一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法
【专利摘要】本发明涉及一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法，包括以下步骤：将黄花贝母生长期鳞茎消毒后切割成小块，将其接种于诱导培养基中诱导形成带有不定芽和芽点的膨大的外植体后接种于增殖培养基中增殖获得黄花贝母组培苗；其中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。本发明所提供的方法简单易行，缩短了不定芽诱导的周期，每个外植体能够诱导至少4个不定芽，提高了诱导数，并且，依照本发明所提供的诱导增殖方法获得的不定芽生长健壮，能够快速成苗。
【专利说明】-种黄花贝母不定芽诱导增殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物组织培养【技术领域】，具体的涉及一种黄花贝母不定芽诱导增殖方 法。
【背景技术】
[0002] 黄花贝母（F. verticillata)是百合科(Xiliaceae)贝母属（Rritillaria L.)的 一种多年生球根植物，具有较高的药用价值和观赏价值。自然分布于新疆的培城、巧里、额 敏、裕民、阿勒泰、富蕴、和布克赛尔、吉木乃、青河等县，生长于海拔1500?2000米的山地 草原、灌木及烁石质山坡地上。产地±壤服沃、质地疏松、排水良好。现在也多进行人工栽 培繁殖，主要在新疆、甘肃等地进行栽培种植。因其喜欢冷凉气候，不耐高温，生长周期短且 不易在异地进行栽培种植，加之长期W来人们对野生资源的滥采乱挖，致使数量急剧减少， 该就极大地限制了它的应用。
[0003] 此外，黄花贝母和其它贝母一样，常规的繁殖方法W播种和分球繁殖为主，用鱗茎 进行繁殖，其繁殖系数低，且容易造成种性退化。而用种子进行有性繁殖，其繁殖周期长，一 般要5-6年的时间才能长成开花种球，且黄花贝母种子的种胚发育不全，需经低温处理后 熟后才能完成胚的生长和发育，该很难适应和满足产业化大生产和国内外市场的需求。而 采取植物组织培养技术，可W快速获得贝母不定芽，进一步培养成贝母幼苗，移栽1?2年 后即可收获成熟贝母，该样不仅缩短了人工栽培贝母周期，而且可大量繁殖贝母幼苗，从而 实现贝母种苗规模化生产。
[0004] 目前关于贝母组织培养已有一些报道，并取得了一定的进展，该些研究多采用贝 母的鱗茎作为外植体，通过离体培养进行愈伤的诱导，或进行鱗茎的再生等W达到快速繁 殖的目的，已经在川贝母、平贝母、伊贝母、暗紫贝母等种类上取得了一定的效果。而关于黄 花贝母组培的研究较少，只有高燕等发表的《贝母愈伤组织的诱导及植株再生》（新疆农业 科学，2005, 01:35-37) -文中公开了有关黄花贝母的组织培养研究，文中提到诱导不定芽 的最佳培养基为MS+6-BA 1. Omg/L+2, 4-D0. Img/L，平均每个外植体产生2?3个不定芽。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种简单易行、培养周期短、能够在外植体上诱导出4-7 个不定芽，且不定芽绿色健壮的黄花贝母组织培养诱导成芽的方法。
[0006] 为达到W上目的，本发明提供了一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法，所述方法包 括W下步骤：
[0007] 将黄花贝母生长期鱗茎消毒后切割成小块，将其接种于诱导培养基中诱导形成带 有不定芽和芽点的膨大的外植体后接种于增殖培养基中增殖获得黄花贝母组培苗；
[0008] 其中，所述诱导培养基为；W MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。
[0009] 可选的，所述诱导的步骤包括：
[0010] 1)利用诱导培养基在培养温度为19-2rc、光照强度为1450-15501X、光照时间为 11-1化/d的条件下诱导培养30-50天；
[0011] 2)更换新鲜的诱导培养基在3-5C下处理7-10天后置于温度为19-2rc、光照强 度为2000-25001X、光照时间为11-1化/d的环境条件下培养25-40天，获得带有不定芽和芽 点的膨大的外植体；
[0012] 所述增殖培养的步骤包括；将上述外植体接种在增殖培养基中，培养条件与步骤 1)相同，培养30-50天。
[0013] 可选的，所述诱导培养基为；W MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.5-2. Omg/L 的 6-BA，浓度为 0. 2-2. Omg/L 的 NAA。
[0014] 可选的，所述增殖培养基为；W MS培养基为基本培养基，含有浓度为0. 2-1. Omg/L 的 6-BA，浓度为 0. 2-1. Omg/L 的 NAA，浓度为 0. 1-1. Omg/L 的 2, 4-D。
[0015] 可选的，所述诱导、增殖培养基还含有浓度为30-50g/L的藏糖，浓度为6. 5-7. Og/ L的琼脂。
[0016] 可选的，所述诱导培养基和增殖培养基的pH为5. 8-6. 0。
[0017] 可选的，所述消毒的步骤包括：
[0018] 将清洗干净的鱗茎在75%的酒精中表面消毒50-70S后用无菌水清洗2-3次，再将 鱗茎在0. 1%的升隶溶液中浸泡8-12min后用2%的次氯酸轴水溶液浸泡12-16min。
[0019] 可选的，在诱导培养基中培养结束后诱导获得的不定芽的数目为4-7个。
[0020] 本发明所提供的方法简单易行，缩短了不定芽诱导的周期，每个外植体能够诱导 至少4个不定芽，提高了诱导数，并且，依照本发明所提供的诱导增殖方法获得的不定芽生 长健壮，能够快速成苗。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为黄花贝母生长期鱗茎刚接种到诱导培养基中的情况；
[0022] 图2为外植体膨大后表面长出芽点和芽的情况；
[0023] 图3为不定芽经过增殖培养后的情况；
[0024] 图4为单个健壮芽的情况。
【具体实施方式】
[00巧]下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0026] 本发明提供了一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法，所述方法包括W下步骤：
[0027] 将黄花贝母生长期鱗茎消毒后切割成小块，将其接种于诱导培养基中诱导形成带 有不定芽和芽点的膨大的外植体后接种于增殖培养基中增殖获得黄花贝母组培苗；其中， 所述诱导培养基为；W MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。
[0028] 在本发明中，所述生长期鱗茎采自处于营养生长期的黄花贝母种球，即地上部分 开始长叶至有花蕾前，一般的，黄花贝母在每年的2月下旬至3月上旬进入营养生长期，此 时的鱗茎处于细胞生长胚盛时期，可W用作外植体用于诱导不定芽。
[0029] 本发明所提供的方法还包括在进行消毒前的清洗步骤，本发明对于清洗的方法没 有特别的限制，只要能够去除杂物获得洁净的鱗茎即可，在本发明的一种实施方式中，可W 先剥除黄花贝母鱗茎上带有的老鱗茎及根等杂物，然后将鱗茎置于有洗洁精的溶液中浸泡 15-25min，浸泡期间不停地摇晃W去除鱗茎表面的杂物，之后用清水冲洗鱗茎60-90min获 得清洗干净的鱗茎。
[0030] 根据本发明所提供的方法，所述消毒的步骤包括：
[0031] 将清洗干净的鱗茎在75%的酒精中表面消毒50-70S后用无菌水清洗2-3次，再将 鱗茎在〇.1%的升隶溶液中浸泡8-121111]1后用2%的次氯酸轴水溶液浸泡12-161]11]1。在用 次氯酸轴溶液浸泡后，还需要用无菌水对鱗茎清洗3-5次，每次3-5min，清洗结束后，用无 菌滤纸吸干鱗茎表面的水分。为了避免杂菌污染，上述步骤需要在超净工作台中进行。
[0032] 在诱导前，将鱗茎切割成小块，所述小块的尺寸约为5mmX5mmX3mm。
[0033] 在本发明所提供的方法中，所述诱导培养基为；W MS培养基为基本培养基，含有 浓度为 0. 5-2. Omg/L 的 6-BA，浓度为 0. 2-2. Omg/L 的 NAA。
[0034] 优选的，为了获得更好的诱导效果，所述诱导培养基为；W MS培养基为基本培养 基，含有浓度为0. 5mg/L的6-BA，浓度为0. 2mg/L的NAA，或者，W MS培养基为基本培养基， 含有浓度为1. Omg/L的6-BA，浓度为1. Omg/L的NAA。
[0035] 在本发明所提供的方法中，所述增殖培养基为；W MS培养基为基本培养基，含有 浓度为 0. 2-1. Omg/L 的 6-BA，浓度为 0. 2-1. Omg/L 的 NAA，浓度为 0. 1-1. Omg/L 的 2, 4-D。
[0036] 优选的，为了获得更好的增殖效果，所述增殖培养基为；W MS培养基为基本培养 基，含有浓度为0. 2mg/L的6-BA，浓度为0. 5mg/L的NAA，浓度为1. Omg/L的2, 4-D。
[0037] 其中所述MS培养基的配方为；硝酸钟1900mg/L、硝酸馈1650mg/L、磯酸二氨钟 170mg/L、硫酸镇 370mg/L、氯化巧 440mg/L、楓化钟 0. 83mg/L、测酸 6. 2mg/L、硫酸猛 22. 3mg/ L、硫酸锋8. 6mg/L、钢酸轴0. 25mg/L、硫酸铜0. 025mg/L、氯化钻0. 025mg/L、己二胺四己酸 二轴37. 3mg/L、硫酸亚铁27. 8mg/L、肌醇lOOmg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0. Img/L、盐酸 化唆醇 0. 5mg/L、烟酸 0. 5mg/L。
[0038] 在本发明的一种实施方式中，为了使黄花贝母的茎段获得更加充分的营养，所述 诱导、增殖培养基还含有浓度为30-50g/L的藏糖，浓度为6. 5-7. Og/L的琼脂。
[0039] 在本发明的一种实施方式中，所述诱导培养基和增殖培养基的抑为5. 8-6. 0。
[0040] 具体的，所述诱导的步骤包括：
[0041] 1)利用诱导培养基在培养温度为19-2rc、光照强度为1450-15501X、光照时间为 11-1化/d的条件下诱导培养30-50天；
[0042] 2)更换新鲜的诱导培养基在3-5C下处理7-10天后置于温度为19-2rC、光照强 度为2000-25001X、光照时间为11-1化/d的环境条件下培养25-40天，得带有不定芽和芽点 的膨大的外植体。
[0043] 其中在步骤1)中，鱗茎在诱导培养基中培养45-55天后开始长出芽点，随后芽点 逐渐发育成不定芽。一般的，在诱导培养基中培养结束后诱导获得的不定芽的数目为4-7 个。
[0044] 将在诱导培养基中获得的带有不定芽和芽点的膨大的外植体接种在增殖培养基 中，培养温度为19-2rC、光照强度为1450-15501X、光照时间为ll-13h/d，培养30-50天后， 膨大的外植体上分化出更多的芽，平均每个外植体有6-8个芽和芽点。
[0045] 下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是W下实施 例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术 人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可w对本发明进行各种修改和替换。
[004引 实施例1-5
[0047] 实施例1-5用于说明本发明所提供的诱导增殖方法。
[0048] (1)将种在北林科技花弁工程技术中也温室花盆内处于营养生长时期的黄花贝母 种球挖出。
[0049] (2)剥除上述鱗茎上带有的旧鱗茎及根等杂物，然后置于含有洗洁精的溶液中浸 泡20min，期间应不停地摇晃，之后用自来水进行流水冲洗90min，然后将鱗茎在超净工作 台上采用75%酒精进行表面消毒60s，无菌水冲洗3次，然后用0. 1 %的升隶处理lOmin，再 用2 %的次氯酸轴水溶液处理15min，无菌水冲洗3次，每次5min，然后用无菌滤纸吸干表面 的水分，待用；
[0050] (3)将步骤（2)中处理后的鱗茎切成长、宽各约0. 5cm的小块共28块，然后将其接 入诱导不定芽的培养基中进行诱导培养。
[0051] 诱导培养基的组分如表1所示，培养温度为2(TC，在光照时间为12h/d，光强为 15001X的环境中培养，35天后在膨大的外植体上长出芽点，之后形成不定芽2-3个。然后 将其接种在新鲜的诱导培养基上进行继代培养，同时转入4C低温下处理7天，之后在培养 温度为2(TC，在光照时间为12h/d，光强为20001X的环境中培养30天，每个外植体可获得 4-5个绿色健壮的不定芽。
[0052] (4)不定芽的增殖培养
[0053] 将经过低温处理的长有芽点的外植体接种在W下增殖培养基中进行增殖培养， MS+0. 2mg/L6-BA+0. 5mg/L NAA+1. 0mg/L2, 4-D巧Og/L 藏糖 +6. 5g/L 琼脂，抑值为 5. 89,培 养温度为2(TC，光照时间为12h/d，光强为15001X。
[0054] 统计外植体通过诱导增殖得到的不定芽的平均数量及增殖情况，结果列于表2。
[00巧]在诱导增殖过程中，观察实施例1中黄花贝母生长期鱗茎切块刚接种到诱导培养 基中的情况（见图1);外植体膨大后表面长出芽点和芽的情况（见图2);不定芽经过增殖 培养后的情况（图3);单个健壮芽的情况（图4)。
[0056] 表 1
[0057]
【权利要求】
1. 一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，包括以下步骤： 将黄花贝母生长期鳞茎消毒后切割成小块，将其接种于诱导培养基中诱导形成带有不 定芽和芽点的膨大的外植体后接种于增殖培养基中增殖获得黄花贝母组培苗； 其中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。
2. 根据权利要求1所述的黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，所述诱导的步 骤包括： 1) 利用诱导培养基在培养温度为19_21°C、光照强度为1450-15501X、光照时间为 11-13h/d的条件下诱导培养30-50天； 2) 更换新鲜的诱导培养基在3-5°C下处理7-10天后置于温度为19-21°C、光照强度为 2000-25001x、光照时间为ll-13h/d的环境条件下培养25-40天，获得带有不定芽和芽点的 膨大的外植体； 所述增殖培养的步骤包括：将上述外植体接种在增殖培养基中，培养条件与步骤1)相 同，培养30-50天。
3. 根据权利要求1或2所述的黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，所述诱导培 养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0. 5-2. Omg/L的6-BA，浓度为0. 2-2. Omg/ L 的 NAA。
4. 根据权利要求3所述的黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，所述增殖培养 基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0. 2-1. Omg/L的6-BA，浓度为0. 2-1. Omg/L的 NAA，浓度为 0? 1-1. Omg/L 的 2, 4-D。
5. 根据权利要求1、2或4所述的黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，所述诱导 培养基还含有浓度为30-50g/L的蔗糖，浓度为6. 5-7. 0g/L的琼脂。
6. 根据权利要求5所述的黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，所述诱导培养 基和增殖培养基的pH为5. 8-6. 0。
7. 根据权利要求1、2或6所述的黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，所述消毒 的步骤包括： 将清洗干净的鳞茎在75 %的酒精中表面消毒50-70S后用无菌水清洗2-3次，再将鳞茎 在〇.1%的升萊溶液中浸泡8-12111111后用2%的次氯酸钠水溶液浸泡12-161]1111。
8. 根据权利要求7所述的黄花贝母不定芽诱导增殖方法，其特征在于，在诱导培养基 中培养结束后诱导获得的不定芽的数目为4-7个。
【文档编号】A01H4/00GK104396746SQ201410645448
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】于晓南, 郝丽红, 程堂仁, 张启翔 申请人:北京林业大学