提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法，是以棉花黄化苗茎尖分生组织为受体，通过对茎尖顶端分生组织进行“十”字形或“米”字形、0.6～1.0mm深度的划伤，再用农杆菌介导法将目的基因导入棉花，获得转基因植株。本发明方法具有转化效率高、重复性好的优点，实验证实，利用本发明所述的转化方法棉花平均转化率比改进前的平均转化率提高了30%，对棉花的遗传改良具有重要价值。
【专利说明】提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提闻外源基因转化率的方法，尤其涉及一种提闻棉花黄化幼苗莖尖分生组织外源基因转化率的方法；属植物基因工程领域。
【背景技术】
[0002]自 1987 年 Umbeck 等(Umbeck et al.Bio/Technology, 1987，5:263-266)通过农杆菌介导法成功获得珂字棉转基因植株后，农杆菌介导法逐渐成为国际上最普遍的转化手段之一，并取得了很大进展(Wu et al, 2005, Plant Breeding, 124(2):142-146 ；Guo etal.Biologia Plantarum.2007, 51(2): 242-248)。到目前为止，发表有关棉花遗传转化的文章也为数不多。主要原因是进行转基因后棉花愈伤组织一般比较难以再生，棉花体细胞胚胎发生和植株再生的组织培养时间较长。从已有的报道来看，利用最适宜的基因型棉花品种进行遗传转化也需要 8 ~10 个月(Umbeck et al, Bio/Technology, 1987, 5:263-266)。此外，长时间离体培养获得的再生植株往往存在比较严重的遗传变异。一些学者试图利用基因枪直接转化棉花茎尖细胞，但转化效率极低(McCabe et al.Bio/Technology, 1993，11:596-598; Zapata et al.Theor.Appl.Genet., 1999, 98:252-256);还有一些学者利用基因枪轰击棉花细胞悬浮细胞系(Fine et al.Plant Cell Rep.1990, 8:586-589 ；Rajasekaranet al.Plant Cell R印.2000，19:539-545)，但建立棉花细胞悬浮系受基因型限制。珂字棉312(Coker312G)、珂字棉201 (Coker201)目前发展成为众多实验室棉花转基因的模式品种，但是珂字棉312和珂字棉201都是美国生产上过时的棉花品种，所获得的转基因棉花材料通常要经过杂交选育和系统选育才能在生产上应用，费时费力。因此，建立适宜的棉花遗传转化技术仍然是棉花基因工程研究的重要基础。
[0003]植株再生困难、基因型依赖性强、转化周期长及效率低是目前制约棉花遗传转化的主要因素。实验室选用黄化小苗的茎尖为受体进行遗传转化，避免了植株再生过程，克服了基因型限制建立了一个新的棉花`遗传转化体系(吕素莲等，高技术通讯，2004，11:20-25 )。但由于影响棉花黄化小苗茎尖转化体系的因素较多，在实际应用中存在转化率不稳定、重复性差的缺点，故提高棉花黄化小苗茎尖转化体系的转化率稳定性、重复性是急需解决的问题。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是进一步提高利用棉花黄化幼苗茎尖分生组织进行遗传转化的效率和重复性，提供一种有效提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法。
[0005]本发明所述提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法，步骤如下:
[0006]a)棉花黄化幼苗的培养，获得转基因受体植株；
[0007]棉花种子经硫酸脱绒后，用70%乙醇浸泡0.5~1.5min、0.1%的升汞浸泡10~15min,然后用无菌水洗涤3~5遍；消毒后种子放入铺有三层滤纸的无菌瓶中，加入适量无菌水，于25~28°C温箱中暗处萌发；2~3天后当下胚轴长到I~2cm后转入pH5.8~6.0的CoM固体培养基中，置暗处在25~28°C、相对湿度40~60%条件下生长至株高为8~IOcm的黄化幼苗，用于茎尖转化；
[0008]其中，上述CoM固体培养基是指在CoM培养液中添加了质量百分比为6%的琼脂而制得的培养基；CoM培养液是指用蒸馏水配制的含表1所述溶质的培养液。
[0009]表1、CoM培养液的溶质成分
[0010]
【权利要求】
1.一种提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法，步骤如下: a)棉花种子灭菌后于培养箱中暗处萌发，当下胚轴长到I~2cm后转入CoM固体培养基中，置暗处生长至株高为8~IOcm的黄化幼苗，用于茎尖转化； b)去掉黄化幼苗的种皮和一片子叶裸露出茎尖分生组织，然后划伤茎尖顶端； c)用脱脂棉球蘸吸浸染液，并将其放置在划伤后的黄化幼苗茎尖顶端部位，在负压条件下实施浸染； d)将浸染后的黄化幼苗于25~28°C，暗培养3±0.5天，然后光培养2~3天； e)将培养后黄花幼苗移栽入花盆，在温度25~28°C、湿度40~60%条件下培养，至生长出2~3片真叶； f)用脱脂棉球蘸吸选择剂，并将其放置在已长出2~3片真叶的转化苗茎尖顶端部位，实施抗性筛选，获得抗性植株； 其特征在于: 所述划伤茎尖的方法是:对茎尖顶端的分生组织作“十”字形或“米”字形划伤，并控制划伤伤口的深度为0.6~1.0mm ; 所述实施浸染的方法是:在真空负压为0.05~0.06MPa条件下，用吸有浸染液的脱脂棉球置于划伤后的黄化幼苗茎尖顶端部位，在温度25~28°C、空气相对湿度40~60%的条件下浸染10~15min ;其中，所述浸染液组成是:在CoM培养液基础上添加了 100~200mg/L的乙酰丁香酮和质量百分比浓度为0.01~0.02%的表面活性剂Silwet-L77，以及含有重组外源基因的菌体浓度为0D_=0.6`~0.8的农杆菌，所述浸染液pH为5.8~6.0 ; 所述选择剂为除草剂，所述实施抗性筛选的方法是:在日温25~28°C、夜温20~22°C、相对湿度40~60%条件下，用吸有选择剂的脱脂棉球置于转化苗茎尖顶端部位12~24h，10~15d后观察植株芽尖顶端分生组织的存活情况选出抗性植株，转基因植株茎端生长点保持绿色，生长良好，非转化植株生长点发黑死亡。
2.根据权利要求1所述提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法，其特征在于:所述划伤伤口的深度为0.6~0.8_。
3.根据权利要求1所述提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法，其特征在于:所述浸染时间10~12min。
4.根据权利要求1所述提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法，其特征在于:所述除草剂是氯磺隆。
5.根据权利要求4所述提高棉花黄化幼苗茎尖分生组织外源基因转化率的方法，其特征在于:所述氯磺隆浓度是20~40mg/L。
【文档编号】A01H5/00GK103820489SQ201410111544
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】张可炜, 陈修贵, 张举仁 申请人:山东大学