小麦耐盐基因TaSOD2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小麦耐盐基因即小麦基因TaSOD2及含有所述基因TaSOD2的植物表达载体，本发明还公开了所述基因TaSOD2在培育抗盐植物特别是小麦中的应用。实验证明，本发明所述转基因植株的抗盐能力明显提高。
【专利说明】小麦耐盐基因TaS0D2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程【技术领域】，尤其涉及一种小麦耐盐基因（基因TaS0D2) 及其应用。
【背景技术】
[0002] 土壤盐渍化严重影响农作物产量。特别是随着工业的发展，土壤盐渍化愈来愈严 重，已成为一个全球关注的社会问题。我国人口众多，而土壤盐渍化更为严重，已经成为制 约我国经济和社会发展的重要因素。因此，除了缓解土壤盐渍化以外，培育耐盐农作物新品 种已成为当前一个十分迫切的任务。
[0003] 利用转基因技术改良植物将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基 因植物新品种并用于在盐碱地种植，是一项具有广阔应用前景的技术。
[0004] 目前，利用基因工程技术开展植物耐盐方面研究已取得了较大的进展，克隆了大 量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于耐盐机制研究。一些实验表明，将植物本身以 及其它生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的 抗盐能力得到提_。
[0005] 检索表明已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的基因，但有关S0D基因在植物 耐盐过程中的作用报道较少。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种耐盐基因--小麦基因TaS0D2及 其应用。
[0007] 本发明的技术方案是：从小麦中分离得到小麦基因TaS0D2,然后将该基因转化到 拟南芥和小麦中，进行转基因功能验证（小麦和拟南芥转化筛选及盐胁迫表性分析），以实 现研究S0D基因的功能以及植物的耐盐机理和其生产应用。
[0008] 本发明所述的小麦耐盐基因名称为小麦耐盐基因TaS0D2,其特征在于：所述基因 cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[0009] 本发明还提供了含上述的小麦基因TaS0D2的植物表达载体pSTART-TaS0D2或 pXQUbi-TaS0D2。
[0010] 本发明所述的基因TaS0D2可广泛用于培育耐盐农作物品种。
[0011] 本发明所述基因TaS0D2在培育抗盐植物中的应用。进一步的，本发明所述含基因 TaS0D2的植物表达载体pSTART-TaS0D2或pXQUbi-TaS0D2在培育抗盐植物中的应用。
[0012] 其中：所述植物优选是普通小麦。
[0013] 将本发明所述基因TaS0D2导入植物细胞，植物即可相应的获得耐盐的能力。为 了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaS0D2的植物表达载体 (pSTATR-TaS0D2或pXQUbi-TaS0D2)进行加工，如可以加入选择标记（⑶S等）或者具有抗 性的抗生素标记物（潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等）等。
[0014] 实际上，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本发明优 选的载体是PSTART。
[0015] 本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦 耐盐基因TaS0D2,并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥和小麦，经过比较分 析证明，转基因植株的耐盐能力明显提高。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1 :TaS0D2基因全长cDNA序列的扩增结果
[0017] 其中：M为XDNA/(BamHI+SacI)Marker;下同。
[0018] 图2 :山融3号和济南177小麦在200mMNaCl盐胁迫条件下TaS0D2的RT-PCR分 析
[0019] 其中：177表示济南177小麦，SR3表示山融3号小麦，Leaf表示叶，root表示根， Actin表示拟南芥Actin(内参），数字表示胁迫时间（小时）。
[0020] 图3 :pXQUbi_TaS0D2小麦表达载体构建过程
[0021] 其中：A为带酶切位点的TaS0D2片段扩增；B为Kpnl和BamHl对TaS0D2片段和 pXQUbi载体进行双酶切条带；C为pXQUbi-TaS0D2载体的双酶切验证。
[0022] 图4 :小麦TaS0D2转基因植株检测
[0023] 其中：VC为空载体转基因株系；0E1-4为四个独立的转基因株系；TaActin为小麦 Actin基因内参。
[0024] 图5 :pSTART_TaS0D2拟南芥表达载体构建过程
[0025] 其中：A为带酶切位点的TaS0D2片段扩增；B为Xbal和BamHl对TaS0D2片段和 pSTART载体进行双酶切条带；C为pSTART-TaS0D2载体的双酶切验证；D为pSTART-TaS0D2 载体的PCR验证
[0026] 图6 :拟南芥TaS0D2转基因植株检测
[0027] 其中：A为基因组PCR验证TaS0D2整合到拟南芥基因组；B为RT-PCR验证TaS0D2 在转基因株系中正常表达；VC为空载体转基因株系；0E1-2为两个独立的转基因株系；+为 阳性质粒；M为分子量标记；AtTubulin为拟南芥Tubulin基因内参。
[0028] 图7 :盐胁迫下转基因拟南芥株系与对照根系的生长状况
[0029] 其中：A:转基因小麦，WT为未转化小麦株系，CE1/CE2为两个独立的转基因株系；B 转基因拟南芥，Col-0为未转化拟南芥植株，0E1/0E2为两个独立的转基因株系；C:小麦根 长统计；D:拟南芥根长统计。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1、TaS0D2的克隆
[0031] 1. 1 提取小麦TotalRNA
[0032] 1.将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；
[0033] 2.待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的 Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混勻样品，使样品 充分裂解，室温放置5分钟；
[0034]3.加入0. 2ml氯仿（chloroform)，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；
[0035]4. 4°C，12000rpm离心 15 分钟；
[0036] 5.用移液器小心吸出上层水相，加入新的1. 5ml的离心管中，加入500ill的异丙 醇（1:1体积），充分混匀，-20°C，沉淀30min或过夜；
[0037] 6. 4°C, 12000rpm离心lOmin，小心弃去上清液；
[0038] 7.RNA沉淀用1ml的75 %乙醇洗涤；4°C，8000rpm离心lOmin收集沉淀；
[0039] 8.重复用75 %乙醇洗涤一次RNA沉淀；
[0040] 9.去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当 体积（30-50ill)的RNase-free水充分溶解（可放于-80°C长期保存）；
[0041] 10.紫外分光光度计及1 %Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。
[0042] 注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，10D= 40iig/ ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的0D26(l/0D28(l比值应接近 2. 0 (比值最好在1. 9?2. 1之间）。
[0043]b)用1 %Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1illRNA加入3ill的 RNase-free水，加1ill上样缓冲液65°C变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3ill的lkb DNAMarker作为对照。
[0044] 1. 2cDNA反转录
[0045]反转录酶：M-MLVReverseTranscriptase(Invitrogen)。
【权利要求】
1. 一种小麦耐盐基因TaS0D2,其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. -种含有权利要求1所述基因TaS0D2的植物表达载体pSTART-TaS0D2。
3. -种含有权利要求1所述基因TaS0D2的植物表达载体pXQUbi-TaS0D2。
4. 权利要求1所述基因TaS0D2在培育抗盐植物中的应用。
5. 权利要求2所述植物表达载体pSTART-TaS0D2在培育抗盐植物中的应用。
6. 权利要求3所述植物表达载体pXQUbi-TaS0D2在培育抗盐植物中的应用。
7. 如权利要求4、5或6所述的应用，其特征在于：所述植物是普通小麦。
【文档编号】A01H5/00GK104328128SQ201410649749
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】夏光敏, 赵欣, 王勐骋, 董蔚 申请人:山东大学