一种利用超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的方法，其特征在于包括如下步骤：①种子消毒；②种子萌发培养；③大豆子叶(含子叶节)外植体制备；④超声处理；⑤外植体培养；⑥测定步骤⑤外植体的异黄酮合成途径中关键酶基因相对表达量、PAL活性和异黄酮合成积累量。本发明提供的方法操作简单、省时、成本低，同时为研究大豆组织中异黄酮含量与其对病源微生物防御反应的关系提供一种新途径，也为揭示大豆遗传转化机理研究奠定基础。
【专利说明】一种利用超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业生物工程领域中一种利用超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的 方法。
【背景技术】
[0002] 异黄酮是豆类植物体内形成的一类次生代谢产物，它主要参与组织和病源微生 物的互作及防御反应（谢明杰等，2004 ;孙君明等，2005 ;Subramanian等.2005 ;马君兰 等，2007;王海涛等，2009)。大豆富含异黄酮，其种子中异黄酮主要由12种化合物单体组 成：9 种异黄酮糖苷（Daidzin、Glycitin、Genistin、Malonyldaidzin、Malonylglycitiru Malonylgenistin、Acetyldaidzin、Acetylglycitin 和 Acetylgenistin)和 3 种配糖体 (Daidzein、Glycitein 和 Genistein)(孙君明等，1995)。其中，Genistin(染料木苷）和 Daidzin(黄豆苷）这2种组分占大豆异黄酮总量的95%以上（张永忠和李文滨，2005)。由 于大豆异黄酮各单体的最大吸收波长接近，且吸光度又具有加和性，所以，大豆异黄酮的总 含量可用紫外分光光度计法来测定。
[0003] 异黄酮类物质是由苯丙烷类代谢途径的一个分支所合成，其合成前体是苯丙氨 酸和丙二酰辅酶A，经苯丙氨酸裂解酶（PAL)，香豆酸辅酶A连接酶（4CL)，查尔酮合成酶 (CHS)，查尔酮异构酶（CHI)，异黄酮合成酶（IFS)等酶催化，形成不同的异黄酮类物质。苯 丙氨酸解氨酶PAL是联系植物初级代谢和次级代谢的关键酶，是苯丙烷类代谢途径的第一 个关键酶，而异黄酮合酶（IFS)是进入异黄酮合成途径的第一个酶，是形成异黄酮类物质 的关键代谢酶。苯丙氨酸解氨酶（PAL)、查尔酮合成酶（CHS)、异黄酮合成酶（IFS)都是异 黄酮合成途径的关键酶（马君兰等，2007)，能够在转录和转录后水平对异黄酮的生物合成 进行调控。
[0004] 在异黄酮合成途径及其调控机理的研究方面，为了抑制异黄酮的生物合成，目前 多采用外加代谢抑制剂阻断法（Srinivasan等，1996 ;李贺勤等，2009)。这些抑制剂包括 蛋白激酶抑制剂K252a、磷脂酶A2抑制剂花生四烯酸ETYA，线粒体ATPase合成的抑制剂 二环己基碳二亚胺（DCCD)、寡霉素（Oligomycin)和解稱联剂羰基氰对三氟基苯腙（FCCP) 等（刘文奇和郭泽建，2003)。李贺勤等（2009)用苯丙氨酸解氨酶的专性抑制剂α-氨氧 乙酸（AOA)显著抑制了野葛细胞悬浮物的异黄酮合成。王敬文等（1981)用放线菌素 D和 环己酰胺等PAL抑制剂处理甘薯后几个小时内就检测到了 PAL酶活性的降低及下游代谢产 物合成积累的受阻。这种利用化学物质抑制异黄酮生物合成的方法虽然有效，但费用较高， 且对植物细胞的其他代谢过程具有潜在的不利影响。也有报道采用RNA干扰技术来降低 大豆异黄酮含量，以研究大豆组织异黄酮含量与其对Phytophthora sojae菌敏感性的关系 (Subramanian等，2005 ;Graham等，2007)，但这种方法需要复杂的基因克隆、载体构建和遗 传转化等过程。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是为了克服上述技术的缺陷，提供一种利用超声处理抑制大豆异 黄酮生物合成的方法，为研究大豆组织异黄酮含量与其对病源微生物防御反应的关系提供 一种新途径，也为揭示大豆遗传转化机理研究奠定基础。本发明的原理是通过对大豆组织 进行超声处理，干扰大豆异黄酮生物合成途径中关键酶基因的表达并降低其酶活性，最终 减少大豆异黄酮类物质的合成和积累。
[0006] 本发明提供了一种利用超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的方法，其特征在于包 括如下步骤：
[0007] ①种子的消毒：取健康饱满大豆种子，放入含有100ml30%次氯酸钠和4ml浓盐酸 的密闭容器内，利用反应生成的氯气消毒24?36h ;
[0008] ②种子的萌发培养：将步骤①中的种子接种到B5培养基中进行为期5?6天的 25°C、16/8h光暗周期的培养；
[0009] ③大豆子叶外植体制备：将步骤②中的种子在无菌条件下去掉种皮、切掉幼叶和 上胚轴，保留〇. 2?0. 3cm的下胚轴；
[0010] ④超声处理：将步骤③中的外植体放到含有75ml营养液的150ml容量的三角瓶 中，并置于超声器中，在40KHZ、20°C?25°C条件下超声处理3min ;
[0011] ⑤外植体培养：将步骤④中超声处理过的外植体用灭菌滤纸吸掉多余水分，摆放 到B5培养基上，25 °C下暗培养1?3天；
[0012] ⑥分别测定步骤⑤外植体的异黄酮合成途径中关键酶基因相对表达量、PAL活性 和异黄酮合成积累量。
[0013] 所述一种利用超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的方法，其特征在于步骤④中所 述营养液为1/10XB5培养基，pH5. 8,121°C高压灭菌15min。
[0014] 上述步骤②中的B5培养基由以下成分组成：KN03、CaCl2 · 2H20、MgS04 · 7H20、 (NH4) 2S04、NaH2PO4 · H20、KI、H3BO3'MnSO4 · 4H20、ZnS04 · 7H20、Na2MoO2 · 2H20、CuSO4 · 5H20、 CoCl2 · 6H20、Na2EDTA、FeS04 · 7!120、￥81、￥86、肌醇、烟酸、蔗糖、琼脂和水。
[0015] 以上成分在所述B5培养基中的浓度分别为：KN032500mg L' CaCl2 · 2H20150mg L'MgS04.7H20250mg L'(NH4)2S04134mg L'NaH2P04 .H2OlSOmg L'KI0.75mg L'H3B033mg L'MnSO4 · 4H2010mg L'ZnSO4 · 7H202mg L'Na2MoO2 · 2H200. 25mg L'CuSO4 · 5H200. 025mg L' CoCl2 · 6H200. 025mg L' Na2EDTA37. 3mg L' FeSO4 · 7H2027. 8mg L'肌醇 IOOmg L' VBllOmg L'VB61mg L'烟酸 Img L'鹿糖 30g L'琼脂 5mg I71，用水定容 1L。
[0016] 上述B5培养基的pH为5· 8。
[0017] 利用本发明对大豆子叶（含子叶节）外植体进行超声处理，一是干扰了大豆异黄 酮生物合成途径中关键酶基因的表达并降低其酶活性。测定超声处理后5h的大豆子叶中 苯丙氨酸解氨酶（PAL)基因的相对表达量，较对照降低了 32. 58%，异黄酮合成酶（IFSl)基 因的相对表达量降低了 35. 26%，异黄酮合成酶（IFS2)基因的相对表达量降低了 56. 48%， 查尔酮合成酶（CHS)基因的相对表达量降低了 21.80%。测定超声处理后24小时的大豆子 叶（含子叶节）中的PAL活性，较对照降低约34%。二是减少大豆异黄酮类物质的合成和 积累。超声处理后24?72h内，超声处理的大豆子叶（含子叶节）外植体中异黄酮含量较 对照降低了 17.02%?24. 32%。因此。利用本发明超声处理可以明显降低大豆异黄酮生 物合成途径中关键酶基因的相对表达量，降低PAL酶活性，最终达到减少大豆异黄酮的合 成和积累。
[0018] 本发明提供的方法，①操作简单、省时、成本低。利用本发明抑制大豆异黄酮生物 合成主要需要一台超声器，从萌发种子到获得异黄酮生物合成受到抑制的外植体，整个过 程不到一周时间就能完成；而利用RNA干扰技术来降低大豆异黄酮含量则需要进行基因 克隆、载体构建、遗传转化等，程序复杂，最少需2个月才能完成；采用外加代谢抑制剂阻断 法，其抑制剂的价格昂贵，每mg最便宜也得几十元。②本发明抑制大豆异黄酮生物合成方 法，为研究大豆组织中异黄酮含量与其对病源微生物防御反应的关系提供一种新途径，也 为揭示大豆遗传转化机理研究奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是超声处理后暗培养0h、24h、30h对苯丙氨酸解氨酶（PAL)活性影响效果图
[0020] 图2是超声处理后暗培养5h对PAL、CHS、IFS异黄酮合成途径中关键酶基因相对 表达量的影响效果图
[0021] 图3超声处理后暗培养24h、48h、72h对异黄酮合成积累量的影响效果图
[0022] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不以任何方式限制本发明的范 围。
【具体实施方式】
[0023] 实施例中所用超声器为KH2200B型，昆山禾创超声仪器有限公司生产；大豆品种 冀黄13,来自于河北省农林科学院粮油作物研究所；所使用的培养基配方如无特殊说明， 均为常规培养基；所用试剂如无特殊说明，均购自上海生工生物工程技术有限公司。
[0024] 实施例1 :超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的方法
[0025] 1.种子消毒：取健康饱满的冀黄13大豆种子110粒，放入含有100ml30%次氯酸 钠和4mll2N浓盐酸的密闭容器内，利用反应生成的氯气消毒36小时；
[0026] 2.种子的萌发培养：将步骤1中的种子接种到B5培养基中进行6天25°C、16/8h 光暗周期的培养；
[0027] 3.大豆子叶（含子叶节）外植体制备：将步骤2中萌发好的种子，无菌条件下去 掉种皮，切掉幼叶和上胚轴，保留〇. 2cm长的下胚轴；
[0028] 4.超声处理：将100个外植体放到含有75ml营养液的150ml容量的三角瓶中，并 置于超声器中，在40KHZ、20°C?25°C条件下超声处理3min，以不进行超声处理的为对照。 营养液成分为1/10XB5培养基，pH5. 8,121°C高压灭菌15min ;
[0029] 5.外植体培养：将步骤4中经过超声处理的外植体，用灭菌滤纸吸掉多余水分，摆 放到B5培养基上，25 °C下暗培养3天；
[0030] 6.分别测定步骤5外植体的异黄酮合成途径中关键酶基因相对表达量、PAL活性 和异黄酮合成积累量：将步骤5中经培养的大豆外植体，①于超声处理后0h、24h、30h分别 取样，用紫外分光光度计法测定超声处理对PAL活性的影响；②于超声处理后5h取样，液氮 速冻，提取RNA，用荧光定量PCR方法测定PAL、CHS、IFS等异黄酮合成途径中关键酶基因相 对表达量；③于超声处理后24h，48h，72h分别取样，置于75°C烘箱中36h至烘干到恒重，在 研钵中研磨成极细粉末状，进行异黄酮的提取和异黄酮含量的测定。
[0031] 实施例2 :苯丙氨酸解氨酶PAL活性测定一紫外分光光度计法
[0032] I. PAL酶液的提取方法：取Ig实施例1步骤6①中的大豆外植体材料，加入5ml酶 提取液（〇. IM硼酸-硼砂缓冲液pH8. 7, ImM EDTA，20mM β -巯基乙醇），进行冰浴研磨至匀 浆状，匀浆首先经三层纱布过滤，再经l〇〇〇〇g，4°C离心30min，收集上清，即为PAL酶液。用 Thermo NanoDrop2000分光光度计（Thermo Scientific, USA)测定该酶液的蛋白浓度。
[0033] 2. PAL酶活性的测定方法：每一待测样品制备3组测定管，3组对照管。测定管内 含4. 9ml0. OlM硼酸-硼砂缓冲液，pH8. 7,0. IM苯丙氨酸，0. Iml酶液。对照管内除没有添 加0. IM的苯丙氨酸外，其他成分与测定管相同。反应条件为37°C保温lh。水浴煮沸10分 钟终止反应。最后用UV-3200型紫外分光光度计（上海美普达仪器有限公司）测定290纳 米波长的吸光值0D。用测定管的OD减去对照管的0D，得到该酶液在Ih内反应的实际活性。 以每克蛋白每小时在290nm处吸光度变化为酶活性单位。
[0034] 超声处理后的苯丙氨酸解氨酶PAL活性结果见图1。处理后Oh时超声处理组的 PAL活性为 19.83U g-1protein tf1，而对照组为 29.39U g-1protein tf1;处理后 24h 时超声处 理组的 PAL 活性为 15. 33U g4protein tf1，而对照组为 23. 88U g4protein tf1 ;处理后 30h 时超声处理组的PAL活性为11.82U g4protein tf1，而对照组为17.88U g4protein tf1。超 声处理组的PAL活性平均较对照组降低约34%。实施例3 :PAL、CHS、IFS等异黄酮合成途 径中关键酶基因相对表达量的测定一荧光定量PCR法
[0035] I. RNA提取方法
[0036] (1)将实施例1步骤6②中液氮速冻保存的材料在研钵中用液氮研磨至粉末状；
[0037] (2) 50?IOOmg材料中加入Iml TRNzol总RNA提取试剂（天根生化科技（北京） 有限公司），混匀，室温静置5min，使核蛋白充分解离；
[0038] (3)加入0· 2ml氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并室温静置2?3min ;
[0039] (4)于 4°C 12000g 离心 15min ;
[0040] (5)取上清0· 5ml，加入0· 5ml异丙醇，轻轻混勻，室温静置IOmin ;
[0041] (6)4°C 12000g 离心 10min，弃上清；
[0042] (7)向沉淀中加入1Π 11751%乙醇,轻轻混勻，于4°C 7500g离心5min，弃上清；
[0043] (8)将RNA样品凉干（不要彻底干燥），加入适量DEPC水溶解。
[0044] 2. RNA的消化处理方法
[0045] (1)在微量离心管中配制下列反应液：包括RNA20y g，10XDNase I Buffer5y 1， DNase I(RNase-free，5U/y 1)2μ 1，RNase Inhibitor(40U/y 1)0·5μ 1，DEPC H20 定容至 50μ I ；
[0046] (2) 37 °C 反应 20 ?30 分钟；
[0047] (3)加入 2. 5 μ 10. 5M EDTA，混匀，80°C下 2min，使 DNase I 失活；
[0048] (4)用 RNase Free dH20 定容 100 μ 1 ;
[0049] (5)加入10 μ I 3Μ醋酸钠，250 μ 1冷乙醇，冰上放置IOmin ;
[0050] (6) 4°C，13, 500rpml5min 离心，弃上清；
[0051] (7)加入70%冷乙醇洗净，4°C，13, 500rpm5min离心，弃上清；
[0052] (8)沉淀干燥，用适量的RNase Free dH20溶解后，进行Agarose电泳确认是否除 去基因组 DNA。用 Thermo NanoDrop2000 分光光度计（Thermo Scientific, USA)测定 RNA 浓 度。
[0053] 3. RNA反转录与cDNA第一链合成方法
[0054] 以总RNA为模板，合成cDNA第一链。反应体系为50μ1，包括：2yg RNA，5XRT bufferlOy Ι,ΙΟμΜ Oligo (dT) 2 μ I, IOmM dNTP4 μ I, RNase Inhibitor (40U/μ 1) 2 μ 1, MMLV 逆转录酶 2 μ I，RNase Free dH20 定容 50 μ 1。反转录条件为 50°C，60min, 85°C，5min。
[0055] 4. Real-time PCR方法：根据厂商的仪器使用说明，在 7500/7500Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems，CA，USA)上，运用相对比较方法（AACt)进行了突 光实时定量 PCR。反应体系为 20μ1，包括 2XRealStar Power SYBR Mixture(GenStar Biosolutions Co. , Ltd. Beijing, China)10 μ 1,10 μ M primersO. 5 μ I each, I μ I cDNA 及 8 μ I RNase Free dH20。循环体系为ABI公司默认的程序，即50°C 2min ;95°C IOmin ;40循 环的95°C15sec和60°Clmin。所用引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。各引物 序列如下：
[0056] PAL forward:5, -ATTATGGATTCAAGGGAGCT-3,（序列为 SEQ ID NO. 1)，
[0057] PAL reverse:5, -AATGAGGAAAGTGGAGGACA-3,（序列为 SEQ ID NO. 2);
[0058] IFSlforward:5,-GGCCACCTTCACCTCTTAAA-3'（序列为 SEQ ID NO. 3)，
[0059] IFSlreverse:5,-AGCCGAAGGAGAGAGAGAATA-3'（序列为 SEQ ID NO. 4);
[0060] IFS2forward:5,-CCCTTCATAGGACACCTTCATC-3'（序列为 SEQ ID NO. 5)，
[0061] IFS2reverse:5,-CATGGAGCCAAAGTAGAGAGAG-3'（序列为 SEQ ID NO. 6);
[0062] CHS forward:5,-GGTCAACCCAAGTCCAAGAT-3,（序列为 SEQ ID NO. 7)，
[0063] CHS reverse:5, -GGCGAAGGCCTAATAGTTTAGT-3,（序列为 SEQ ID NO. 8);
[0064] Actin forward:5,-GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT-3,（序列为 SEQ ID NO. 9)，
[0065] Actin reverse:5, -GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA-3,（序列为 SEQ ID NO. 10)。
[0066] Actin作为内参基因。
[0067] 超声处理后的PAL、CHS、IFS基因相对表达量见图2。超声处理降低了大豆子叶 (含子叶节）外植体中异黄酮合成途径中关键酶基因的相对表达量。与未进行超声处理的 对照相比，PAL基因的相对表达量降低了 32. 58%，IFSl基因的相对表达量降低了 35. 26%， IFS2基因的相对表达量降低了 56. 48%，CHS基因的相对表达量降低了 21. 80%。
[0068] 实施例4 :异黄酮生物合成积累量的测定一紫外分光光度计法
[0069] 1.异黄酮的提取方法
[0070] 精确称取30mg实施例1步骤6③中获得的粉末状物，放入7ml离心管中，再加入 5ml80%乙醇，在40KHZ，50°C条件下超声萃取30分钟。用45μπι滤膜过滤，定容10ml。每 个样品重复制备3次。
[0071] 2.异黄酮的测定方法
[0072] (1)标准曲线的绘制取2mg大豆异黄酮标准品（染料木苷genistin，纯度 98%，Sigma公司），用80%乙醇溶解并定容10ml，得到200 μ g πιΓ1标准品溶液。用该标 准品溶液配置浓度梯度为〇· 5、1· 0、2· 0、4· 0、6· 0、8· 0、10· 0、12· 0、14· 0μ g πιΓ1的标准溶 液。用UV-3200型紫外分光光度计（上海美普达仪器有限公司）测定这9个浓度的标准溶 液在260nm处的吸光值。以各标准液浓度为纵坐标，260nm吸光值为横坐标，绘制标准曲 线。染料木苷与吸光度呈良好线性关系，拟合方程为：Y = 7. 5973X，R2 = 0. 9991#。式中 Y为染料木苷浓度，单位为μ g πιΓ1，X为260nm波长吸光值。
[0073] (2)样品异黄酮含量测定将上述步骤1获得的异黄酮提取液稀释20倍后，用 UV-3200型紫外分光光度计（上海美普达仪器有限公司）测定其在260nm波长的吸光值。 将测得的吸光值代入标准曲线拟合方程，计算得到浓度，最后换算μ g mpDW。
[0074] 超声处理后大豆异黄酮含量结果见图3。超声处理降低了大豆子叶（含子叶节） 外植体中异黄酮的合成和积累。超声处理后24h，超声处理组的大豆子叶（含子叶节）外 植体中异黄酮含量为3. 61±0. 08yg Hig-1DW,较对照组（4. 77±0. 12)降低了 24. 32% ;超 声处理后48h，超声处理组的大豆子叶（含子叶节）外植体中异黄酮含量为4.85±0. IOyg mg_1DW，较对照组（5. 88±0. 17)降低了 17. 52% ;超声处理后72h，超声处理组的大豆子叶 (含子叶节）外植体中异黄酮含量为5. 51 ±0. 25 μ g Hig-1DW,较对照组（6. 64±0· 02)降低 了 17. 02%。
[0075] 本发明列举的实施例旨在更进一步地阐明超声处理在降低大豆异黄酮生物合成 途径中关键酶基因的表达并降低其酶活性，最终减少大豆异黄酮类次生代谢产物的合成和 积累等方面具有的显著效果，而不对本发明的范围构成任何限制。
【权利要求】
1. 一种利用超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的方法，其特征在于包括如下步骤： ① 种子的消毒：取健康饱满大豆种子，放入含有100ml30%次氯酸钠和4ml浓盐酸的密 闭容器内，利用反应生成的氯气消毒24?36h ; ② 种子的萌发培养：将步骤①中的种子接种到B5培养基中进行为期5?6天的25°C、 16/8h光暗周期的培养； ③ 大豆子叶外植体制备：将步骤②中的种子在无菌条件下去掉种皮、切掉幼叶和上胚 轴，保留〇. 2?0. 3cm的下胚轴； ④ 超声处理：将步骤③中的外植体放到含有75ml营养液的150ml容量的三角瓶中，并 置于超声器中，在40KHZ、20°C?25°C条件下超声处理3min ; ⑤ 外植体培养：将步骤④中超声处理过的外植体用灭菌滤纸吸掉多余水分，摆放到B5 培养基上，25 °C下暗培养1?3天； ⑥ 分别测定步骤⑤外植体中异黄酮合成途径中关键酶基因相对表达量、PAL活性和异 黄酮合成积累量。
2. 根据权利要求1所述的一种利用超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的方法，其特征 在于步骤④中所述营养液为1/10XB5培养基，pH5. 8,121°C高压灭菌15min。
【文档编号】A01H4/00GK104221855SQ201410358999
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】张艳敏, 张孟臣, 张红梅, 郭秀林, 刘子会, 李国良, 赵青松 申请人:河北省农林科学院遗传生理研究所, 河北省农林科学院粮油作物研究所