一种紫花杯冠藤组培快繁的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种紫花杯冠藤组培快繁的方法。
【背景技术】
[0002]紫花杯冠藤(Cynanchumpurpureum)是萝蘑科鹳绒藤属的植物，分布在俄罗斯、朝鲜以及中国大陆的河北等地，生长于海拔100米至670米的地区，一般生长在山地林中，属于直立草本植物，略为分枝而互生，茎被疏长柔毛，干后中空。花期5-6月，果期6月。
[0003]绒藤属植物在抗肿瘤、免疫调节、抗氧化以及镇痛、镇静、抗炎等方面具有较高的药用价值，很早就有人从中分离出C21留体类、留体类生物碱、黄酮类、萜类、苯类衍生物以及脂肪烷和脂肪酸类化合物等多种化学成分;对开发新药和寻找新药源都具有很大的现实意义。目前对于紫花杯冠藤的研究较少，更没有关于紫花杯冠藤组织培养方面的研究。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种紫花杯冠藤组培快繁的方法，能够快速建立起紫花杯冠藤的组培快繁体系，可以实现紫花杯冠藤的快速增殖。
[0005]为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0006]—种紫花杯冠藤组培快繁的方法，包括如下步骤:
[0007](I)外植体的选择及处理:选用带有腋芽的野外植株，用干净的剪刀剪下带有2个腋芽的茎段，把茎段用干净的封口袋保存，保存时间不超过两天并且不能沾水；
[0008](2)外植体的消毒:把步骤(I)得到的茎段放在烧杯中，先加入2?4滴洗洁精，再加水冲洗2?3次至无泡沫，冲洗时间不能过长以免造成二次污染，然后将其在超净台中先用体积浓度70 %的酒精浸0.5?2分钟，无菌水冲洗2?4次，用加两滴吐温的质量浓度为5 %的次氯酸钠溶液消毒3?7分钟后用无菌水洗4?6次;再用加两滴吐温的质量浓度0.1 %的升萊消毒5?15分钟，后用无菌水洗5?6次；
[0009](3)接种培养:将茎段剪成Icm左右的小段，每段带两个腋芽，将其接种到接种培养基上;
[0010](4)继代增殖培养:接种成功后将分化的芽接种到继代增殖培养基上进行继代增殖，每次继代30天左右；
[0011](5)生根培养:将经过继代培养的分化芽转移到生根培养基上诱导生根。
[0012]步骤(3)所述的接种培养基为MS+6-BA0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L。
[0013]步骤(4)所述的继代增殖培养基为MS+6-BA lmg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L。
[0014]步骤(5)所述的生根培养基为1/2MS+IBA 0.1?0.2mg/L+糖20g/L。
[0015]步骤(4)所述的继代增殖培养，如在继代过程中苗有细弱现象，则用权利要求3所述的继代增殖培养基和MS+6-BA 0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g//L培养基交替使用培养以达到壮苗目的，每30天更换一次。
[0016]优选地，步骤(3)、(4)和(5)的培养条件均为:23土 TC，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx左右，pH值为6.2。
[0017]优选地，还包括组培苗移栽，具体如下:
[0018]组培苗根长出2?3cm时出瓶，出瓶前练苗一周，先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗2d，然后解开封口膜，炼苗5d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，用多菌灵1000倍液或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，防止病害的发生，移栽到经消毒的栽培基质中，温度控制在24-26°C，湿度控制在70%左右，15d以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的50%。
[0019]优选地，所述的栽培基质用腐殖土、园土和沙按照I: 1:1的体积比混合而成。
[0020]优选地，步骤(2)所述外植体的消毒方法为:把步骤(I)得到的茎段放在烧杯中，先加入3滴洗洁净，再加水冲洗3次至无泡沫，然后将其在超净台中先用体积浓度70%的酒精浸I分钟，无菌水冲洗2次，用加入两滴吐温的质量浓度为5%的次氯酸钠消毒5分钟后用无菌水洗5次;再用加入两滴吐温的质量浓度0.1 %的升汞消毒10分钟，后用无菌水洗6次。
[0021]本发明的有益效果是:
[0022]本发明通过系统的研究，对紫花杯冠藤各个培养阶段的培养基进行了优选，首次建立了紫花杯冠藤的组织培养体系，提供了一整套的采用紫花杯冠藤的茎段作为外植体进行培养的方法，可以生产整齐一致的紫花杯冠藤幼苗，为紫花杯冠藤的快速繁殖提供了有效的支持，为紫花杯冠藤的开发利用提供了技术保证，也为进一步探索紫花杯冠藤的基因工程、拓宽外植体材料等奠定了基础。
[0023]并且本发明培养过程速度快，再生频率较高，扩繁系数高达40倍以上，并且变异率较低，周期相对较短，能较好地保持紫花杯冠藤的遗传稳定性。
[0024]培养的组培苗移栽成活率高，达到85%以上。
【附图说明】
[0025]图1是本发明紫花杯冠藤经过继代增殖培养出来的苗生长状况。
[0026]图2是本发明紫花杯冠藤的生根情况。
[0027]图3是生根培养基激素过量时紫花杯冠藤的生长状况。
【具体实施方式】
[0028]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0029]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030]实施例1
[0031]—种紫花杯冠藤组培快繁的方法，包括如下步骤:
[0032](I)外植体的选择及处理:选用带有腋芽的野外植株，野外采集外植体应避免二次污染，用干净的剪刀剪下带有2个腋芽的茎段，把茎段用干净的封口袋保存，保存时间不超过两天并且不能沾水；
[0033](2)外植体的消毒:把步骤(I)得到的茎段放在烧杯中，先加入3滴洗洁精，再加水冲洗3次至无泡沫，然后将其在超净台中先用体积浓度为70%的酒精浸I分钟，无菌水冲洗2次，用加入两滴吐温的有效氯浓度为5%的次氯酸钠消毒5分钟后用无菌水洗5次;再用加入两滴吐温的质量浓度0.1 %的升汞消毒10分钟，后用无菌水洗6次。
[0034](3)接种培养:将茎段剪成Icm左右的小段，每段带两个腋芽，将其接种到接种培养基(MS+6-BA0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L)上;培养约2_5天左右开始生长；
[0035](4)继代增殖培养:接种成功后将分化的芽接种到继代增殖培养基(MS+6-BAlmg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L)上进行继代增殖，每次继代30天左右;生长情况见图1，从图1可以看出，经过继代增殖的紫花杯冠藤生长状况良好，增殖系数平均超过40。
[0036](5)生根培养:将经过继代培养的分化芽转移到生根培养基(1/2MS+IBA 0.lmg/L+糖20g/L)上诱导生根，约20天左右生根，经过30天左右，其生根情况如图2所示，从图2可以看出，其生根状况良好，可以继续进行组培苗的移栽。
[0037](6)组培苗移栽:组培苗根长出2?3cm时出瓶，出瓶前练苗一周，先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗2d，然后解开封口膜，炼苗5d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，用多菌灵1000倍液或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，防治病害的发生，移栽到经消毒的栽培基质(腐殖土、园土和沙按照1:1:1的体积比混合而成)中，温度控制在24-26 0C，湿度控制在70 %左右，15d以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的50% ο最终的移栽成活率达89%。
[0038]上述紫花杯冠藤组培快繁的方法中，步骤(3)、(4)和(5)的培养条件均为:23± I0C，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx左右，pH值为6.2。
[0039]实施例2
[0040]—种紫花杯冠藤组培快繁的方法，包括如下步骤:
[0041 ] (I)外植体的选择及处理:选用带有腋芽的野外植株，野外采集外植体应避免二次污染，用干净的剪刀剪下带有2个腋芽的茎段，把茎段用干净的封口袋保存，保存时间不超过两天并且不能沾水；
[0042](2)外植体的消毒:把步骤(I)得到的茎段放在烧杯中，先加入2滴洗洁精，再加水冲洗3次至无泡沫，冲洗时间不能过长以免造成二次污染，然后将其在超净台中先用体积浓度70%的酒精浸2分钟，无菌水冲洗4次，用加两滴吐温的有效氯质量浓度5%的次氯酸钠消毒7分钟后用无菌水洗4次;再用加两滴吐温的质量浓度为0.1 %的升汞消毒5分钟，后用无菌水洗5次；
[0043](3)接种培养:将茎段剪成Icm左右的小段，每段带两个腋芽，将其接种到接种培养基(MS+6-BA0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L)上;培养约2_5天左右开始生长；
[0044](4)继代增殖培养:接种成功后将分化的芽接种到继代增殖培养基上进行继代增殖，在继代过程中如有苗有细弱现象，则采用MS+6-BAlmg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g//L培养基和MS+6-BA0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g//L培养基交替使用培养以达到壮苗目的，每30天更换一次；
[0045](5)生根培养:将经过继代培养的分化芽转移到生根培养基(1/2MS+IBA 0.2mg/L+糖20g/L)上诱导生根，约20天左右生根，当根生长到3cm左右时出瓶，根生长过长、生根时间过长都会影响移栽成活。
[0046](6)组培苗移栽:组培苗根长出2cm时出瓶，出瓶前练苗一周，先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗2d，然后解开封口膜，炼苗5d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，用多菌灵1000倍液或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，防治病害的发生，移栽到经消毒的栽培基质(腐殖土、园土和沙按照1:1:1的体积比混合而成)中，温度控制在24-26°C，湿度控制在70%左右，15d以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的50 %，移栽成活率为85 %。
[0047]上述紫花杯冠藤组培快繁的方法中，步骤(3)、(4)和(5)的培养条件均为:23± I0C，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx左右，pH值为6.2。
[0048]对比例I
[0049]除了生根培养基的激素IBA的用量为0.3mg/L外，其余同实施例1。最终培养得到的组培苗生长状况见图3。
[0050]发明人经研究发现，生根培养基的激素IBA的用量超过0.2mg/L时，会长出较大的愈伤组织，并且生根较少，即使生根，也是附着在愈伤组织上，当出瓶时，所生的根还是留在培养基上，相当于移栽的苗不具有根，发明人经过筛选，选择了激素IBA的用量为0.1?
0.2mg/L，可以有效的促进生根。
【主权项】
1.一种紫花杯冠藤组培快繁的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)外植体的选择及处理:选用带有腋芽的野外植株，用干净的剪刀剪下带有2个腋芽的茎段，把茎段用干净的封口袋保存，保存时间不超过两天并且不能沾水； (2)外植体的消毒:把步骤(I)得到的茎段放在烧杯中，先加入2?4滴洗洁精，再加水冲洗2?3次至无泡沫，冲洗时间不能过长以免造成二次污染，然后将其在超净台中先用体积浓度70%的酒精浸0.5?2分钟，无菌水冲洗2?4次，用加两滴吐温的质量浓度为5%的次氯酸钠溶液消毒3?7分钟后用无菌水洗4?6次;再用加两滴吐温的质量浓度0.1 %的升汞消毒5?15分钟，后用无菌水洗5?6次； (3)接种培养:将茎段剪成Icm左右的小段，每段带两个腋芽，将其接种到接种培养基上； (4)继代增殖培养:接种成功后将分化的芽接种到继代增殖培养基上进行继代增殖，每次继代30天左右； (5)生根培养:将经过继代培养的分化芽转移到生根培养基上诱导生根。2.根据权利要求1所述的紫花杯冠藤组培快繁的方法，其特征在于，步骤(3)所述的接种培养基为MS+6-BA 0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L。3.根据权利要求1所述的紫花杯冠藤组培快繁的方法，其特征在于，步骤(4)所述的继代增殖培养基为MS+6-BA lmg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/L。4.根据权利要求1所述的紫花杯冠藤组培快繁的方法，其特征在于，步骤(5)所述的生根培养基为 1/2MS+IBA 0.1?0.2mg/L+糖20g/L。5.根据权利要求1所述的紫花杯冠藤组培快繁的方法，其特征在于，步骤(4)所述的继代增殖培养，如在继代过程中苗有细弱现象，则用权利要求3所述的继代增殖培养基和MS+6-BA 0.05mg/L+IBA 0.lmg/L+糖30g/U:咅养基交替使用培养以达到壮苗目的，每30天更换一次。6.根据权利要求1或5所述的紫花杯冠藤组培快繁的方法，其特征在于，步骤(3)、(4)和(5)的培养条件均为:23± 1°C，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx左右，pH值为6.2。7.根据权利要求1所述的紫花杯冠藤组培快繁的方法，其特征在于，还包括组培苗移栽，具体如下: 组培苗根长出2?3cm时出瓶，出瓶前练苗一周，先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗2d，然后解开封口膜，炼苗5d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，用多菌灵1000倍液或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，防止病害的发生，移栽到经消毒的栽培基质中，温度控制在24-26°C，湿度控制在70%左右，15d以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的50%。8.根据权利要求7所述的紫花杯冠藤组培快繁的方法，其特征在于，所述的栽培基质用腐殖土、园土和沙按照I: 1:1的体积比混合而成。9.如权利要求1所述的紫花杯冠藤组培快繁的方法，其特征在于，步骤(2)所述外植体的消毒方法为:把步骤(I)得到的茎段放在烧杯中，先加入3滴洗洁净，再加水冲洗3次至无泡沫，然后将其在超净台中先用体积浓度70 %的酒精浸I分钟，无菌水冲洗2次，用加入两滴吐温的质量浓度为5%的次氯酸钠消毒5分钟后用无菌水洗5次;再用加入两滴吐温的质量浓度0.1 %的升汞消毒10分钟，后用无菌水洗6次。
【专利摘要】本发明涉及一种紫花杯冠藤组培快繁的方法，属于组织培养领域，包括以下步骤：外植体的选择及处理、外植体的消毒、接种培养、继代增殖培养、生根培养。本发明培养方法速度快，再生频率较高，扩繁系数高达40倍以上，并且变异率较低，周期相对较短，能较好地保持紫花杯冠藤的遗传稳定性。培养的组培苗移栽成活率高，达到85％以上。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105706925
【申请号】CN201610073227
【发明人】孙国峰, 李晓东, 林秦文, 王亮生, 吴东启
【申请人】中国科学院植物研究所