经超声波裂解，4°C下进行高速离心，收集的上清经过透析和分子筛层析柱分离纯化，获得到纯化后的产物。
[0013]本发明的突出优点表现为:
[0014]1、本发明将溶菌酶、凝集素和干扰素3种成份同时表达纯化，制成一种三联复合免疫增强剂产品，具有生产成本低、使用方便，应用领域广泛等特点，且各成分配伍合理，相互协同，功能更强，目前未见有文献报道。该产品为纯天然生物制剂，可显著提高动物机体的体液免疫和细胞免疫功能，并能有效地清除体内病菌和病毒，具有促进机体免疫功能发育的作用，可广泛应用于动物真菌、细菌、病毒性疾病的预防和治疗。特别对解决当前养殖业存在滥用抗生素预防疾病的问题是一项有效措施。
[0015]我们将三联复合免疫增强剂试制品于2012年-2013年应用于动物保键和疾病治疗试验均取得显著效果；如将其作为鱼苗饲料添加剂使用，添加量仅为0.1%-0.2% ;能明显增强鱼苗的免疫力，提高成活率；免疫效果明显优于单一免疫增强剂，而且还克服了单一免疫制剂长期使用造成的免疫抑制现象，可以在动物养殖全周期使用。
[0016]2、家蚕是目前唯一可以大规模商业化无菌饲养的昆虫物种，使用家蚕作为生物反应器大量制备出溶菌酶、凝集素和干扰素三联复合免疫增强剂，成本低廉，来源稳定。该工艺可采用传统工艺与现代工艺相结合，简易设备与现代设备相结合，可操作性强，规模可大可小，工艺简单，生产成本低，经济效益显著。
[0017]3、本发明工艺对提取溶菌酶、凝集素和干扰素的废液和废渣，采取加热变性、脱盐、干燥处理制成优质的动物饲料添加剂，有效解决了废料的排放问题。做到了绿色环保。
`[0018]本发明通过以下附图和实施例作进一步详细阐述。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1.在pFBDM中组装-Ly-Lectin-1FN多基因表达盒策略的示意图。
[0020]图2.pFBDM-Ly-Lectin-1FN重组病毒的构建和扩增策略和在家蚕中的表达纯化。
【具体实施方式】
[0021]实验材料:
[0022]限制性内切酶、连接酶、RNA酶、IPTG、X-Gal, SDS、TEMED、丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺为Promega公司产品；PCR试剂盒、大肠杆菌培养基LB、昆虫细胞培养基Sf900I1、胎牛血清、CELLFECTIN Reagent等化学试剂购自GIBCO BRL公司；MultiBac表达系统以及杆状病毒供体质粒pFBDM(Berger I, Fitzgerald DJ, Richmond TJ (2004) Baculovirus expressionsystem for heterologous multiprotein complexes.Nat Biotechnol22:1583 - 1587.do1: 10.1038/nbtl036)由瑞士分子生物和生物物理研究所(Institute for MolecularBiology and Biophysics, ETH Ziirichj Switzerland) Timothy J.Richmond 教授惠赠；杆状病毒供体质粒pFastBac购自GIBCO BRL公司；大肠杆菌DH5 α、经改造的大肠杆菌 DHlOMultiBacCr/AcMNPV (Zhang, J.，Li, G.，Chenj H.，Li, X.，Lvj Μ.，Chen, K.，&Yao，Q.(2010).Molecular cloning and expression of key gene encoding hypotheticalDNA polymerase from B.mori parvo-like virus.Genet Mol Biol,33(4), 739-744.)>家香品种 306 (Zhou, Y., Chen, H., Li, X., Wang, Y., Chen, K., Zhang, S.,...&Lee, M.Y.(2011).Production of recombinant human DNA polymerase delta in a Bombyx moribioreactor.PloS one, 6 (7), e22224.)由江苏大学生命科学研究院保存
[0023]说明:以下实施例中未作具体说明的实验操作方法均参照《分子克隆实验指南》(Sambrook等编著，科学出版社，1992年版)、试剂盒说明书、及产品说明书进行。
[0024]实施例一:重组供体质粒的构建
[0025]化学合成用于PCR扩增3种基因的引物，在引物序列N端引入BamHI酶切位点，在C端引入XbaI酶切位点，其引物序列设计如下:
[0026]EaClys:F:5，-AGCTACGGATCCGGATGGATGGCAAGCGGCGGCC-3’ (SEQ ID.1)
[0027]R:5，-AGCTACTCTAGATCACCAGGCCTCAGGTCCAGGG-3’ (SEQ ID.2)
[0028]EaAgl:F:5，-AGCTACGGATCCTTATGGCGGACCAGCTTTATCT-3，(SEQ ID.3)
[0029]R:5，-AGCTACTCTAGATTATTTCCTCTGGAAGAAGCCA-3’ (SEQ ID.4)
[0030]EaIfn:F:5’ -AGCTACGGATCCACATGTTTTCTGAGCAGGCTGC-3’ (SEQ ID.5)
[0031]R:5，-AGCTACTCTAGATCAGGGGCCCAGCCCCAGGCC-3’ (SEQ ID.6)
[0032]应用以上引物，以赤点石斑鱼溶菌酶、凝集素和干扰素cDNA为模板进行PCR反应，扩增出的各亚基片段进行1%琼脂糖凝胶电泳，切割下含目的片段的凝胶，用QIAGEN GelExtraction试剂盒回收扩增出的DNA片段；用BamHI和XbaI对扩增出的DNA片段分别进行双酶切，同时，对供体质粒PFBDM也进行BamHI和XbaI双酶切，酶切反应产物分别用试剂盒再纯化一次，将酶切后纯化的PCR产物和供体质粒pFBDM用连接试剂盒进行连接反应，14°C下过夜；将连接产物于大肠杆菌DH5ci感受态细胞中进行转化反应，反应混合物涂于含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基平板上，37°C倒置培养过夜；挑选LB平板上的单个菌落，经LB液体培养基培养，抽提质粒DNA ;对质粒DNA用BamHI和XbaI进行双酶切鉴定，筛选出已插入正确亚基的重组供体质粒。具体各亚基插入pFBDM的顺序和策略按图1所描述的方法进行。赤点石斑鱼溶菌酶、凝集素和干扰素cDNA分别被嵌入到MCSl的BamHI和XbaI位点之间，含有溶菌酶的表达盒片段(含倍增单元M，能够在下一次的基因插入时被反复使用)经AvrII和PmeI双酶切之后被装载到已插入了凝集素基因的pFBDM — Agl的BstZ17I和SpeI酶切位点(位于倍增单元M)，SpeI酶切后产生的黏性末端与AvrII (黏性末端)配对连接，而酶切后的BstZ17I与PmeI平头连接。采用相同的`策略，通过将含有溶菌酶和凝集素的表达盒嵌入到含有干扰素的倍增单元(M)之中，从而构建pFBDM-Ly-Lectin-1FN，且每一个基因都拥有各自的多角体启动子。
[0033]实施例二:含多基因重组家蚕杆状病毒的制备
[0034]重组病毒的制备如图2所描述。实施例一中所构建的pFBDM[Ly-Lectin_IFN]的重组质粒转化到含有AcMNPV Bacmid (具有miniF复制子、卡那霉素抗性基因、IacZ基因、min1-attachment Tn7 位点)和 Helper plasmid 等兀件的的 Ε.coli DHlOMultiBacCre 细胞之中。通过供体质粒pFBDM上Tn7兀件转座到AcMNPV Bacmid上的min1-attachment Tn7靶位点从而获得重组的Bacmid。之后经过蓝白斑筛选而抽提得到的重组Bacmid DNA，再将其转染到Sf-9细胞中进行重组病毒的构建和扩增。[0035]实施例三:三基因组合重组病毒在家蚕中的表达
[0036]将实施例二所制备的三基因组合的重组家蚕杆状病毒pFBDM[Ly-Lectin-1FN]接种五龄起蚕第二天的家蚕(306品种)，每条蚕接种1.0XlO5PFU,即5μ I接种母液中含2X107PFU/ml，共接种大约300头蚕，收集4 一 5天发病后的家蚕整体匀浆。
[0037]实施例四:重组多蛋白复合物的浓缩纯化
[0038]收集实施例三中表达多蛋白复合物的匀浆，用专用裂解缓冲液稀释，经超声波裂解、高速离心后取上清，经过透析和分子筛凝胶柱进行进一步纯化，将层析的洗脱液在冻干机上冻干，获得高纯度的目的产物。SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度在95%以上，平均每条蚕可获得约I克纯化后的多蛋白复合物。
[0039]本发明利用家蚕生物反应器所制备的赤点石斑鱼溶菌酶、凝集素和干扰素蛋白复合物在家蚕体内得到高效地表达，制备的三联复合蛋白复合物在家蚕体内的翻译后修饰好，具有很高的生物活性。
[0040]实施例五:养殖实验
[0041]2012-2013年，广东湛江和惠州的实验见表1:
[0042]表1.广东湛江、广东饶平石斑鱼近岸网箱养殖实验结果(2012-2013年)
[0043]
【权利要求】
1.一种石斑鱼仔鱼三联复合免疫增强剂，其特征在于是应用家蚕生物反应器制备的溶菌酶、凝集素、干扰素三联复合免疫增强剂。
2.如权利要求1所述的石斑鱼仔鱼三联复合免疫增强剂，其特征在于通过下述方法制备:将赤点石斑鱼溶菌酶、凝集素和干扰素的基因构建到多顺反子载体PFBDM上，获得重组供体质粒pFBDM-Ly-Agl-1FN，在经过改造的大肠杆菌DHlOMultiBacCr/AcMNPV中和家蚕AcMNPV-Bacmid杆状病毒DNA于Tn7转座子上发生转座，通过蓝白斑筛选出带有正确亚基的克隆，随后在Sf-9细胞中制备该3种基因组合的重组病毒，用获得的重组病毒感染宿主昆虫家蚕，在宿主昆虫家蚕体内表达并包装成多蛋白复合物的溶菌酶、凝集素、干扰素经分离纯化后获得。
3.一种制备权利要求1所述石斑鱼仔鱼三联复合免疫增强剂的方法，其特征在于:将赤点石斑鱼溶菌酶、凝集素和干扰素的基因构建到多顺反子载体PFBDM上，获得重组供体质粒pFBDM-Ly-Agl-1FN，在经过改造的大肠杆菌DHlOMultiBacCr/AcMNPV中和家蚕AcMNPV-Bacmid杆状病毒DNA于Tn7转座子上发生转座，通过蓝白斑筛选出带有正确亚基的克隆，随后在Sf-9细胞中制备该3种基因组合的重组病毒，用获得的重组病毒感染宿主昆虫家蚕，在宿主昆虫家蚕体内表达并包装成多蛋白复合物的溶菌酶、凝集素、干扰素经分离纯化后获得三联复合免疫增强剂。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于:所述的分离纯化是指收集含表达了溶菌酶、凝集素和干扰素多蛋白复合物的家蚕幼虫的体液或整体匀浆，在裂解缓冲液存在下经超声波裂解，4°C下进行高速离心，收集的上清经过透析和分子筛层析柱分离纯化，获得到纯化后 的产物。
【文档编号】A23K1/16GK103768587SQ201410032278
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】麦维军, 刘鹏, 黄芳, 陈慧卿, 周亚竟, 陈克平, 陈焰 申请人:江苏大学