一种马钱悬浮细胞培养的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种马钱悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增值、悬浮细胞的培养等步骤，本发明方法所制备的马钱悬浮细胞品质优良，增值率高，短期内可以获得大量的悬浮细胞，为马钱药用成分的开发和利用提供技术支持。
【专利说明】 一种马钱悬浮细胞培养的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培条件下马钱悬浮细胞的培养，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]马致，Strychnos nux~vomica L.,别名:番木鳘、苦实把豆儿等,马钱科,乔木,枝条幼时被微毛，老枝被毛脱落。叶片纸质，近圆形、宽椭圆形至卵形，性味苦，寒。有毒。分布于东南亚我国的福建、台湾、广东、广西、云南地区。兴奋健胃，消肿毒，凉血。主治四肢麻木，瘫痪，食欲不振，痞块，痈疮肿毒，咽喉肿痛。生于海拔600m以下的较炎热的半山坡凹地、山谷湿处或杂木林、树丛中。生深山老林中，喜热带湿润性气候，怕霜冻，而以石灰质壤土或微酸性粘壤土生长较好。种子极毒，含有生物碱，主要为番木鳖碱(士的宁)及马钱子碱，并含有微量的番木鳖次碱，伪番木鳖碱，伪马钱子碱，奴伐新碱，士屈新碱以及脂肪油，蛋白质，绿原酸等，性寒，味苦，有通络散结，消肿止痛之效。西医学上用种子提取物，作中枢神经兴奋剂，目前尚无马钱繁殖技术的研究报道。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供马钱悬浮细胞培养的快速繁殖方法，本发明方法所制备的马钱悬浮细胞品质优良，增值率高，短期内可以获得大量的悬浮细胞，为马钱药用成分的开发和利用提供技术支持。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
取马钱的叶片，在洗洁精中浸泡3min，流水冲洗为35min，超净工作台上过氧化氢处理Ilmin,无菌水冲洗5遍，消毒处理过的马钱叶片用强度为100_300mT的均勻磁场预处理30min，接入培养基配方为BL+KT 2mg/L+ZT2mg/l的培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，光照强度4001x，光照时间6h/d，温度24°C，诱导出来的愈伤组织放入培养基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L进行愈伤组织增值培养，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，PH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照时间10h/d，温度24°C，增值出来结构松散，颜色淡绿色的愈伤组织放入培养基MS+NAA0.1-0.2mg/L+ZTl-l.5mg/L+200-350mg/L麦芽提取物中进行悬浮细胞培养，附加蔗糖45g/L，pH5.8，光照25001x，光照时间12h/d，温度24°C，采用水平震荡培养，频率为120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培养液。
[0005]采用本发明制备的马钱悬浮细胞生长速度快，操作简单，能耗小，污染小。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
取马钱的叶片，在洗洁精中浸泡3min，流水冲洗为35min，超净工作台上过氧化氢处理Ilmin,无菌水冲洗5遍，消毒处理过的马钱叶片用强度为100_300mT的均勻磁场预处理30min，接入培养基配方为BL+KT2mg/L+ZT2mg/l的培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，光照强度4001x，光照时间6h/d，温度24°C，诱导出来的愈伤组织放入培养基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L进行愈伤组织增值培养，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照时间10h/d，温度24°C，增值出来结构松散，颜色淡绿色的愈伤组织放入培养基MS+NAA0.lmg/L+ZTlmg/L+200mg/L麦芽提取物中进行悬浮细胞培养，附加蔗糖45g/L，pH5.8，光照25001x，光照时间12h/d，温度24°C，采用水平震荡培养，频率为120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培养液，细胞增长率为67%。
[0008]实施例2
取马钱的叶片，在洗洁精中浸泡3min，流水冲洗为35min，超净工作台上过氧化氢处理Ilmin,无菌水冲洗5遍，消毒处理过的马钱叶片用强度为100_300mT的均勻磁场预处理30min，接入培养基配方为BL+KT2mg/L+ZT2mg/l的培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，光照强度4001x，光照时间6h/d，温度24°C，诱导出来的愈伤组织放入培养基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L进行愈伤组织增值培养，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照时间10h/d，温度24°C，增值出来结构松散，颜色淡绿色的愈伤组织放入培养基MS+NAA0.2mg/L+ZTl.5mg/L+350mg/L麦芽提取物中进行悬浮细胞培养，附加蔗糖45g/L，pH5.8，光照25001x，光照时间12h/d，温度24°C，采用水平震荡培养，频率为120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培养液，细胞增长率78%。
[0009]实施例3
取马钱的叶片，在洗洁精中浸泡3min，流水冲洗为35min，超净工作台上过氧化氢处理Ilmin,无菌水冲洗5遍，消毒处理过的马钱叶片用强度为100_300mT的均勻磁场预处理30min，接入培养基配方为BL+KT 2mg/L+ZT2mg/l的培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，光照强度4001x，光照时间6h/d，温度24°C，诱导出来的愈伤组织放入培养基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L进行愈伤组织增值培养，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照时间10h/d，温度24°C，增值出来结构松散，颜色淡绿色的愈伤组织放入培养基MS+NAA0.2mg/L+ZTlmg/L+300mg/L麦芽提取物中进行悬浮细胞培养，附加蔗糖45g/L，PH5.8，光照25001x，光照时间12h/d，温度24°C，采用水平震荡培养，频率为120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培养液，细胞增长率80%。
【权利要求】
1.本发明研究了一种马钱悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增值、悬浮细胞的培养等，主要步骤如下: (1)取马钱幼嫩的叶片，按照常规的消毒方法对其进行消毒处理； (2)将步骤(I)消毒处理过的马钱叶片用强度为100-300mT的均匀磁场预处理30min，接入培养基配方为BL+KT2mg/L+ZT2mg/l的培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L, ρΗ5.8，光照强度4001χ，光照时间6h/d，温度24°C ； (3 )取步骤(2 )诱导出来的愈伤组织放入培养基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L进行愈伤组织增值培养，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照时间 I Oh/d，温度 24 0C ； (4)取步骤(3)增值出来结构松散，颜色淡绿色的愈伤组织放入培养基MS+NAA0.1-0.2mg/L+ZTl-l.5mg/L+200-350mg/L麦芽提取物中进行悬浮细胞培养，附加蔗糖 45g/L，ρΗ5.8，光照 25001χ，光照时间 12h/d，温度 24。。。
2.按照权利要求1所述的一种马钱悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(I)中所述马钱无菌叶片的获得为，取马钱的叶片，在洗洁精中浸泡3min，流水冲洗为35min,超净工作台上过氧化氢处理Ilmin,无菌水冲洗5遍。
3.按照权利要求1所述的一种马钱悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)中马钱悬浮细胞的培养采用水平震荡培养，频率为120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培养液。
【文档编号】A01H4/00GK104221880SQ201410540655
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】刘东锋, 杨成东 申请人:南京帝道农业科技有限公司