一株苹果根际自毒物质降解菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株苹果根际自毒物质降解菌及其应用，该菌株分类命名为生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)BL2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月28日，保藏编号：CGMCC No.9619。本发明菌株在液体摇瓶培养的情况下，对根皮苷、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸、焦性没食子酸均具有很好的降解效果。液体摇床培养3天，紫外分光光度计法测定结果显示：降解率分别为，根皮苷36％、对羟基苯甲酸34％、邻苯二甲酸31％、焦性没食子酸65％。表明，BL2菌株对四种自毒物质均具有很好的降解效果，对缓解自毒物质引起的连作障碍具有潜在的应用价值。
CGMCC No.9619
2014.08.28
【专利说明】一株苹果根际自毒物质降解菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株苹果根际自毒物质降解菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 苹果（Malus pumila)是舊薇科（Rosaceae)苹果属（pomaceous)植物，落叶乔木， 叶椭圆形，花白色带有红晕。果实圆形，味甜或略酸，是常见水果，具有丰富的营养成分，有 食疗、辅助治疗功能，是广为大众接受且喜爱的水果之一。近年来，苹果主产区由于连年种 植导致的连作障碍已成为制约苹果生产的关键技术问题。苹果连作障碍产生的主要原因包 括土壤理化性状恶化，土传病虫害加重，自毒物质产生的自毒作用，其中自毒物质对植物的 毒害作用是导致植物连作障碍的形成原因之一。
[0003] 自毒作用（Autotoxicity)是指某些植物可通过地上部淋溶、根系分泌和植株残 茬腐解等途径来释放一些物质对同茬或下茬同种或同科植物生长产生抑制作用。研究发现 酚酸类物质是导致苹果连作障碍的主要自毒物质。酚酸类物质可以通过影响植物的膜系 统、光合作用、酶活性、土壤微生物活性和土壤理化性质等，对植物生长产生抑制作用。导致 苹果连作障碍的酚酸物质主要有根皮苷、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸，焦性没食子酸等。目 前尚未找到去除苹果酚酸类自毒物质的有效方法，微生物对自毒物质的降解作用被认为是 一条很好的途径，既可以降低自毒物质的含量，又不对环境产生危害。据不完全统计，已发 现包括黄孢原毛平革菌和粘质沙雷菌属等20多个属的植物根际细菌具有降解自毒物质潜 能的报道。但是，有关苹果根际细菌对多种自毒物质的降解未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一株苹果根际自毒物质降解菌及其应用。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] -株苹果根际自毒物质降解菌，该菌株分类命名为生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum)BL2,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月28日，保藏编号：CGMCC No.9619。
[0007] 该菌株的菌落及菌体特征为：本发明的苹果根际自毒物质降解菌在LB培养基（酵 母浸膏，5g ;蛋白胨，IOg ;氯化钠 ，IOg ;蒸馏水，IOOOmL ;琼脂，15-20g;12rC灭菌20min ; PH7.0。）上培养48h后菌落呈圆形不透明，表面光滑，淡黄色。菌体呈螺旋状，不产芽孢，革 兰氏染色阴性。
[0008] 该菌株的生理生化特征为：氧化酶试验阳性、接触酶试验阳性、甲基红试验阴性、 v-p试验阴性、淀粉水解试验阴性、硝酸盐还原试验阳性、脲酶试验阴性、吲哚试验阴性、硫 化氢试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、运动性试验阳性、L-阿拉伯糖试验阳性、D-木糖试 验阳性、蔗糖试验阳性、麦芽糖试验阳性、精氨酸利用试验阳性、明胶液化试验阴性。
[0009] 该菌株的最适培养条件为：LB培养基：蛋白胨IOg,酵母浸膏5g，NaCl IOg,蒸馈水 IOOOml ;温度：3(TC，pH 7· 0。
[0010] 该菌株可以用于制备微生物菌剂；应用时，培养CGMCC 9619,得菌悬液，作为液态 菌剂，菌液的浓度优选为2. 0 X 108cfu/ml。
[0011] 菌剂的使用方法：移苗时蘸根、缓苗后灌根80ml菌剂每棵苗。
[0012] 经研究表明，用紫外分光光度法测定培养3d后CGMCC 9619菌株对四种自毒物质 即根皮苷、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸、焦性没食子酸的降解率，结果如下：第1天降解率 27%、32%、29%、30% ;第 2 天降解率 32%、32%、29%、36% ;第 3 天降解率 36%、34%、 31%、65%。高效液相色谱法测定3d后各菌株对自毒物质的降解能力，降解率分别为根皮 苷84 %、对羟基苯甲酸72 %、邻苯二甲酸91 %、焦性没食子酸84 %。以上研究结果表明，BL2 菌株对四种自毒物质均具有很好的降解效果，对缓解自毒物质引起的连作障碍具有潜在的 应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 一株苹果根际自毒物质降解菌，该菌株分类命名为生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum)BL2,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月28日，保藏编号：CGMCC No. 9619 ；
[0014] 图1为紫外分光光度法测定本发明菌株对四种自毒物质3天内降解率柱形图；
[0015] 图2为高效液相色谱法测定本发明菌株对自毒物质3天后降解率柱形图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0017] 一株苹果根际自毒物质降解菌，该菌株分类命名为生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum)BL2,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月28日，保藏编号：CGMCC No.9619。
[0018] (I)CGMCC 9619 的筛选
[0019] 以邻苯二甲酸为唯一碳源富集降解菌的过程：取山东泰安北集坡镇西百子坡村 (N36° 04' 54.9" E117。08' 51.3")苹果根际土样IOg放于加有邻苯二甲酸（其 质量浓度为 l〇〇〇mg/L)的 90mL 基础盐培养基（NH4Cl 0· 5g ;NaCl Ig ;K2HP04 · 3H20 I. 3g ; MgSO4 · 7Η200· 4g ;蒸馏水 IOOOmL ;pH7. 2)中，30°C，180r/min 摇床培养 7d 后，以 5%接种 量转接至新的含邻苯二甲酸基础盐培养基中，转接3次连续富集，邻苯二甲酸浓度分别为 1000mg/L,1200mg/L,1400mg/L〇
[0020] 以邻苯二甲酸为唯一碳源分离降解菌的过程：取富集后的培养液经梯度稀释后 (10_3、10_4、10_ 5、10_6)分别涂布于含1400mg/L的邻苯二甲酸基础盐固体培养基平板上，30°C 培养。待平板上出现单菌落后，挑取单菌落分别划线于邻苯二甲酸基础盐固体培养基中， 得到5株不同生长形态的细菌分离物，反复划线进行纯化，将纯化后的菌落接种至LB固体 斜面培养基中（酵母浸膏，5g ;蛋白胨，IOg ;氯化钠 ，IOg ;蒸馏水，IOOOmL ;琼脂，15-20g ; 121°C灭菌 20min;pH7.0。）保存。
[0021] 通过紫外分光光度法（根皮苷，对羟基苯甲酸，邻苯二甲酸，焦性没食子酸的最 大吸收波长选取分别为325nm ;248nm ;291nm ;302nm)、高效液相色谱法（高效液相色谱参 数条件：紫外检测波长280nm，流动相为乙腈和水（用乙酸调节pH2. 8)，柱温30°C，流速 I. OmL/min。采用双泵系统，梯度洗脱，0-35min，乙腈从5%提高到35%，35-40min，乙腈保 持35%，40-42min，乙腈从35%下降到5%。每个分析周期结束后基线平稳IOmin后进样， 以去除干扰成分，保证分析结果的稳定性和重复性）测定降解率，从分离得到的5株菌中筛 选出1株对根皮苷、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸、焦性没食子酸均具有降解效果的细菌（降 解率见表1，表2)，记为BL2。
[0022] (2) CGMCC 9619 菌种鉴定
[0023] 基因组DNA的提取：将分离得到的菌株划线接种到LB固体培养基上于30°C中培 养24h后，挑取单菌落于装有LB液体培养基的试管中30°C，150r/min摇床培养24h。具体 方法参阅文献（Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short Protocols in Molecular Biology. Chichester: John Wiley&Sons, Inc, 1995:36-40·)。将取得的 DNA 溶于 40 μ L TE 缓冲液（IOmM Tris-HCl，ImM EDTA，PH = 8. 0)中，然后保存于-20°C冰箱备用。
[0024] 16S rDNA序列扩增引物由上海生物工程有限公司合成，正向引物27F :5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，如 SEQ ID NO. 1 ;反向引物 1492R :5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3，，如 SEQ ID NO. 2。
[0025] PCR 扩增反应体系：Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L，IOXBuffer 5 μ L，MgCl23 μ L， dNTPs (10mmol/L) 1 μ L，引物 27F 1 μ L，引物 1492R 1 μ L，模板 0· 5 μ L，ddH20 补足至 50 μ L。 反应条件：95°C预变性5min ;94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸I. 5min，30个循环； 72°C延伸10min。16S rDNA的测序工作由上海生物工程有限公司完成。
[0026] 16S rDNA基因序列，见如SEQ ID NO. 3。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中 的序列比对，结果表明：本发明的菌株位于系统发育树中固氮螺菌属（Azospirillum sp.) 分支中，与 Azospirillum lipoferum ncimb 11861 (Z29619. 1)和 Azospirillum melinis TMCY 0552(DQ022958. 1)两株菌有最近的亲缘关系，其16S rRNA基因序列相似性都为 99%。
[0027] 该菌株在LB培养基（酵母浸膏，5g ;蛋白胨，IOg ;氯化钠 ，IOg ;蒸馈水，IOOOmL ;琼 月旨，15-20g;12rC灭菌20min;pH7.0。）上培养48h后菌落呈圆形不透明，表面光滑，淡黄 色。菌体呈螺旋状，不产芽孢，革兰氏染色阴性。该菌株的生理生化特征为：氧化酶试验阳 性、接触酶试验阳性、甲基红试验阴性、v-p试验阴性、淀粉水解试验阴性、硝酸盐还原试验 阳性、脲酶试验阴性、吲哚试验阴性、硫化氢试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、运动性试验 阳性、L-阿拉伯糖试验阳性、D-木糖试验阳性、蔗糖试验阳性、麦芽糖试验阳性、精氨酸利 用试验阳性、明胶液化试验阴性。与参考菌株Azospirillum melinis相比5% NaCl条件 下生长情况、运动性与参考菌株不符，其余生理生化试验均与参考菌株符合。与参考菌株 Azospirillum lipoferum相比，菌落形态相符，脲酶实验、接触酶实验与参考模式菌株性状 不符，其余生理生化试验均与参考模式菌株符合。由以上菌落、菌体形态，生理生化特征和 16S rDNA 序列分析，鉴定 CGMCC 9619 为生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum)。
[0028] ⑶降解试验
[0029] 培养基及菌种制备：分别配制含邻苯二甲酸（lg/L)的无机盐培养基（NH4Cl 0· 5g ;NaCllg ;K2HP04 ·3Η20 I. 3g ;MgS04 ·7Η20 0· 4g ;蒸馏水 IOOOmL ;ρΗ7· 2)，含对羟基苯甲 酸（lg/L)的无机盐培养基（NH4Cl 0· 5g ;NaCl Ig ;Κ2ΗΡ04 · 3H20 I. 3g ;MgS04 · 7Η20 0· 4g ; 蒸馏水IOOOmL ;pH7. 2)，含焦性没食子酸（lg/L)的无机盐培养基（NH4Cl 0. 5g ;NaCl Ig ; K2HPO4 · 3Η201· 3g ;MgS04 · 7H20 0· 4g ;蒸馏水 IOOOmL ;ρΗ7· 2)，含根皮苷（20mg/L)的无机 盐培养基（NH4Cl 0· 5g ;NaCl Ig ;K2HP04 · 3H20 I. 3g ;MgS04 · 7H20 0· 4g ;蒸馏水 IOOOmL ; pH7. 2)适量。取IOOmL分装于250mL锥形瓶中121°C灭菌20min，然后分别接入该菌于培养 基中摇床（180r/min，30°C )培养至对数期。
[0030] 取培养至对数期的CGMCC 9619菌1%的接种量分别接种于新鲜的含根皮苷 (20mg/L)的无机盐培养基，含对轻基苯甲酸（lg/L)的无机盐培养基，含邻苯二甲酸（lg/L) 的无机盐培养基，含焦性没食子酸（lg/L)的无机盐培养基中，摇床培养（180r/min，30°C)， 每24h取样，测定自毒物质的残留量，残留量采用紫外分光光度法和高效液相色谱测定。
[0031] 紫外分光光度法：首先对得到的样品9000r/min离心IOmin取上清，然后用 0. 22 μ m无机过滤器过滤掉菌体，最后在相应的波长（根皮苷325nm，对轻基苯甲酸248nm, 邻苯二甲酸291nm，焦性没食子酸的302nm)下测定其吸光度，并计算降解率。
[0032] 紫外分光光度法降解率的计算方法：降解率=(未接菌培养液吸光度-接菌培养 液吸光度）/未接菌培养液吸光度X 100 %。
[0033] 高效液相色谱法样品准备：取摇床培养3d后培养液20mL，9000r/min离心10分 钟，去除菌体，取等量二氯甲烷反复萃取三次，有机层合并，旋转蒸发仪减压浓缩蒸干，用 2mL甲醇分三次溶解。然后用0. 22 μ m有机过滤器过滤，装于2mL离心管中备用，然后高效 液相色谱仪测定残留量，并计算降解率。参数设定：紫外检测波长280nm，流动相为乙腈和 水（用乙酸调节ρΗ2· 8)，柱温30°C，流速I. OmL/min。采用双泵系统，梯度洗脱，0-35min，乙 腈从5 %提高到35 %，35-40min，乙腈保持35 %，40-42min，乙腈从35 %下降到5 %。每个分 析周期结束后基线平稳IOmin后进样，以去除干扰成分，保证分析结果的稳定性和重复性。 [0034] 高效液相色谱法降解率计算方法：降解率=(未接菌培养液液相色谱峰面积-接 菌培养液液相色谱峰面积）/未接菌培养液液相色谱峰面积X 100 %。
[0035] 结果如表1、表2,图1、图2所示。
[0036] 紫外分光光度法测定结果显示：3天的降解率分别为：第1天降解率27%、32%、 29%、30%;第2天降解率32%、32%、29%、36%;第3天降解率36%、34%、31%、65%。高 效液相色谱法测定结果显示：降解率分别为根皮苷84%、对羟基苯甲酸72%、邻苯二甲酸 91 %、焦性没食子酸84%。以上表明BL2菌株对四种自毒物质均具有很好的降解效果，对缓 解自毒物质引起的连作障碍具有潜在的应用价值。
[0037] 表1紫外分光光度法测定BL2对四种自毒物质3天内降解率
[0038]
【权利要求】
1. 一株苹果根际自毒物质降解菌，其特征在于，该菌株分类命名为生脂固氮螺菌 (Azospirillum lipoferum)BL2,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月28日，保藏编 号：CGMCC No. 9619。
2. 如权利要求1所述的降解菌，其特征在于，所述菌株的菌落及菌体特征为：在LB培 养基上培养48h后菌落呈圆形不透明，表面光滑，淡黄色；菌体呈螺旋状，不产芽孢，革兰氏 染色阴性。
3. 如权利要求1或2所述的降解菌，其特征在于，所述菌株的最适培养条件为：LB培养 基：蛋白胨l〇g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml ;121°C灭菌20min ;温度：30°C，pH 7. 0。
4. 如权利要求1-3任一所述菌株制备的微生物菌剂。
5. 如权利要求4所述的菌剂，其特征在于，培养CGMCC 9619,得菌悬液，作为液态菌剂。
6. 如权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述液态菌剂的浓度为2. OX 108Cfu/ml。
7. 如权利要求4-6任一所述的菌剂在缓解苹果自毒物质引起的连作障碍中的应用。
8. 如权利要求7所述的菌剂的应用方法，其特征在于，移苗时蘸根、缓苗后灌根，用量 都为80ml菌剂每棵苗。
【文档编号】A01G7/06GK104312956SQ201410568851
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】丁延芹, 毛志泉, 杜秉海, 祁国振, 刘凯, 姚良同 申请人:山东农业大学