一种剑叶龙血树愈伤组织诱导及防褐化的方法
【专利摘要】一种剑叶龙血树愈伤组织诱导及防褐化的方法，包括如下步骤：(1)取剑叶龙血树种子作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导出芽；(3)将无菌芽置于MS诱导培养基中进行培养获得愈伤组织；(4)将愈伤组织置于MS增殖培养基中进行培养得到大量的愈伤组织。(5)将大量的愈伤组织置于MS防褐化培养基中进行培养得到质地疏松的愈伤组织。采用本发明所述方法得到的愈伤组织翠绿色或者乳黄色、生长快、不易褐化，可诱导增殖出大量生长良好且褐化率低的愈伤组织，为医学提取“血竭”提供优质材料，进一步满足市场需求。
【专利说明】一种剑叶龙血树愈伤组织诱导及防褐化的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物愈伤组织诱导及防褐化方法，特别是一种剑叶龙血树的愈伤组织诱导及防褐化方法。
【背景技术】
[0002]剑叶龙血树的00011111011111611818 (10111-) 8.0.011611)又名千年木、血竭树、交趾龙血树，是渐危种，属国家二级保护植物，主要分布于广西、云南、海南等地。剑叶龙血树具有很高的药用价值，从其树脂提取的血竭被称为麒麟竭，为我国传统名贵中药材，在我国已有1500年以上的使用历史。此外，其造型古朴典雅，具有很高的观赏价值。2003年被国际自然与自然资源保护联合会划归为易受危害的物种列为红色名单，被定为佛得角红皮书中的濒危物种，是目前国内公认的国产龙血竭的基源植物。
[0003]据《本草纲目》记载，龙血竭性温、平，味甘、咸，无毒，入血分，归肺、脾、肾三经，具有活血化瘀、消肿止痛、收敛止血，软坚散结，生肌敛疮等显著功效，有“活血圣药”的美誉。现代医学研宄证实，血竭具有改善机体微循环、调整机体新陈代谢、改善机体免疫功能等作用。随着血竭在医学临床中应用范围的拓展，血竭有供不应求的趋势。再加上龙血树的生长非常缓慢，一年之内树干增粗还不到1厘米，龙血竭又为龙血树受伤后流出的红色液体，产量非常有限，目前价格已涨到1000?1300元/匕，致使人们对剑叶龙血树野生资源实施了不合理的掠夺性采伐，其野生资源日趋枯竭，濒危灭绝。也由此出现了多种龙血竭的混伪品在全国各地市场上广泛流通，引发了恶性循环的市场现象和多起中毒事故。药材剑叶龙血树也由于受到气候、产地等各种因素的影响，药材质量会有较显著的差异。
[0004]剑叶龙血树在组培快繁技术上取得了初步进展，但在外植体增殖、诱导初分化及再分化过程中，自身组织会向培养基释放褐色物质导致培养基逐渐变褐，从而严重影响愈伤组织和无菌苗的质量甚至死亡，严重限制剑叶龙血树愈伤组织培养效率，难以满足大规模生产的需要。为此，探索剑叶龙血树愈伤组织诱导的最佳激素因子和条件，并通过添加防褐化物质、改变培养环境等方式找到更佳的抑制褐化办法，以期有效降低褐化率，建立高质量的剑叶龙血树愈伤组织培养体系。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种剑叶龙血树的愈伤组织诱导及防褐化的方法，它能够短时间产生大量的长势良好的愈伤组织、为市场提供优质“血竭”原材料。
[0006]本发明通过以下技术方案达到上述目的:一种剑叶龙血树的愈伤组织诱导及防褐化的方法，包括以下步骤:
[0007](1)外植体的消毒:取剑叶龙血树种子作为外植体，先用洗洁精水溶液清洗种子表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5?8-1然后移至超净工作台上，用75%酒精将种子浸泡303，无菌水冲洗1遍，再用添加了 1-2滴吐温-20的10001浓度为0.1% ！！成12消毒8?1501！！，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
[0008](2)种子诱导:将步骤(1)得到的外植体接种到13诱导培养基中，在培养温度为25±2。〇，光照强度20?30 ^01/(1112 ? 8)，光照时间为1211/4的条件下培养15山种子发芽，所述种子诱导13诱导培养基为13基本培养基中加入0.5111^/1的6-苄基腺嘌呤6-8八、0.11118/1的萘乙酸嫩八、308/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8 ；
[0009](3)芽诱导获得愈伤组织:将步骤⑵中得到的无菌芽置于13诱导培养基中，在培养温度25±21，光照强度20?30 011101/(1112 - 8)，光照时间为1011/(1的条件下培养7(1开始萌发，15(1便形成愈伤组织，所述芽诱导13诱导培养基为13基本培养基中加入0.1?2.0111^/1的6-苄基腺嘌呤6-8八、0.05?0.5呢凡的噻重氮苯基脲11)24.1?1.0^/1的萘乙酸碰、0.1?1.0111^/1的2，4- 二氯苯氧乙酸2，4-0,30^/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8 ；
[0010](4)愈伤组织增殖培养:将步骤⑶中得到的愈伤组织置于13增殖培养基中，培养温度25±21，光照强度20?30 V001/(1112 - 3), 18增殖培养基为13基本培养基中加入
0.1?1.0111^/1的6-节基腺嘌呤6-8八、0.5?2.0^/1的萘乙酸嫩八、0.1?0.5^/1的激动素0，308/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8 ；
[0011](5)防褐化培养:将步骤⑷中得到的愈伤组织置于13防褐化培养基中，在培养温度25±21，光照强度20?30 11101/ (1112 ? 3)，光照时间为1011/4的条件下培养分别培养40(1,18防褐化培养基为13基本培养基中加入防褐添加剂20?1001^/1的5?2.0^/I的活性炭，308/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8 ；
[0012]本发明的突出优点在于:
[0013](1)本发明采用生物技术方法对剑叶龙血树进行愈伤组织诱导和防褐化试验，通过取剑叶龙血树种子进行诱导培养出芽，在短时间内培育出大量长势良好的剑叶龙血树愈伤组织，实现对其药材资源的可持续利用。
[0014](2)本发明涉及6-苄基腺嘌呤和2，4-0可提高愈伤组织增殖效率；噻重氮苯基脲102是一种生物调节剂，它能诱导外植体从愈伤组织形成到体细胞胚胎发生，^和活性炭可抑制褐化。以上化学药品等价格低廉，成本低。
[0015](3)采用本发明所述的培养方法得到的剑叶龙血树愈伤组织培养30(1增殖率达到64.3%^嫩绿色，质地疏松，愈伤组织褐化率为8.2%，获得高质量的愈伤组织。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
[0017]实施例1
[0018](1)外植体的消毒:取剑叶龙血树种子作为外植体，先用洗洁精水溶液清洗种子表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5?8-1然后移至超净工作台上，用75%酒精将种子浸泡303，无菌水冲洗1遍，再用添加了 1-2滴吐温-20的10001浓度为0.1% ！！成12消毒8?1501！！，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
[0019](2)种子诱导:将步骤(1)得到的外植体接种到13诱导培养基中，在培养温度为25±2。〇，光照强度20?30 11101/(1112 ? 8)，光照时间为1211/4的条件下培养15山种子发芽，所述种子诱导13诱导培养基为13基本培养基中加入0.5111^/1的6-苄基腺嘌呤6-8八、0.11118/1的萘乙酸嫩八、308/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8。
[0020](3)芽诱导获得愈伤组织:将步骤⑵中得到的无菌芽置于13诱导培养基中，在培养温度25±21，光照强度20?30 411101/(1112 - 8)，光照时间为1011/(1的条件下培养9(1开始萌发，18(1便形成愈伤组织，所述芽诱导13诱导培养基为13基本培养基中加入0.1^/I的6-苄基腺嘌呤6-8八、0.2111^/1的噻重氮苯基脲11)24.1^/1的萘乙酸嫩八、0.1^/1的2，4- 二氯苯氧乙酸2，4-0，308/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8，愈伤组织诱导率为51.9% ；
[0021〕 (4)愈伤组织增殖培养:将步骤⑶中得到的愈伤组织置于13增殖培养基中，培养温度25±21，光照强度20?30 V001/(1112 - 3), 18增殖培养基为13基本培养基中加入
0.11118/1的6-苄基腺嘌呤6-8八、0.5^/1的萘乙酸嫩八、0.1^/1的激动素0，30^/1蔗糖，4.5 8/1的琼脂，培养基的邱值为5.8，愈伤组织增殖率为49.7% ；
[0022](5)防褐化培养:将步骤(4)中得到的愈伤组织置于13防褐化培养基中，在培养温度25±2。0，光照强度20?30 11101/ (1112 ? 3)，光照时间为1011/4的条件下培养分别培养40山防褐化培养基为13基本培养基中加入防褐添加剂2008/1的5^/1的活性炭，3(^/1蔗糖，4.58/1的琼脂，培养基的邱值为5.8，愈伤组织褐化率为31.3% ；
[0023]实施例2
[0024](1)外植体的消毒:取剑叶龙血树种子作为外植体，先用洗洁精水溶液清洗种子表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5?8-1然后移至超净工作台上，用75%酒精将种子浸泡303，无菌水冲洗1遍，再用添加了 1-2滴吐温-20的10001浓度为0.1% ！！成12消毒8?1501！！，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
[0025](2)种子诱导:将步骤(1)得到的外植体接种到13诱导培养基中，在培养温度为25±2。〇，光照强度20?30 11101/(1112 ? 8)，光照时间为1211/4的条件下培养15山种子发芽，所述种子诱导13诱导培养基为13基本培养基中加入0.5111^/1的6-苄基腺嘌呤6-8八、
0.11118/1的萘乙酸嫩八、308/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8。
[0026](3)芽诱导获得愈伤组织:将步骤⑵中得到的无菌芽置于13诱导培养基中，在培养温度25±21，光照强度20?30 011101/(1112 - 8)，光照时间为1011/(1的条件下培养7(1开始萌发，16(1便形成愈伤组织，所述芽诱导13诱导培养基为13基本培养基中加入1.0^/I 6-苄基腺嘌呤6-8八、0.05^/1的噻重氮苯基脲11)24.5呢/1的萘乙酸嫩八、1.0^/1的2，4- 二氯苯氧乙酸2，4-0，308/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8，愈伤组织诱导率为46.2% ；
[0027](4)愈伤组织增殖培养:将步骤⑶中得到的愈伤组织置于13增殖培养基中，培养温度25±21，光照强度20?30 V001/(1112 - 3), 18增殖培养基为13基本培养基中加入0.51118/1的6-苄基腺嘌呤6-8八、1.0^/1的萘乙酸嫩八、0.5呢/1的激动素0，30^/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8，愈伤组织增殖率为58.3% ；
[0028](5)防褐化培养:将步骤(4)中得到的愈伤组织置于13防褐化培养基中，在培养温度25±21，光照强度20?30 11101/ (1112 ? 3)，光照时间为1011/4的条件下培养分别培养40山防褐化培养基为13基本培养基中加入防褐添加剂100呢/1的I，1.2^/1的活性炭，30^/1蔗糖，4.58/1的琼脂，培养基的邱值为5.8，愈伤组织褐化率为8.2% ；
[0029]实施例3
[0030](1)外植体的消毒:取剑叶龙血树种子作为外植体，先用洗洁精水溶液清洗种子表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5?8-1然后移至超净工作台上，用75%酒精将种子浸泡303，无菌水冲洗1遍，再用添加了 1-2滴吐温-20的10001浓度为0.1% ！！成12消毒8?1501！！，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
[0031](2)种子诱导:将步骤(1)得到的外植体接种到13诱导培养基中，在培养温度为25±2。〇，光照强度20?30 ^01/(1112 ? 8)，光照时间为1211/4的条件下培养15山种子发芽，所述种子诱导13诱导培养基为13基本培养基中加入0.5111^/1的6-苄基腺嘌呤6-8八、0.11118/1的萘乙酸嫩八、308/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8。
[0032](3)芽诱导获得愈伤组织:将步骤⑵中得到的无菌芽置于13诱导培养基中，在培养温度25±21，光照强度20?30 011101/(1112 - 8)，光照时间为1011/(1的条件下培养7(1开始萌发，15(1便形成愈伤组织，所述芽诱导13诱导培养基为13基本培养基中加入1.0^/I的6-苄基腺嘌呤6-8八、0.2111^/1的噻重氮苯基脲11)2、1.0^/1的萘乙酸嫩八、0.3呢/1的2，4- 二氯苯氧乙酸2，4-0，308/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8，愈伤组织诱导率为95.8% ；
[0033](4)愈伤组织增殖培养:将步骤⑶中得到的愈伤组织置于13增殖培养基中，在培养温度25±21，光照强度20?30 V001/(1112 - 3), 18增殖培养基为13基本培养基中加入0.5111^/1的6-苄基腺嘌呤6-8八、2.0^/1的萘乙酸嫩八、0.2呢/1的激动素0，30^/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8，愈伤组织增殖率为62.5% ；
[0034](5)防褐化培养:将步骤(4)中得到的愈伤组织置于13防褐化培养基中，在培养温度25±21，光照强度20?30 11101/ (1112 ? 3)，光照时间为1011/4的条件下培养分别培养40山防褐化培养基为13基本培养基中加入防褐添加剂100呢/1的VI:，2.0^/1的活性炭，3(^/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8，愈伤组织褐化率为22.4% ；
[0035]实施例4
[0036](1)外植体的消毒:取剑叶龙血树种子作为外植体，先用洗洁精水溶液清洗种子表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5?8-1然后移至超净工作台上，用75%酒精将种子浸泡303，无菌水冲洗1遍，再用添加了 1-2滴吐温-20的10001浓度为0.1% ！！成12消毒8?1501！！，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
[0037](2)种子诱导:将步骤(1)得到的外植体接种到13诱导培养基中，在培养温度为25±2。〇，光照强度20?30 11101/(1112 ? 8)，光照时间为1211/4的条件下培养15山种子发芽，所述种子诱导13诱导培养基为13基本培养基中加入0.5111^/1的6-苄基腺嘌呤6-8八、0.11118/1的萘乙酸嫩八、308/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8。
[0038](3)芽诱导获得愈伤组织:将步骤⑵中得到的无菌芽置于13诱导培养基中，在培养温度25±21，光照强度20?30 011101/(1112 - 8)，光照时间为1011/(1的条件下培养8(1开始萌发，17(1便形成愈伤组织，所述芽诱导13诱导培养基为13基本培养基中加入2.0^/I的6-苄基腺嘌呤6-8八、0.5111^/1的噻重氮苯基脲11)24.5呢/1的萘乙酸嫩八、0.3呢/1的2，4- 二氯苯氧乙酸2，4-0，308/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8，愈伤组织诱导率为78.5% ；
[0039](4)愈伤组织增殖培养:将步骤⑶中得到的愈伤组织置于13增殖培养基中，培养温度25±21，光照强度20?30 V001/(1112 - 3), 18增殖培养基为13基本培养基中加入
1.0111^/1的6-苄基腺嘌呤6-811.0^/1的萘乙酸2呢/1的激动素0，30^/1蔗糖，4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8，愈伤组织增殖率为64.3% ；
[0040](5)防褐化培养:将步骤(4)中得到的愈伤组织置于13防褐化培养基中，在培养温度25±2。0，光照强度20?30 11101/ (1112 ? 3)，光照时间为1011/4的条件下培养分别培养40山防褐化培养基为13基本培养基中加入防褐添加剂5008/1的I，1.2^/1的活性炭，3(^/1蔗糖和4.5^/1的琼脂，培养基的邱值为5.8，褐化率为19.5%。
【权利要求】
1.一种剑叶龙血树的愈伤组织诱导及防褐化的方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)外植体的消毒:取剑叶龙血树种子作为外植体，先用洗洁精水溶液清洗种子表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5?Smin，然后移至超净工作台上，用75%酒精将种子浸泡30S，无菌水冲洗I遍，再用添加了 1-2滴吐温-20的10ml浓度为0.1 % HgCl2消毒8?15min，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水； (2)种子诱导:将步骤⑴得到的外植体接种到MS诱导培养基中，在培养温度为25±2°C，光照强度20?30 μmol/(m2.s)，光照时间为12h/d的条件下培养15d，种子发芽，所述种子诱导MS诱导培养基为MS基本培养基中加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.lmg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8 ； (3)芽诱导获得愈伤组织:将步骤(2)中得到的无菌芽置于MS诱导培养基中，在培养温度25±2°C，光照强度20?30 μ mol/ (m2 ?s)，光照时间为1h/d的条件下培养7d开始萌发，15d便形成愈伤组织，所述芽诱导MS诱导培养基为MS基本培养基中加入0.1?2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05?0.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.1?1.0mg/L的萘乙酸NAA,0.1?1.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸2，4_D，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8 ； (4)愈伤组织增殖培养:将步骤(3)中得到的愈伤组织置于MS增殖培养基中，培养温度25±2°C，光照强度20?30 μ mol/(m2 *s),MS增殖培养基为MS基本培养基中加入0.1?1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5?2.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.1?0.5mg/L的激动素KT, 30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8 ； (5)防褐化培养:将步骤(4)中得到的愈伤组织置于MS防褐化培养基中，在培养温度25±2°C，光照强度20?30 μ mol/ (m2.s)，光照时间为10h/d的条件下培养分别培养40d，MS防褐化培养基为MS基本培养基中加入防褐添加剂20?100mg/L的VC，0.5?2.0g/L的活性炭，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
【文档编号】A01H4/00GK104472362SQ201410735185
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】韦莹, 韦坤华, 李翠, 李林轩, 王一诺, 黄雪彦, 缪剑华, 王晓峰 申请人:广西壮族自治区药用植物园