一种防治农作物土传病害的生防菌肥及其生产工艺和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种防治农作物土传病害的生防菌肥及其生产工艺和应用，该生防菌肥是通过培养获得蜡状芽孢杆菌、绿针假单胞菌发酵液，并将这两种发酵液按一定比例接入熟化的畜禽粪便与秸秆中堆肥发酵，形成了防治农作物土传灰霉菌病害的生防菌肥。本发明的生防菌肥可防治蔬菜灰霉菌病，提高蔬菜产量，并且安全无污染，易于大规模生产。
【专利说明】一种防治农作物土传病害的生防菌肥及其生产工艺和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物有机肥【技术领域】，具体而言，涉及一种防治农作物土传病害的生防菌肥及其生产工艺和应用。
[0002]
【背景技术】
[0003]农作物土传病害每年给农业生产造成巨大的经济损失，因此病害防治工作成为当前农业科学的当务之急。目前，农作物土传病害的防治方法主要是以利用抗病品系植株以及化学防治为主。一方面，使用抗病品系的植株可以达到经济有效的防治效果，但要想获得一株理想的抗病品系并不是一件容易的事，而且抗病品种往往在其推广几年之后便出现抗性丧失甚至生长不良等情况；另一方面，化学防治由于其防效较高、速度快、抗菌谱较广等优点而在农作物土传病害防治中起到非常重要的作用，然而它又受到三个因素的限制:一是目前高效低毒的化学杀菌药剂品种较少，大多数仍为毒性较大的药剂，以毒杀菌并不是长久之计；二是环境因素对防治效果的影响也不小，当环境条件适合病原菌侵入和传播时，其防治效果往往不能令人满意；三是化学药剂容易造成环境污染，危机人类日常生活。作为病害防治方法之一的生物防治，在某些条件下具有良好的防治效果，并己成为目前病害防治研究和开发的热点。
[0004]近年来，国内外广泛利用有益微生物及其代谢产物来抑制病原菌的生存活动，使这一防治策略得以迅速发展，拮抗菌在农作物土传病害生物防治这一领域起到了非常重要的作用，包括细菌、放线菌、酵母菌甚至霉菌，而人们在应用中仍主要以拮抗细菌为主。具有拮抗能力的细菌无论是在自然发生的生物防治现象中还是人为应用于病害防治的试验中，都具有非常明显的防治功效，其主要优势在于:(I)细菌的种类和数量繁多，在植物的根际和土壤表面及内层都大量存在；(2)拮抗细菌对病原菌的抑制作用方式较多，包括竞争营养、寄生、分泌杀菌物质、诱导植物产生抗性等方式，从而对病原菌产生不利影响；(3)具有惊人的繁殖速度，一般细菌的生长繁殖速度要快于真菌、放线菌等；(4)细菌可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作；(5)某些细菌不仅能防治病害，还具有促进植株生长等功效，从而增加产量。
[0005] 生物菌肥，即指一类含有一定数量的活的有益微生物，并通过微生物的生物活性来调节植物生长速度、促进农作物产量增加、改善植物根际或表面微生态环境的特定制品。目前国内外上常用的生物菌肥包括固氮菌肥、解磷/钾菌肥、菌根菌肥、生防菌肥等。生防菌肥顾名思义，菌肥中的微生物多为生防拮抗菌，这些拮抗菌可以通过其生长代谢过程或其代谢产物来抑制植物病原菌，甚至杀死病原菌，从而为农作物的生长提供了保障，某些已被确认均有拮抗作用的微生物亦可促进生物菌肥的肥效。
[0006]灰霉菌属半知菌亚门葡萄孢属。灰霉菌分生孢子梗细长，灰黑色，大小为(960~1200) ymX (16~22) μ m，不规则树状分支，分支顶端细胞膨大成球形，其上着生许多小梗，小梗上着生分生孢子，形似葡萄穗状。分生孢子单胞无色，椭圆形或卵圆形，大小为(8~14) μ mX (6~9) μ m,孢子集生呈灰色。菌核褐色，形状不规则，大小为(2~4)mmX (I~3)mm[l]。灰霉菌能够侵染200多种植物，属真菌病害，多种植物的花、果、叶、茎均可发病。该菌核在土壤或病残体上越冬越夏，病菌耐低温，在7-20°C大量产生孢子，苗期棚内温度15_23°C。弱光，相对湿度在90%以上或幼苗表面有水膜时易发病。花期最易感病，借气流，灌溉及农事操作从伤口、衰老器官侵入。
[0007]目前国内对灰霉病防治的农药主要为化学产品，主要有:乙霉威、腐霉利、异菌脲、菌核净、嘧霉胺、井R霉素等。鉴于化学药剂存在环境污染问题，因此研究适宜的防治灰霉病的新型生防菌肥，这对于农业生产的长远发展显得尤为重要。
【发明内容】
[0008]本发明的第一个目的在于提供一种防治农作物土传病害的生防菌肥，该菌肥中的拮抗菌对灰霉菌有良好抑制效果，可防治蔬菜灰霉菌病，提高蔬菜产量。另外，本发明的另一个目的在于提供一种上述生防菌肥的生产工艺和应用。
[0009]本发明的目的是这样实现的:
一种防治农作物土传病害的生防菌肥，其中该生防菌肥按每克计，含有大于1.0X108个生防菌，所述的生防菌由蜡状芽孢杆菌和绿针假单胞菌组成。 [0010]一种上述生防菌肥的生产工艺，包括如下步骤:
(1)将蜡状芽孢杆菌、绿针假单胞菌分别接种到培养液中进行液态发酵，得到活菌数大于1.0X109个/ml的蜡状芽 孢杆菌发酵液、绿针假单胞菌发酵液，备用；
(2)将新鲜的畜禽粪便与秸杆颗粒按1:2-3的重量比均匀混合，堆肥10-20天至粪便腐熟、秸杆腐烂，灭菌处理，形成固体发酵基质；
(3)将步骤(1)所述的蜡状芽孢杆菌发酵液、绿针假单胞菌发酵液，依次按照20-40L/吨、50-100L/吨的接种量接种到步骤(2)所述的固体发酵基质中进行固体发酵，发酵温度为25-32°C，发酵过程中翻堆3-5次，发酵5-8天，得生防菌肥。
[0011]本发明上述生防菌肥的生产工艺，其中步骤(1)中:所述的培养液的组成为:蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0 ;所述蜡状芽孢杆菌的液态发酵的条件为:通气搅拌下于28°C _32°C发酵30-60h ;所述绿针假单胞菌的液态发酵的条件为:通气搅拌下于250C -30°C发酵20-36h ;步骤(2)中所述的秸杆颗粒为玉米杆、麦杆、谷杆、油菜杆和稻杆中的一种或两种以上经粉碎后的颗粒。
[0012]本发明人在筛选抑制灰霉菌生长的拮抗菌时意外的发现，含有蜡状芽孢杆菌CICC21687与绿针假单胞菌CICC20676的复合菌液对灰霉菌具有极其显著的抑制作用。基于此发现，本发明人通过培养获得蜡状芽孢杆菌、绿针假单胞菌的发酵液，并将这两种发酵液按一定比例接入熟化的畜禽粪便与秸杆中堆肥发酵，形成了防治农作物土传灰霉菌病害的生防菌肥。本发明制成的生防菌肥，其中每克肥料中所含有效拮抗菌数(cfu)大于1.0X IO8个，有机质含量(以干基计)大于25%，水分含量低于30%，其它指标符合生物有机肥国家行业标准。因此，本发明提供了上述生防菌肥的应用，即:上述的生防菌肥在防治农作物土传病害中的应用，所述的土传病害为灰霉菌病。
[0013]本发明的生物菌肥作为一种生物产品，其与化学肥料相比具有如下几个特点:(I)不破坏土壤结构、不污染环境，且对人畜无害；(2)改善土壤肥力，肥效持久；(3)能防治土传病害，促进农作物的生长，增加产量，改善农产品的品质；(4)生物菌肥原料为畜禽粪便和秸杆等废弃物，易于获取，变废为宝，而且配套生产设备的要求不高，成本较低。
[0014]【具体实施方式】
[0015]以下是本发明的的具体实施例，需要说明的是，本发明各实施例所用的蜡状芽孢杆菌为蜡状芽孢杆菌cereus) CICC21687，所用的绿针假单胞菌为绿针假单胞菌iPsoudomorms chlororaphis) CICC20676,均购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection, CICC,位于北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼)。
[0016]实施例1不同菌株对灰霉菌的抑制试验研究
PDA培养基的配制:称取去皮马铃薯200g，切块煮沸30min，然后用纱布过滤取汁，再加20.0g葡萄糖及20.0g琼脂，溶化后补足水到1000mL,分装到10个150mL的三角瓶，121 °C灭菌30min,即可。
[0017]在无菌条件下，取20mL经灭菌后冷却至45°C左右的PDA培养基加入培养皿，制成PDA平板。放置24h后，在平板中央接种病原菌灰霉菌菌丝，22°C培养4d。在已长好的灰霉菌平皿中，用直径I cm打孔器在菌落边缘切取菌落圆块，备用。
[0018]分别取按照实施例2工艺制备的蜡状芽孢杆菌发酵液、绿针假单胞菌发酵液，用无菌水稀释发酵液至菌体浓度为IXio5个/ml—1的稀释液，其中菌体计数法采用的是显微直接计数法。向放置I天的PDA平板中加入100 μ L的拮抗菌发酵稀释液(复合菌液中蜡状芽孢杆菌与绿针假单胞菌的数量比为1:10)，用涂布器涂匀，每个处理4个重复。将切取的灰霉菌菌块接种在涂好的平板中央，有菌丝的一面接触平板。25°C培养4d后，用直尺“十字交叉法”测量灰霉菌菌落直径(单位为cm)，结果取其平均值。另取实施例1步骤(3)、(4)制备的蜡状芽孢杆菌发酵液、绿针假单胞菌发酵液，4000r / min离心30min，上清液经过
0.22 μ L膜 过滤，滤除菌体，得无菌发酵上清液，作为对照。按如下公式计算抑菌率:抑菌率
=(D对照_D处理)/ D对照X 100%。
[0019]根据表1的试验结果可以看出，绿针假单胞菌或蜡状芽孢杆菌单独对灰霉菌的抑制效果不显著。然而，与单菌使用相比，这两种菌株组成的复合菌液却表现出了对灰霉菌极为显著的抑制效果0° < 0.01)。
[0020]表1不同菌株对灰霉菌的抑制效果比较
【权利要求】
1.一种防治农作物土传病害的生防菌肥，其特征在于，该生防菌肥按每克计，含有大于1.0X IO8个生防菌，所述的生防菌由蜡状芽孢杆菌和绿针假单胞菌组成。
2.一种根据权利要求1所述的生防菌肥的生产工艺，其特征在于包括如下步骤: (1)将蜡状芽孢杆菌、绿针假单胞菌分别接种到培养液中进行液态发酵，得到活菌数大于1.0X109个/ml的蜡状芽孢杆菌发酵液、绿针假单胞菌发酵液，备用； (2)将新鲜的畜禽粪便与秸杆颗粒按1:2-3的重量比均匀混合，堆肥10-20天至粪便腐熟、秸杆腐烂，灭菌处理，形成固体发酵基质； (3)将步骤(1)所述的蜡状芽孢杆菌发酵液、绿针假单胞菌发酵液，依次按照20-40L/吨、50-100L/吨的接种量接种到步骤(2)所述的固体发酵基质中进行固体发酵，发酵温度为25-32°C，发酵过程中翻堆3-5次，发酵5-8天，得生防菌肥。
3.根据权利要求1所述的生防菌肥的生产工艺，其特征在于，步骤(1)中所述的培养液的组成为:蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L, NaCl 5g/L，ρΗ7.0。
4.根据权利要求1所述的生防菌肥的生产工艺，其特征在于，步骤(1)中所述蜡状芽孢杆菌的液态发酵的条件为:通气搅拌下于28°C _32°C发酵30-60h。
5.根据权利要求1所述的生防菌肥的生产工艺，其特征在于，步骤(1)中所述绿针假单胞菌的液态发酵的条件为:通气搅拌下于25°C _30°C发酵20-36h。
6.根据权利要求 1所述的生防菌肥的生产工艺，其特征在于，步骤(2)中所述的秸杆颗粒为玉米杆、麦杆、谷杆、油菜杆和稻杆中的一种或两种以上经粉碎后的颗粒。
7.权利要求1所述的生防菌肥在防治农作物土传病害中的应用，所述的土传病害为灰霉菌病。
【文档编号】C05F3/00GK103951483SQ201410207914
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月18日 优先权日:2014年5月18日
【发明者】段占娥 申请人:段占娥