一个高产药用天然产物的硬紫草转LeEIL-1基因毛状根株系的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个能高产紫草药用天然产物(紫草宁及其衍生物)的硬紫草的转基因毛状根株系。该株系通过构建一个硬紫草乙烯信号传导途径中的关键转录因子基因(LeEIL-1)的植物过表达载体，然后将该载体转入发根农杆菌ATCC15834后，侵染硬紫草的无菌苗而获得。该转基因株系所产紫草宁及其衍生物的含量是直接用ATCC15834侵染硬紫草无菌苗所获得的毛状根株系的2.81倍。同时，该株系易于繁殖、生长迅速。本发明不仅可有效解决我国野外硬紫草资源日益短缺、人工栽培周期长、受气候及地理条件等因素制约等问题，并且可高效大量生产硬紫草药用天然产物。该高产株系将为利用硬紫草毛状根工厂化生产硬紫草药用天然产物提供材料支撑，具有广阔的开发应用前景。
【专利说明】一个高产药用天然产物的硬紫草转LeE I L-1基因毛状根株 系
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，涉及将携带目的基因的植物表达载体转入发根农 杆菌，然后再侵染硬紫草无菌苗而诱导出转基因的毛状根株系。
【背景技术】
[0002] 硬紫草（Lithospermum erythrorhizon sieb. et zucc)是我国一种重要的药用 植物，其根部可合成紫红色的萘醌类药用天然产物--紫草宁及其衍生物（以下简称紫草 宁），这类物质具有抗菌、消炎、活血等功效，而且还是一种珍贵的天然色素，可以广泛用于 食品、高级化妆品、日化产品与塑料制品的着色等 [η]。近年来国内外的研究还发现紫草 宁通过活化Caspase-3和抑制拓扑异构酶活性来诱导癌细胞凋亡，被认为是继喜树碱、紫 杉醇之后又一类极具潜力的天然抗菌消炎、抗肿瘤、抑制HIV病毒等多种药理活性的药物
[4-6] 〇
[0003] 在我国有新疆紫草、东北硬紫草、内蒙紫草、滇紫草、广西紫草等分布于相应地区。 近年来，随着东北长白山脉及内蒙古草原地带的对人为过度开发利用及放牧，以及自然生 态环境日渐恶化，作为重要紫草种类的硬紫草，其野生紫草资源日趋枯竭。
[0004] 随着现代生物技术的发展，采用生物工程学手段生产人类所需的紫草宁，成为一 种非常重要的替代手段。上世纪70年代，日本即已成功利用两阶段培养法，即在光照条件 下B5固体培养基上繁殖紫草细胞，然后在黑暗条件下利用M9液体生产培养基中培养紫草 细胞进行工业化生产紫草宁，紫草也从而成为世界上第一个采用细胞培养体系来商业化生 产药用天然产物的药用植物 [7]。但在实践过程中发现，用细胞生产紫草宁存在诱导愈伤细 胞困难、细胞易于老化褐化、紫草宁产量不高、产量不稳定、夏季难产或不产紫草宁等诸多 问题。
[0005] 发根农杆菌是在植物基因工程中广泛应用的一种侵染性很强的根瘤菌科农杆菌 属革兰氏阴性菌，其携带的Ri质粒能有效侵染绝大多数双子叶植物，少数单子叶植物以及 个别裸子植物，诱发植物产生形状如根系的发根即毛状根（hairy root)。由于发根农杆菌 转化的毛状根具有生长速度快、分支多，能够持续合成次生代谢产物，获得的次生代谢产物 量高且稳定、不需要添加外源植物激素等特点，因此可作为生产和研究植物次生代谢物质 的生物反应器；同时，由于发根农杆菌携带的Ri质粒能将外源基因整合到寄主染色体、其 诱导产生的毛状根易获得再生植株等优点，因此，建立特定植物的转基因毛状根体系，在定 向分子育种方面具有广泛应用前景。近年来利用发根农杆菌已转化大约160多种植物，在 40多种植物建立了毛状根培养体系，特别是一些药用植物建立了毛状根转基因体系，极大 地方便了药用天然产物生产及遗传育种研究。
[0006] 紫草宁的合成受到多种物理和化学因素的影响，如光、无机盐离子、植物激素（乙 烯和茉莉酸等）[8_1(1]。乙烯是一种能调控植物生长发育、抗逆境胁迫反应等多个方面的气态 类激素，通过改变乙烯浓度，或者改变植物乙烯信号传导途径中关键靶标基因的表达，可以 改变植物对天然产物的合成调控，如改变烟草ERF189及ERF163表达，可直接促进烟草生物 碱的合成[11];研究表明，乙烯同样参与紫草宁的合成调控[12]。
[0007] 紫草的 LeEIL-1 (L. erythrorhizon EIN3_like protein 1)基因编码 EIN3 转录因 子家族蛋白LeEIL-1。EIN3/EIL1是乙烯信号传导途径中的关键转录因子，在乙烯介导的植 物生长发育及代谢调控中起重要作用。紫草细胞从B5转入M9中后，LeEIL-Ι受诱导表达， 并且在紫草根部（紫草宁合成的特异性部位）高表达，推测该基因参与乙烯介导的对紫草 宁的合成调控 [13]。
[0008] 通过转基因技术将紫草本身的LeEIL-Ι基因转入紫草中过表达，改变紫草细胞中 内源乙烯对紫草宁的合成调控，从中筛选出高产药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株 系，在理论上是完全可行的。
[0009] 通过转基因技术获得高产药用天然产物的紫草毛状根株系，不仅在系统研究紫草 药用天然产物生物合成途径及其分子调控机制方面具有重要的理论意义，并在商业化生产 紫草药用天然产物方面具有非常重要的应用前景和价值。尽管目前国内外有利用毛状根为 材料对紫草宁合成调控进行的相关研究，但并无将紫草EIN3/EIL1家族蛋白的相关基因转 入发根农杆菌，诱导出能高效合成紫草药用天然产物的紫草转基因毛状根并藉此提高紫草 宁合成的相关报道。
【发明内容】
[0010] 本发明需要解决的问题是通过转基因技术获得一个高产药用天然产物的硬紫草 转基因毛状根株系，主要是通过将所选择的目的基因（硬紫草中编码EIN3转录因子家族蛋 白LeEIL-Ι的基因 LeEIL-Ι)转入发根农杆菌，然后侵染硬紫草无菌苗，诱导出含目的基因 的硬紫草毛状根，对获得的转基因毛状根扩大培养并进行分子鉴定和药用天然产物含量检 测。
[0011] 本发明的技术方案包括如下步骤：
[0012] (1)硬紫草无菌苗培养：选取饱满的硬紫草种子，清洗后置于4°C环境中培养，直 至种子发芽；挑取刚发芽的种子，用6%的次氯酸钠消毒后，无菌水洗干净；置于MS培养基 培养一定数量的紫草无菌苗。一个月后，当紫草无菌苗生长到一定高度后作为诱导毛状根 的外植体。
[0013] (2)转基因侵染菌液制备：高保真酶扩增目的基因 LeEIL-Ι，将获得的目的片段与 真核表达载体pBI121-eGFP(真核表达载体pBI121中插入增强型绿色荧光蛋白基因 eGFP 序列，代替了 PBI121中的标记基因 GUS，以方便后续转基因毛状根的检测验证）连接，将连 接产物用冻融法转化发根农杆菌ATCC15834感受态细胞；挑取阳性克隆，用YEB液体培养基 扩增至0D600 = 0. 5时，添加 AS (乙酰丁香酮），作为转基因侵染菌液。
[0014] (3)针刺茎节法诱导硬紫草转基因毛状根：用接种针蘸上述活化的具有侵染特性 的转基因菌液，用针尖穿刺紫草无菌苗的茎节处2-3次；将侵染的无菌苗转移到MS固体培 养基上于26°C黑暗培养。10-15天左右即可发现侵染部位出现白色突起，2天后在侵染部位 的白色突起长出绒毛状根系，然后长出一条或多条毛状根。
[0015] (4)硬紫草转基因毛状根的培养：剪取长度约1cm的毛状根，转入MS+500mg/L头 孢霉素的固体除菌培养基，再过一星期转入MS+250mg/L头孢霉素除菌培养基，直至除去残 留的发根农杆菌；将彻底除菌的毛状根转入B5固体培养基扩大培养；将固体扩大培养的毛 状根转入B5液体培养基扩大培养。
[0016] (5)转基因毛状根分子鉴定：分为分子鉴定和荧光鉴定2个部分。取一定数量毛 状根，PCR方法检测农杆菌Ri质粒中RolC基因，判断是否为毛状根，再检测绿色荧光蛋白， 验证是否是硬紫草转基因毛状根。
[0017] (6)紫草宁合成及测定：将鉴定的转基因紫草毛状根转入M9液体培养基，置于 26°C黑暗培养，一周后紫草宁含量即可达到很高浓度；用石油醚浸泡紫草毛状根及含有紫 草宁的M9液体，提取紫草宁，紫外分光光度计测定紫草宁含量，以相同生长条件下的野生 型紫草毛状根（只用不含外源基因的ATCC15834侵染而获得的硬紫草毛状根）为对照，计 算转基因毛状根中紫草宁含量变化。
[0018] 本发明与现有技术相比，其有益效果是：
[0019] 如前所述，野生紫草资源的日益匮乏及缺乏真正高效的人工合成紫草宁的培养体 系，已经成为紫草宁药用研究及商业化大量应用的一个制约因素。至今未见通过诱导出转 入LeEIL-Ι基因的毛状根，并藉此提高紫草宁合成产量的相关文献报道。本发明首次将一 个紫草EIN3/EIL1家族蛋白的关键转录因子基因 LeEIL-Ι转入植物表达载体，将该载体转 入发根农杆菌后再转入紫草无菌苗，诱导出紫草转基因毛状根；获得的硬紫草转基因毛状 根中紫草宁含量较野生型紫草毛状根大大提高。该方法可克服紫草愈伤细胞诱导、培养困 难，细胞易于老化褐化、紫草宁产量不高、产量不稳定、夏季难产或不产紫草宁等诸多问题； 解决了利用愈伤细胞进行遗传转化存在的周期长，转化效率偏低等问题，转基因毛状根诱 导和繁殖不受外界环境、季节和紫草花性等因素制约，大大提高紫草转基因效率；转入的 LeEIL-Ι基因有助于紫草乙烯信号传导机制及药用天然产物合成的分子调控机制研究，对 紫草功能基因鉴定和研究及分子育种具有重要指导意义，对其他转基因困难的木本植物提 供了可靠的借鉴方法；获得的转基因毛状根紫草宁高产株系具有广阔的开发应用前景和商 业价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1针刺茎节法诱导出的转LeEIL-Ι基因的硬紫草毛状根
[0021] 图2转基因毛状根在B5固体培养基培养
[0022] 图3转基因毛状根在B5液体培养基扩大培养
[0023] 图4转LeEIL-Ι基因硬紫草毛状根RolC基因检测
[0024] 图5转LeEIL-Ι基因硬紫草毛状根荧光检测
[0025] 图6转基因毛状根在M9液体培养基培养
[0026] 图7转基因毛状根紫草宁及其衍生物含量测定及比较
【具体实施方式】
[0027] 实施例1、转硬紫草LeEIL-Ι基因毛状根的诱导
[0028] (1)硬紫草无菌苗培养：选取饱满的硬紫草种子，无菌水清洗后置于4°C环境中黑 暗培养1-2个月，直至种子发芽；挑取刚发芽的种子，清水洗干净；用6 %的次氯酸钠浸泡 5min，再用无菌水洗几次；置于MS基本培养基，26°C _28°C光照培养，获得一定数量的紫草 无菌苗。一个月后，当紫草无菌苗生长到8-lOcm后，作为诱导毛状根的外植体。
[0029] (2)转基因侵染菌液制备：将市售的pBI121载体中的GUS基因片段用增强型绿色 荧光蛋白eGFP基因片段代替，改造成便于转基因检测的植物真核表达载体pBI121-eGFP ; 根据 GenBank 公布的紫草 LeEIL-1 序列（FJ890314)设计引物 LeEIL-l-〇E-F :5' -CTAGTCT AGAATGATGATGTTCGAGGAGATGGGGT-3; ；LeEIL-1-〇E-R ： 5; -CTAGTCTAGAAAACCAGATGGATTCGT CCTGCTTT-3'，高保真酶扩增目的片段；将获得的目的片段切胶回收，并与pBI121-eGFP载 体连接，构建pBI 121-LeEIL-l-eGFP质粒；将pBI 121-LeEIL-l-eGFP质粒用冻融法转化发根 农杆菌ATCC15834感受态细胞；挑取阳性克隆，转入YEB液体培养基，在26-28°C，180rpm的 摇床中扩增至0D600 = 0. 5时，添加200 μ L/L的AS，作为转基因侵染菌液。
[0030] (3)针刺茎节法诱导硬紫草转基因毛状根：用接种针蘸上述活化的具有侵染特性 的转基因菌液，用针尖穿刺紫草无菌苗的茎节处，针尖每浸蘸菌液一次，刺茎节处一下，每 株共穿刺2-3次；将侵染的无菌苗转移到MS固体培养基上于26°C黑暗培养。10-15天左右 即可发现侵染部位出现白色突起，2天后在侵染部位的白色突起长出绒毛状根系，然后长出 一条或多条毛状根（图1);以不含外源基因的野生型ATCC15834菌液按照上述相同方法， 诱导出紫草野生型毛状根，作为对照材料。
[0031] 实施例2、转硬紫草LeEIL-Ι基因毛状根的培养
[0032] (1)毛状根除菌培养：诱导出来的毛状根经过一星期的生长，剪取长度约1cm的毛 状根，转入MS+500mg/L头孢霉素的固体除菌培养基，再过一星期转入MS+250mg/L头孢霉 素，直至除去残留的发根农杆菌；将彻底除菌的毛状根转入B5固体培养基培养（图2);
[0033] (2)毛状根扩大培养：将固体扩大培养的毛状根转入B5液体培养基，lOOrpm的摇 床中光照扩大培养（图3)。
[0034] 实施例3、转硬紫草LeEIL-Ι基因毛状根的鉴定
[0035] 分为分子检测和荧光检测2个部分。取一定数量毛状根，CTAB法提取 毛状根 DNA 为模板，设计引物 rolc-F:5' -ACAAGCCACTTCTGTTTCCC-3' ；rolC-R: 5, -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3'，用PCR方法扩增，以硬紫草基因组DNA为对照，扩增产物测 序比对，检测转基因毛状根中农杆菌Ri质粒中RolC基因存在与否，随机选取的3个扩大培 养硬紫草毛状根株系，均检测到RolC基因的存在（图4)，说明获得的均为毛状根；同时上 述株系中长度约2-3_的毛状根，制作成切片，用激光共聚焦显微镜检测荧光，结果显示均 检测到荧光（图5)，表明所扩大培养的紫草毛状根均为转基因毛状根。
[0036] 实施例4、转硬紫草LeEIL-Ι基因毛状根紫草宁含量测定
[0037] (1)将验证为转入目的基因的转基因硬紫草毛状根及野生型毛状根转入M9液体 培养基，置于26°C、100rpm的摇床中黑暗培养，一周后紫草宁含量即可达到很高浓度（图 6)；
[0038] (2)用石油醚浸泡紫草毛状根及含有紫草宁的M9液体，提取紫草宁，紫外分光光 度计测定紫草宁含量，以野生型紫草毛状根为对照，计算转基因毛状根中紫草宁含量变化 (图7)。紫草宁含量总量包括紫草细胞或毛状根和分泌到M9培养基中的紫草宁含量总和。 具体方法如下：称取在M9培养体系中的毛状根，并取含有分泌的紫草宁的M9培养基，用石 油醚浸泡，反复提取紫草宁，直到提取液无色，合并提取液，紫外分光光度计测定0D520的 吸光值，由下列方程得到紫草宁含量：紫草宁含量（mg/gFW) = 41. 66X0D520X稀释倍数。
[0039] (3)紫草宁含量测定显示，所得到的这一个转LeEIL-1基因的硬紫草毛状根 在M9液体培养基中一周后紫草宁含量比相同生长条件下的野生型毛状根中的含量提 高2. 81倍，而且该株系具有生长速度快、繁殖容易的特点，适于商业化生产所用，命名为 LeEIL-l-line-001〇
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【权利要求】
1. 一个高产药用天然产物（紫草宁及其衍生物）的硬紫草转LeEIL-1基因毛状根株 系。
2. 权利要求1中所述的硬紫草转基因高产株系的商业化应用。
【文档编号】A01H5/06GK104195167SQ201410366238
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】杨永华, 戚金亮, 方荣俊, 赵胡, 赵华, 刘静, 朱煜, 吴凤瑶, 王小明, 陆桂华, 杨荣武 申请人:南京大学