专利名称：棉花sos2类蛋白质及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物信息学和分子生物学领域，具体涉及ー种具有抗(耐)盐碱作用的棉花S0S2类蛋白质及其编码基因和应用。
背景技术：
土壤盐碱化现象在我国沿海省份棉区(江苏沿海、山东和浙江等)和新疆棉区分布广泛。土壌中盐浓度的升高，将明显抑制棉花幼苗的正常生长，从而导致棉花的死亡和生理性减产[1’2]。因此，土壤盐害已经成为严重影响棉花植物生长发育的主要非生物胁迫因子之一。通过常规选育和转基因技术提高棉花抗(耐)盐碱能力是利用盐碱地最快捷、最经济和最有效的措施[3’4]。因此，掲示棉花抗(耐)盐的分子机理并克隆与盐胁迫相关的重要功能基因对于提高棉花的抗(耐)盐性、稳定和扩大棉花生产具有重要的战略意义。在植物抗(耐)盐碱基因克隆方面，已克隆的抗(耐)盐基因按功能主要体现在以下3个方面參与植物细胞的“离子/滲透”调节途径；抗氧化防御途径和激素调节类途径。离子/渗透调节途径已经克隆和应用的基因有AtNHXl，BADH, AtSOSl等，这些基因在转基因植株上均表现出一定的抗(耐)性[5’6’7’8]。S0S2首先从拟南芥中克隆，在质膜的钠氢离子通道逆向运输过程中受S0S3的调控，发挥自我蛋白磷酸化功能，并与S0S3结成蛋白复合体，共同调控下游SOSl蛋白的逆向运输功能，从而增强植物对盐离子的抗(耐)性对S0S2的功能研究表明S0S2基因C末端的FISL结构域是发挥蛋白磷酸化功能必不可少的，S0S2的突变与功能缺失均可能导致植物对盐的敏感，而且，过表达S0S2基因能够增强植株的抗(耐)盐性[12’13’14]。对S0S2基因的功能结构域研究表明，228位Ser对于该基因发挥自我磷酸化功能是必需的，该位点突变后，会造成磷酸化功能的降低，同吋，S0S2的活力也受SCABP8的影响[15’16]。这些研究表明S0S2基因是參与植物质膜抗(耐)盐途径必不可少的ー个重要蛋白磷酸化基因。目前，S0S2基因的同源基因已在油菜、玉米、蕃茄等植物中被克隆[17’18’19]，棉花做为我国盐碱地改良及栽培的先鋒作物，其S0S2基因的序列特征及表达模式一直未见报道。
发明内容
现有的研究表明S0S2基因是參与植物质膜抗(耐)盐途径必不可少的ー个重要蛋白磷酸化基因，而目前，S0S2基因的同源基因已在油菜、玉米、蕃茄等植物中被克隆[17’18’19]，棉花做为我国盐碱地改良及栽培的先鋒作物，其S0S2基因的序列特征及表达模式一直未见报道。因此本发明的目的在于提供棉花盐胁迫途径中的S0S2类蛋白质及其编码基因，进ー步可提供所述的棉花S0S2类蛋白质及其编码基因在棉花抗/耐盐碱性中的应用。本发明采用的技术方案是发明概述本发明提供的棉花S0S2类蛋白质，名称为GhS0S2，包括两个剪切体GhS0S2a和GhS0S2b,来源于陆地棉(Gossypium hirsutum L.),是具备下述氨基酸序列之一的蛋白质
I)由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列表组成的蛋白质；2) SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中经过ー个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有增强植物抗/耐盐碱性的蛋白质；3)由SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列表组成的蛋白质；4) SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列中经过ー个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有增强植物抗/耐盐碱性的蛋白质。其中SEQ ID No. 2由445个氨基酸组成，SEQ ID No. 4由421个氨基酸组成。本发明还提供了上述的棉花S0S2类蛋白质的编码基因。作为优选方案，根据本发明所述的棉花S0S2类蛋白质的编码基因，其是下述核苷 酸序列之一的cDNA基因I)序列表中SEQ ID No. I所示的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No. 2蛋白质序列的多核苷酸；3)序列表中SEQ ID No. 3所示的DNA序列；4)编码序列表中SEQ ID No. 4蛋白质序列的多核苷酸。其中，SEQ ID No. I所示的核苷酸序列全长为1832bp，包括ー个1338bp长的开放阅读框(ORF)，该ORF编码如SEQ ID No. 2所示的445个氨基酸，这个为较长片段，因此命名为GhS0S2a ；SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列全长为1633bp，包括ー个1263bp长的开放阅读框(ORF)，该ORF编码如SEQ ID No. 4所示的421个氨基酸，与前面的序列比较少了 72bp，这个片段命名为GhS0S2b。本发明还提供上述的棉花S0S2类蛋白质在培育抗/耐盐碱性棉花中的应用。本发明还提供上述的棉花S0S2类蛋白质的编码基因在培育抗/耐盐碱性棉花中的应用。发明详述发明人经过筛选棉花EST数据库，共找到8条和AtS0S2具有高度同源性的ESTs序列。这些EST序列经过整合分析得到一条长1833bp的共有序列。将该整合序列送入GenBank数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)中进行比对,结果表明该序列包含ー个长1332bp的开放阅读框(范围在186 1518bp)，由此推导的氨基酸序列与AtS0S2具有高度的同源性，因此将其命名为GhS0S2。为从陆地棉栽培品种中棉所51中获得GhS0S2的序列，通过对共有序列的分析，在开放阅读框两侧翼设计了ー对特异引物((PI CGTTGAATAACGATGAGGAA和P2 AAAAGGGTCAGCAAGTCAAT)。以盐诱导3天的根茎混合cDNA为模板扩增该序列并进行测序。结果表明，扩增得到的片段全长1633bp，包括ー个1263bp长的开放阅读框(ORF)，该ORF编码421个氨基酸。但与NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/棉花EST数据库中拼接获得的S0S2基因序列少72bp，暗示棉花S0S2基因存在2种不同结构的剪切体，因此将这个较短的片段命名为GhS0S2b。为了证明GhS0S2基因转录中确实存在另外ー种剪切体，再分别以非盐胁迫下的根、茎、叶混合总cDNA为模板扩增该基因并测序，结果获得一个片段长度为1832bp的片段，包括ー个1338bp长的开放阅读框，该ORF编码445个氨基酸，这个为较长片段，因此命名为GhS0S2a。
为研究GhS0S2a和GhS0S2b这两个剪切体在剪切方式上的差异，分别在序列存在差异的两端设计对应的基因组引物，命名为Dl和D2 (D1 GTCGAACCTCCGGCTATCTT ；D2 CACCCTTACTGTGACAATGAGC)，经PCR扩增，得到一条约2150bp的目的条带。经测序分析，GhS0S2b相比GhS0S2a缺少了第4个外显子，从而导致GhS0S2b缺少72bp (编码24个氨基酸)，但后面的编码序列和推测的氨基酸序列与GhS0S2a相一致。GhS0S2a基因的第3、第
4、第5外显子的剪切序列与对应的基因组DNA序列见图I。为了分析GhS0S2与不同物种同源基因之间的进化关系，用GhS0S2a的氨基酸序列捜索GenBank数据库，结果查到一系列同源性高达60%以上的同源基因。结果发现，这些蛋白质在进化上非常保守，大体上被为2个亚组，玉米和水稻中的S0S2基因属于单子叶植物亚组，而拟南芥、棉花、油菜属于双子叶植物亚组，他们的同源性基本上都在68%以上，如图2所示。在这些蛋白质的保守结构域中，均含有蛋白激酶特有的结构域，包括ATP结合位点和蛋白激酶的激活位点；其次还含有S0S2特有的NAF结构域(含有FISL基序)，该基序在盐胁迫信号传导途径中參与S0S3蛋白复合体的形成(如图3所示)。图2和图3·中GhS0S2a和GhS0S2b为本发明的2个选择性剪切体，PeCBL_PK29为来自杨树的同源基因(ACN76476. I)，AtS0S2为来自拟南芥的同源基因(NP 198391. I)，0sCBP24为来自水稻的同源基因(ACD76985. I)，ZmCBL为来自玉米的同源基因(ACN28426. I)。为了研究GhS0S2a和GhS0S2b在棉花生长发育中的作用，特别是在盐胁迫与非盐胁迫下的表达模式，发明人采用实时定量荧光RT-PCR的方法检测该基因在不同器官和纤维中的表达情况。选择中棉所51生长2周的植株，分别提取未经盐胁迫，0. 3% NaCUO. 5% NaCl,0. 7% NaCl和0. 9% NaCl胁迫3天的根茎、叶组织提取总RNA。以此为模板合成cDNA第一链，进而作为PCR扩增的模板。结果如图4所示，在所有样品中均能够检测到GhS0S2a的表达，在不同样品中的表达量有明显差异。其中，在叶片中的表达量最高，其次是根和茎部。在盐胁迫条件下，随着浓度的增高，GhS0S2a的表达量均有不同程度的增高，但不同组织中增高的幅度并不一致，其中在根部的表达量增强有3倍，而叶片的表达量仅增强约2倍。表明GhS0S2a參与盐胁迫的表达调控。但GhS0S2b基因在非盐胁迫情况下检测不到该基因的表达，在有盐胁迫的情况下，即可检测到该基因的表达。随着盐浓度的增高，在根部和叶部的表达量也快速增高；其中，在0. 7%和0. 9%的盐胁迫诱导条件下达到最高值，分别比同样条件下GhS0S2a的表达量高5倍和4倍。这个结果表明，在棉花GhSOS诱导的抗(耐)盐代谢途径中，可能主要是GhS0S2b參与该路径并发挥调控作用。基因的选择性剪接(可变剪接,alternative splicing)是指从ー个mRNA前体通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点)产生不同的mRNA剪接异构体的过程。选择性剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多祥性的重要机制，是导致生物基因和蛋白质数量较大差异的重要原因[23’24]。在已完成基因组测序的人类、鼠、拟南芥和水稻等物种中，均发现大量基因存在着选择性剪接[25’26’27]。据初步测算，仅在人类中，大约有35% 72%的基因具有选择性剪接特性。基因的选择性拼接主要涉及信号传导、基因表达调节和转录因子等生物学过程，如水稻的OsIM基因，拟南芥的异分支酸合成酶AtICS基因等[28’29]。本发明的研究从棉花盐胁迫条件下克隆的GhS0S2基因存在GhS0S2a和GhS0S2b两个可选择的剪接体，在转录结构上，GhS0S2b比GhS0S2a少了ー个外显子4，该外显子共编码24氨基酸(72bp)，并没有造成GhS0S2b蛋白质移码突变，功能结构域分析表明，缺失的这段氨基酸并不包含在“蛋白激酶ATP结合位点”、“蛋白激酶激活位点”和“FISL基序”上，结构上推测GhS0S2b蛋白同样可以执行蛋白激酶的功能(拟南芥中的同源基因AtS0S2并不存在可变剪切体)，然而GhS0S2b基因的表达确又受到盐胁迫的严格诱导。因此，GhS0S2b的形成过程、剪接调控机制及參与的生物学功能有待进ー步研究。本发明采用荧光定量RT-PCR的方法来分析GhS0S2a和GhS0S2b剪接体受盐胁迫的表达情況，由于荧光定量PCR对内參和特异引物的要求比较严格[3°’31]，所以，在GhS0S2a荧光定量扩增的引物设计中，采用一端引物锚定于GhS0S2b剪接体的第4个外显子区域(GhS0S2b转录后无该段序列)，另一端引物铺定于2个到接体的共有序列中；而在GhS0S2b荧光定量扩增的引物中，采用一端引物锚定于共同序列中，另一端引物分别跨GhS0S2a剪接体的第4和第5外显子(见图I所示序列)。采用这样引物设计策略，避免了 2个剪接体之间的非特异扩增，对于实验中评估这2个剪接体受盐胁迫及调控的影响至关重要。GhS0S2b在受到盐胁迫的条件下，表达量迅速升高，在0. 7%的NaCl胁迫下，根茎中的表达 量是GhS0S2a的5倍之多，表明在盐胁迫条件下，可能是GhS0S2b主要參与棉花的抗(耐)盐调控途径。因此，采用进ー步的分子生物学策略阐明GhS0S2b与GhS0S3互作关系将掲示棉花SOS抗盐代谢途径的这一重要调控机理。本发明具备的优势有发明人通过生物信息学，结合EST拼接分析等相关分子生物学方法从抗盐胁迫的陆地棉品种中棉所51中克隆了 S0S2棉花同源基因，并掲示了该基因在棉花体内存在2种可变的剪接体，明确了在盐诱导条件下，棉花体内主要是以GhS0S2b的方式进行剪切，为进一歩阐明该基因參与的代谢途径和如何利用该基因提供了一定的科学依据。
图I是本发明GhS0S2a和GhS0S2b剪切差异部分的外显子区域及基因组序列，图中所示序列中的灰色序列为外显子区域。根据附图I可以看出，GhS0S2a在剪切过程中具有外显子4,而GhS0S2b无此序列。图2是本发明GhS0S2与其他物种的S0S2的系统进化树分析，GhS0S2a和GhS0S2b为2个选择性剪切体，PeCBL-PK29来自杨树的同源基因(ACN76476. I)，AtS0S2为来自拟南芥的同源基因(NP 198391. I)，0sCBP24为来自水稻的同源基因(ACD76985. I)，ZmCBL为来自玉米的同源基因(ACN28426. I)。图3是本发明棉花GhS0S2a基因与其他S0S2同源基因的氨基酸序列同源性比较，GhS0S2a和GhS0S2b为2个选择性剪切体，PeCBL_PK29来自杨树的同源基因(ACN76476. I)，AtS0S2为来自拟南芥的同源基因(NP 198391. 1)，0sCBP24为来自水稻的同源基因(ACD76985. I)，ZmCBL 为来自玉米的同源基因(ACN28426. I)。图4是本发明GhS0S2的2个选择性剪切体在不同浓度盐胁迫诱导处理下的表达特征柱形图。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例I棉花S0S2类蛋白质(GhS0S2a和GhS0S2b)及其编码基因的获得I.材料与方法I. I植物材料和生长条件陆地棉栽培品种中棉所51 (Gossypium hirsutum)由中国农业科学院棉花研究所提供，发明人实验室种植保存。本试验所用棉花为陆地棉(Gossypium hirsutum L.),耐盐品种中棉所51。种子经硫酸脱绒后，先以4% KMn04浸泡IOmin消毒，并用蒸馏水洗浄，然后在培养箱中{佳牙，并进打幼苗培养。2周后，分别用蒸懼水、0. 3%、0. 5%、0. 7%、0. 9%的NaCl溶液一次性浇透水进行处理，盐胁迫72小时后，分别取盐胁迫处理和正常条件下棉花15株，用铝箔包好，迅速放入液氮速冻保存。棉花种植在气候箱内(28°C/20°C，14小时光照)。I. 2实验方法1.2.1提取棉花基因组DNA和总RNA采用CTAB法从棉花的幼嫩叶片中提取基因组DNAm。棉花根、茎、叶组织总RNA的提取采用多酚、多糖类植物RNA提取试剂盒(北京Bioteck生物技术有限公司)。I. 2. 2棉花GhS0S2a和GhS0S2b剪接体的克隆按照已有方法搜索棉花ESTs数据库[21],通过tBlastn共选出8条序列(GenBank登录号为 DW482158. 1，DW482159. 1，ES827878. 1，DW515086. 1，EX169815. 1，DR456033. 1，EV486794. 1，DW508139. I)。这些EST片段的整合序列包含有一个开放阅读框(ORF)，其氨基酸序列和拟南芥的AtS0S2蛋白具有高度的同源性。根据ORF设计两个特异引物(Pl :CGITGAATAACGATGAGGAA和 P2 AAAAGGGTCAGCAAGTCAAT)。分别以未经盐胁迫处理和以 0. 7%氯化钠胁迫处理3天的棉花根茎混合的cDNA为模板进行PCR扩增，条件为预变性94°C，5min ；94°C 45s, 57°C 45s, 68°C 2min ;30 个常规 PCR 程序，68°C延伸 lOmin，再将 PCR 产物加A，切胶回收，最后连接至pGEM-T载体送上海生エ生物技术工程服务有限公司测序。cDNA第一链的合成采用MBI公司的反转录试剂盒，基因的PCR扩增采用的酶为KOD FX(T0Y0B0,上海，东洋纺生物科技有限公司)。利用盐胁迫0. 7%氯化钠处理3天的茎根混合cDNA为模板获得GhS0S2b基因的编码区序列如下I AATTTACTGC CAAAGCTAAC GCGAAGCCCT CGTCGAACCT CCGGCTATCT TCATTTTCTT61 TTTCATTTGA AGGCGAMAG TTTTCTGGGC GATAAGTTTT TCGCCCGAAT ATTCGTCTM121 TTATTGGCAA CTTCTCTTCT AGGCGTTTCT TTTTCTTTTT GGTATGAGAT GATCGTTGM181 TMCGATGAG GAAGAAMCA GCAACAGTAG GAAAGTATGA GGTTGGACGA ACAATTGGGC241 AAGGAACATT CGCCAAAGTT MGTTTGCGC GGAATTCAGT CAGTGGAGAG AGCGTGGCCT301 TGMAGTTTT GCCCAAAGCC ACCATTCTTA AGCACAGAAT GGTTGATCAG ATTMAAGAG361 AGATATCGAT MTGAAGATT GTTAGACATC CTAACATAGT TAGGTTGCAT GAGGTTCACT421 GTGGAAGACT TCCTGAGAAT GAATGTAGGC GATACTTTCA ACAGCTTATT GACGCTGTTG
权利要求
1.ー种棉花S0S2类蛋白质，具备下述氨基酸序列之一 1)由SEQID No. 2所不的氣基酸序列表组成的蛋白质； 2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中经过ー个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有增强植物抗/耐盐碱性的蛋白质； 3)由SEQID No. 4所不的氣基酸序列表组成的蛋白质； 4)SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列中经过ー个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有增强植物抗/耐盐碱性的蛋白质。
2.权利要求I所述的棉花S0S2类蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于其是下述核苷酸序列之一的cDNA基因 1)序列表中SEQID No. I所示的DNA序列； 2)编码序列表中SEQID No. 2蛋白质序列的多核苷酸； 3)序列表中SEQID No. 3所示的DNA序列； 4)编码序列表中SEQID No. 4蛋白质序列的多核苷酸。
4.权利要求I所述的棉花S0S2类蛋白质在培育抗/耐盐碱性棉花中的应用。
5.权利要求3所述的棉花S0S2类蛋白质的编码基因在培育抗/耐盐碱性棉花中的应用。
全文摘要
本发明公开一种棉花SOS2类蛋白质及其编码基因和应用，该棉花SOS2类蛋白质是由序列表中序列2或4的氨基酸序列组成的蛋白质，其编码基因具有序列表中序列1或3所示的核苷酸序列。SOS2基因是参与植物质膜抗(耐)盐途径必不可少的一个重要蛋白磷酸化基因，本发明填补了棉花做为我国盐碱地改良及栽培的先锋作物，其SOS2基因的序列特征及表达模式却一直未见报道的空白，为提高棉花的抗/耐盐碱性提供了可能。
文档编号C12N15/29GK102838665SQ201110166208
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者李付振 申请人:浙江省农业科学院