一种乌桕不定根离体再生的方法与流程

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种乌桕不定根离体再生的方法。

背景技术：

乌桕(SapiumsebiferumRoxb.)与油桐、油茶、核桃并列为我国四大木本油料植物。为大戟科(Euphorbiaceae)乌桕属(Sapium)落叶乔木，为我国原生油料树种，在中国已有1400年的栽培史。此外，乌桕树姿优美，叶形秀丽，入秋后叶色呈现红、橙、黄、紫等颜色，集观果、观叶、观型与一身，广泛分布于中国、日本、印度等热带、亚热带地区。乌桕种子既含油又含脂。榨出的油分为桕脂和梓油。桕脂是我国传统出口物质和重要的工业原料，是肥皂、胶片、塑料薄膜、蜡纸、护肤脂、防锈涂剂、固体酒精和高级香料等的主要原料；桕脂中富含POP，也是生产类可可脂的理想原料。梓油是理想的生物柴油原料油。因此，利用乌桕作为我国生物质能源开发和景观应用的候选种质资源，不仅有利于缓解我国的能源问题，也是我国经济发展和环境优化的需要。

由于采用传统种苗繁育技术，很难满足乌桕规模化种植和遗传改良的需要。随着生物技术的发展，植物组织培养技术因其繁育周期短，繁殖系数大，在林木优良基因型快速繁殖、遗传改良、品种保存等方面呈现出巨大的应用潜力。目前，有关利用组织培养技术对乌桕进行种苗繁育的研究主要集中在以种子实生苗、幼胚或以优良株系的茎段、无菌苗叶片和叶柄为外植体。而关于利用优良株系无菌苗的不定根为外植体进行乌桕植株再生的研究尚未有报道。

本发明公开的一种以乌桕单株快繁获得的无菌苗的不定根为外植体，通过直接诱导丛生芽或间接诱导愈伤组织，获得乌桕再生植株的方法，为乌桕优良株系的快繁和诱变育种提供了新的技术路径，同时为后期乌桕的品种改良和再生机理研究奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于运用植物组织培养技术，提供一种乌桕不定根离体再生的方法。该方法利用乌桕无菌苗的不定根为外植体，通过直接诱导丛生芽和间接诱导愈伤组织建立乌桕高效再生体系。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种乌桕不定根离体再生的方法，包括如下几个步骤：

(1)取乌桕株系离体快繁所获得的无菌苗的不定根为外植体材料，切段；

(2)将多个不定根切段接种于诱导培养基中进行丛生芽或愈伤组织的诱导，形成丛生芽或愈伤组织；

(3)将步骤(2)中产生的丛生芽或愈伤组织的不定根外植体转接于增殖培养中进行丛生芽或愈伤组织的增殖；

(4)将步骤(3)中增殖后的愈伤组织切块，转接于分化培养基上进行愈伤组织的分化；

(5)将步骤(3)中的增殖后的丛生芽转接于丛生芽伸长培养基中，进行丛生芽的伸长；

(6)待丛生芽伸长后将其转到生根培养基中生根，无菌苗诱导出的不定根后，进行驯化、移栽，获得完整的乌桕再生植株。

优选地：所述的不定根为乌桕株系经过茎段快繁后，所获得的无菌苗的不定根，接种前将不定根切成0.3～0.6cm的切段备用。

优选地：所述的不定根诱导丛生芽的培养基为:MS+0.1～8.0mg/L6-BA+0.01～3.0mg/L NAA+0.01～1.0mg/LIBA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8。

优选地：所述的不定根诱导愈伤组织的培养基为：MS+0.1～4.0mg/L 6-BA+0.1～4.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8。

优选地：所述的不定根丛生芽增殖培养基为MS+0.1～3.0mg/L 6-BA+0.01～1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；所述的不定根愈伤组织的增殖培养基为MS+0.1～3.0mg/L6-BA+0.1～4.0mg/LNAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8。

优选地：所述的增殖后的愈伤组织切块是指将增殖后的愈伤组织切成(0.2～0.4cm)²大小的切块；所述的愈伤组织分化培养基为MS+0.3～3.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8。

优选地：所述的乌桕不定根愈伤组织分化的丛生芽和不定根直接诱导的丛生芽的伸长培养基为1/2MS+0.2～2.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8。

优选地：所述的不定根再生整个过程的培养条件均为培养温度为24±2℃，光照强度2000～3000lx，光照周期为14/10(光照/黑暗)。

优选地：所述诱导培养为1～2周；形成丛生芽或愈伤组织后，继续培养1～2周后，将丛生芽和愈伤组织的不定根外植体转接于增殖培养中进行丛生芽或愈伤组织的增殖；所述增殖培养为2～3周。

本发明有益效果：

其一，不定根取材于野外乌桕优良株系离体快繁所获得的无菌苗，一方面能保持母本植株的种质特性；另一方面取材方便、无污染，可以实现对野外乌桕优良单株的快繁；

其二，再生过程简单、高效,诱导率高达100％，平均每个外植体经一次增殖培养后可产生数十个不定芽。

因此，本发明所提供的一种乌桕不定根离体再生的方法，不仅为后期的乌桕优良株系的快繁提供了新的技术途径，而且为以后通过基因工程的方法对乌桕进行品种改良和再生相关机理研究提供了另一可行的技术支持。

附图说明

图1为诱导前的乌桕不定根切段

图2不定根丛生芽的诱导

图3不定根丛生芽的增殖

图4不定根愈伤组织的诱导

图5不定根愈伤组织的增殖

图6不定根愈伤组织的分化

图7不定芽的伸长

图8乌桕无菌苗的生根

图9乌桕再生植株的移栽

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

一种乌桕不定根离体再生的方法，具体操作如下：

1、对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、培养，获得伴有健壮根系的乌桕无菌苗；

2、切取第1步骤所获得的无菌苗的不定根作为外植体，将不定根切成0.3cm左右的切段，接种于丛生芽诱导培养基中，于温度为24℃，光照强度为2000lx,光照周期为14/10h(光明/黑暗)的条件下进行丛生芽的诱导，其中所述的丛生芽诱导培养基为MS+0.1mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA+0.01mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

3、光照培养1～2周后，不定根两端诱导出丛生芽，丛生芽的诱导率为73.3％，平均每个外植体产生2.1个芽；继续培养1～2周后，将产生丛生芽的不定根外植体，转接于增殖培养中进行丛生芽增殖的培养，其中所述的增殖培养基为：MS+0.1mg/L 6-BA+0.01mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

4、2～3周后，丛生芽的增殖系数高达2.3；然后将步骤3中增殖后的丛生芽转接于丛生芽伸长培养基中，进行丛生芽的伸长，其中所述的丛生芽的伸长培养基为1/2MS+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

5、培养3～4周，待丛生芽伸长到2～3cm，将伸长的芽转到添加有0.5mg/L IBA的1/2MS生根培养基进行生根，待苗长至3～4cm,伴有2～4个真叶和健壮根系的乌桕再生植株时，一方面可以继续以不定根为外植体通过直接诱导不定芽发生，对乌桕优良株系进行离体快繁研究；另一方面可以对再生的无菌苗进行驯化、移栽，获得完整的乌桕再生植株。

实施例2

一种乌桕不定根离体再生的方法，具体操作如下：

1、对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、培养，获得伴有健壮根系的乌桕无菌苗；

2、切取第1步骤所获得的无菌苗的不定根作为外植体，将不定根切成0.4cm左右的切段,接种于丛生芽诱导培养基中，于温度为25℃，光照强度为2500lx,光照周期为14/10h的条件下进行丛生芽的诱导(图1)，其中所述的丛生芽诱导培养基为MS+3.5mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA+0.75mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

3、光照培养1～2周后，不定根两端及周边诱导出丛生芽(图2)，丛生芽的诱导率高达100％，平均每个外植体产生8.3个芽；继续培养1～2周后，将产生丛生芽的不定根外植体，转接于增殖培养中进行丛生芽增殖的培养，其中所述的芽增殖培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

4、2～3周后，丛生芽的增殖系数高达4.3；然后将步骤3中增殖后的丛生芽(图3)转接于丛生芽伸长培养基中，进行丛生芽的伸长，其中所述的丛生芽的伸长培养基为1/2MS+0.3mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

5、培养3～4周，待丛生芽伸长到2～3cm(图7)，将伸长的芽转到添加有0.5mg/L IBA的1/2MS生根培养基进行生根，待苗长至3～4cm,伴有2～4个真叶和健壮根系的乌桕再生植株(图8)时，一方面可以继续以不定根为外植体通过直接诱导不定芽发生，对乌桕优良株系进行离体快繁研究；另一方面可以对再生的无菌苗进行驯化、移栽，获得完整的乌桕再生植株(图9)。

实施例3

一种乌桕不定根离体再生的方法，具体操作如下：

1、对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、培养，获得伴有健壮根系的乌桕无菌苗；

2、切取第1步骤所获得的无菌苗的不定根作为外植体，将不定根切成0.6cm左右的切段,接种于丛生芽诱导培养基中，于温度为26℃，光照强度为3000lx,光照周期为14/10h的条件下进行丛生芽的诱导，其中所述的丛生芽诱导培养基为MS+8.0mg/L 6-BA+3.0mg/L NAA+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

3、光照培养1～2周后，不定根两端及周边诱导出丛生芽，丛生芽的诱导率为83.4％，平均每个外植体产生4.3个芽；继续培养1～2周后，将产生丛生芽的不定根外植体，转接于增殖培养中进行丛生芽增殖的培养，其中所述的增殖培养基为：MS+3.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

4、2～3周后，丛生芽的增殖系数高达3.1；然后将步骤3中增殖后的丛生芽转接于丛生芽伸长培养基中，进行丛生芽的伸长，其中所述的丛生芽的伸长培养基为1/2MS+2.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

5、培养3～4周，待丛生芽伸长到2～3cm，将伸长的芽转到添加有0.5mg/LIBA的1/2MS生根培养基进行生根，待苗长至3～4cm，伴有2～4个真叶和健壮根系的乌桕再生植株时，一方面可以继续以不定根为外植体通过直接诱导不定芽发生，对乌桕优良株系进行离体快繁研究；另一方面可以对再生的无菌苗进行驯化、移栽，获得完整的乌桕再生植株。

实施例4：

一种乌桕不定根离体再生的方法，具体操作如下：

1、对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、培养，获得伴有健壮根系的乌桕无菌苗；

2、切取第1步骤所获得的乌桕无菌苗的不定根作为外植体，将不定根切成0.3cm左右的切段,接种于愈伤组织诱导培养基中，于温度为24℃，光照强度为2000lx,光照周期为14/10h的条件下进行愈伤组织的诱导，其中所述的愈伤组织诱导培养基为MS+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

3、培养2～3周后，不定根的切口处及周边产生淡黄色的愈伤组织，且愈伤组织的诱导率高达78％；继续培养2～3周后，将产生愈伤组织转接于增殖培养中，进行增殖培养，其中所述的愈伤组织增殖培养基为：MS+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

4、光照增殖培养2～4周后，将增殖后的愈伤组织切成0.2×0.4cm²大小，转接于分化培养基上进行愈伤组织的分化研究，其中所述的愈伤组织分化培养基为MS+0.3mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

5、培养3～4周后，愈伤组织的分化率高达87.5％，且平均每个愈伤组织切块产生7.6个不定芽；将步骤4中的愈伤组织分化所获得的丛生芽丛，转接于丛生芽伸长培养基中，进行丛生芽的伸长，其中所述的丛生芽的伸长培养基为：1/2MS+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

6、待丛生芽伸长到2～3cm，将伸长的芽转到添加有0.5mg/L IBA的1/2MS生根培养基进行生根，待苗长至3～4cm,伴有2～4个真叶和健壮根系的乌桕再生植株时，一方面可以继续以不定根为外植体通过诱导愈伤组织途径对乌桕优良株系进行离体快繁研究；另一方面可以对再生的无菌苗进行驯化、移栽，获得完整的乌桕再生植株。

实施例5：

一种乌桕不定根离体再生的方法，具体操作如下：

1、对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、培养，获得伴有健壮根系的乌桕无菌苗；

2、切取第1步骤所获得的乌桕无菌苗的不定根作为外植体，将不定根切成0.5cm左右的切段,接种于愈伤组织诱导培养基中，于温度为25℃，光照强度为2500lx,光照周期为14/10h的条件下进行愈伤组织的诱导(图4)，其中所述的愈伤组织诱导培养基为MS+2.5mg/L 6-BA+3.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

3、培养2～3周后，不定根的切口处及周边产生淡黄色的愈伤组织，且愈伤组织的诱导率高达100％；继续培养2～3周后，将产生愈伤组织(图4)转接于增殖培养中，进行愈伤组织增殖培养，其中所述的愈伤组织增殖培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+2.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

4、光照增殖培养2～4周后，将增殖后的愈伤组织(图5)切成0.3×0.4cm²大小，转接于分化培养基上进行愈伤组织的分化研究，其中所述的愈伤组织分化培养基为MS+1.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

5、培养3～4周后，愈伤组织的分化率高达97.3％，且平均每个愈伤组织切块产生17.6个不定芽；将步骤4中的愈伤组织分化所获得的丛生芽丛(图6)，转接于丛生芽伸长培养基中，进行丛生芽的伸长，其中所述的丛生芽的伸长培养基为：1/2MS+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

6、待丛生芽伸长到2～3cm，将伸长的芽转到添加有0.5mg/L IBA的1/2MS生根培养基进行生根，待苗长至3～4cm,伴有2～4个真叶和健壮根系的乌桕再生植株时，一方面可以继续以不定根为外植体通过诱导愈伤组织途径对乌桕优良株系进行离体快繁研究；另一方面可以对再生的无菌苗进行驯化、移栽，获得完整的乌桕再生植株。

实施例6：

一种乌桕不定根离体再生的方法，具体操作如下：

1、对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、培养，获得伴有健壮根系的乌桕无菌苗；

2、切取第1步骤所获得的乌桕无菌苗的不定根作为外植体，将不定根切成0.5cm左右的切段,接种于愈伤组织诱导培养基中，于温度为26℃，光照强度为3000lx,光照周期为14/10h的条件下进行愈伤组织的诱导，其中所述的愈伤组织诱导培养基为MS+4.0mg/L 6-BA+4.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

3、培养2～3周后，不定根的切口处及周边产生淡黄色的愈伤组织，且愈伤组织的诱导率高达100％；继续培养2～3周后，将产生愈伤组织转接于增殖培养中，进行增殖培养，其中所述的愈伤组织增殖培养基为：MS+3.0mg/L 6-BA+4.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

4、光照增殖培养2～4周后，将增殖后的愈伤组织切成0.4×0.4cm²大小，转接于分化培养基上进行愈伤组织的分化研究，其中所述的愈伤组织分化培养基为MS+3.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

5、培养3～4周后，愈伤组织的分化率高达77.3％，且平均每个愈伤组织切块产生4.6个不定芽；将步骤4中的愈伤组织分化所获得的丛生芽丛，转接于丛生芽伸长培养基中，进行丛生芽的伸长，其中所述的丛生芽的伸长培养基为：1/2MS+2.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH＝5.8；

6、待丛生芽伸长到2～3cm，将伸长的芽转到添加有0.5mg/L IBA的1/2MS生根培养基进行生根，待苗长至3～4cm,伴有2～4个真叶和健壮根系的乌桕再生植株时，一方面可以继续以不定根为外植体通过诱导愈伤组织途径对乌桕优良株系进行离体快繁研究；另一方面可以对再生的无菌苗进行驯化、移栽，获得完整的乌桕再生植株。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。