专利名称：乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法
技术领域：
本发明涉及乌桕组织培养获得高频率不定芽植株再生的技术方法，属于生物技术领域，专用于中国原产乌桕试管苗微繁殖和体细胞突变体筛选，并适用于农杆菌介导法基因转化。
背景技术：
乌桕(Sapium Sebiserum)为大戟科乌桕属的落叶乔木，它是我国七大秋季观赏红叶景区中林相的主要组成树种。乌桕的叶子是染丝织品的一种黑色染料。叶的浸出液是一种土农药，用来杀灭棉蚜等害虫，还可防治稻热病，乌桕也是我国特有的油用经济树种，它种子表面附有一层白色蜡质，叫做“皮油”，可以用作蜡烛、肥皂的原料，制造蜡纸、护肤脂、固体酒精、高级香料和金属防锈涂料等；而用种子榨的油叫梓油，它的物理化学性质可跟桐油媲美。榨油后的乌桕子饼可作饲料，也是一种优质有机肥料。最近的研究发现它对二氧化硫、氟化氢和氯气抗性均强，也是很好的净化环境的树种，研究表明乌桕还是一种理想的生物质能源作物，可见，乌桕是一种具有多种经济用途和巨大价值的观赏能源兼优的高效经济植物，国内外种植面积有迅速扩大的趋势。但由于乌桕是两种基因型间的异花授粉植物，在长期反复异花授粉过程中，使得当今自然分布和栽培的品种都是杂种，有性繁殖不能充分固定和利用杂种优势，再加上它的果皮坚硬，它生理和环境的强迫休眠特性，繁育周期长，自然结果需要4～5年以上。自然开花或人工诱导其开花，均由于种子成熟期不一、易于落粒和发芽率极低，在生产上只能采用种茎无性繁殖的方法提供种苗，成活率只有30％，而且长期的扦插繁殖容易造成真菌与病毒的累积，导致品种退化，严重地影响了其大面积推广和其他经济用途的研究。
有关乌桕微繁的研究最早见于印度科学家乌桕芽微繁的报告(1997)，主要通过腋芽再生，经10个月繁殖成苗，但其中没有涉及繁殖系数和成活率的报道；国内韩珊等(2006a)报道，以红叶乌桕新抽出的幼嫩叶片为材料，进行组织培养，已成功培育出试管苗并移栽至大田，移栽成活率为76％。韩珊等(2006b)报道，以带芽茎段、茎尖做外植体，通过腋芽生枝，再生出植株。结果表明①外植体用升汞分两次共处理8min，污染率低；②启动培养以MS+6-BA 1.0mg/L+2，4-D 0.05mg/L+NAA 0.1mg/L为最佳配方；③接种后先进行暗培养1周，启动较快；④继代培养以MS+6-BA1.0mg/L+IBA 0.1mg/L；⑤生根诱导以1/2MS+NAA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L效果最好，其生根率为87.6％；⑥生根苗移栽到珍珠岩∶蛭石∶河沙＝3∶2∶1的育苗基质中，成活率为83.2％，且不论它在我国的适应性，上述方法均是用带芽的组织为外植体，其生根和移栽成活率都不高，繁殖系数没有增加，而且通过芽诱导的植株也会随扩繁代数的增加其分化再生能力逐渐减弱，而涉及我国原产乌桕离体培养的报道极少，也未见相关的专利技术。迄今为止尚未见国内外通过不定芽诱导的高频率乌桕组织培养植株再生技术的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对乌桕自然繁殖周期长，长期反复异花授粉过程中，容易影响品种品质，且自然开花或人工诱导其开花，均由于种子成熟期不一、易于落粒和发芽率极低，而采用种茎无性繁殖的方法成活率低，长期的扦插繁殖容易造成真菌与病毒的累积，导致品种退化的问题，以及已有的通过腋芽生枝的乌桕微繁技术尚存在的优良品种变异、繁殖系数低以及成活率不高等问题，需要提供一种通过不同的外植体，扩大繁殖母体以及大幅度提高繁殖系数的乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法。
本发明的目的是这样实现的一种乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法，其特征在于取乌桕种子去除种皮，表面消毒后接种到种子发芽培养基中，每50ml的三角瓶中放入1粒种子，置于培养室培养，经过16～20d，长出完整的乌桕植株；在无菌条件下，沿乌桕种子苗的纵向一分为二分割获得子叶块、含未展开真叶的顶芽以及横向分割获得下胚轴切段和根切段，将它们分别接种于子叶、顶芽、下胚轴以及根不定芽诱导培养基，置于培养室培养，20d后获得嫩绿色不定芽丛；将嫩绿色不定芽丛移入不定芽伸长培养基，置于培养室生长20～25d后，长出2～3cm高的具展开3～5片真叶的健壮幼苗；再转入幼苗扩繁培养基置于培养室进行扩大繁殖，14～21d后将经扩繁的幼苗转接于生根培养基置于培养室，12～15d长成根系发达的健壮试管植株，最后移栽到菜园土经湿热高压灭菌的营养钵中在室外自然光照条件下练苗，得到乌桕的健壮苗；培养室的温度为26℃～28℃，每天由散射光照14～16h。
在本发明中所述的表面消毒是指用75％的乙醇表面消毒1min，再用10％的H2O2双氧水消毒30min，然后用无菌水冲洗三遍；所述的下胚轴和根切段的长度为5mm；所述培养室的散射光的光强为2000lux。
在本发明中所述的乌桕种子为中国原产的乌桕种子；基本培养基为含有质量比3％的蔗糖和质量比0.8％的琼脂条的WPM；所述的种子发芽培养基采用基本培养基WPM；所述的不定芽诱导培养基、不定芽伸长培养基、幼苗扩繁培养基均以基本培养基WPM为基础；不定芽诱导培养基的WPM中包括添加量为0.2～3.0mg/L的6-BA，其中，子叶、顶芽、下胚轴的不定芽诱导培养基还包括添加量为0.1～0.5mg/L的IBA，根不定芽诱导培养基中还包括添加量为0.1～0.5mg/L的IBA或包括添加量为0.5mg/L的NAA；不定芽伸长培养基为WPM+0.1mg/LIBA+0.2mg/L6-BA；幼苗扩繁培养基为WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA+0.2mg/L 6-BA+5.0mg/L Vc+5.0mg/L AgNO3；所述的生根培养基为含有质量比3％的蔗糖和质量比0.8％的琼脂条的1/2MS，并附加0.5mg/L IBA；上述各种培养基均需要在高压灭菌前用氢氧化钾调整pH值至5.8。
在本发明中所述的子叶不定芽诱导培养基WPM+0.2mg/L IBA+1.0mg/L KT+2.0mg/L 6-BA；所述的顶芽不定芽诱导培养基WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA+0.2mg/L 6-BA；所述的下胚轴不定芽诱导培养基WPM+0.2～0.5mg/L IBA+0.5～2.0mg/L KT+2.0～3.0mg/L 6-BA，或WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA+0.2mg/L 6-BA；所述的根不定芽诱导培养基WPM+0.5mg/L NAA+3.0mg/L 6-BA，或WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA+0.2mg/L 6-BA，或WPM+0.5mg/L IBA+0.5mg/L KT+3.0mg/L 6-BA。
本发明的优点在于采用人工诱导不定芽分化的方法，选取中国原产乌桕无菌种子苗的子叶、顶芽、下胚轴和根为材料，通过激素调控，在离体培养条件下，有效地解决了乌桕在组织培养过程中由于植株生长缓慢，植株根分化缓慢和移栽成活率低的难题。本发明通过子叶、下胚轴、顶芽以及根进行不定芽的诱导，诱导率可达95％以上、绿苗生根率可达100％，移栽成活率在95％以上。
本发明的优点还在于使用本发明方法可使无菌苗的不同部位都可以诱导出高频的不定芽，并在90天内获得生长健壮的再生植株。首先可以通过无菌种子苗的培育克服我国原产乌桕常规自然繁育需要2-3年才能发芽的困难，可以当年获得无菌的乌桕种苗，使繁殖系数比自然繁育增加300％(增加3倍)，在此基础上再通过不同组织诱导不定芽，可以在90天左右同时获得一批组培种苗，这样通过增加繁育周期每年还可以增加4次扩繁，繁殖系数又可在原来300％的基础上再增加400％，通过子叶、下胚轴和根分别诱导不定芽，通过增加外植体母体的数量，一年可以扩繁12批次，年繁植系数增加12倍，从而不受季节和年际间的限制，大大提高了繁殖的频率，加快了繁殖的周期，有效地解决了乌桕种苗供应紧张的问题，也为开展乌桕细胞生物学和分子生物学育种提供了重要的基础条件。
图1由中国原产乌桕种子萌发的无菌苗；图2由子叶诱导的不定芽；图3由下胚轴无愈伤组织直接分化出不定芽丛诱导的不定芽；图4由下胚轴通过愈伤组织分化出不定芽丛诱导的不定芽；图5由根无愈伤组织直接分化出不定芽丛诱导的不定芽；
图6由根通过愈伤组织分化出不定芽丛诱导的不定芽；图7由种子苗顶芽诱导的不定芽和侧芽；图8不定芽丛的伸长生长；图9芽的增殖生长；图10芽的生根。
具体实施例方式
实施例1外植体材料的培育乌桕品种2006年从江苏省植物研究所引进的中国南京产的乌桕。
种子发芽培养基采用WPM，所述的WPM中加入质量比3％的蔗糖和质量比0.8％的琼脂条，并在高压灭菌前用氢氧化钾调整pH值至5.8。
将乌桕成熟的的果实去除种皮，用75％的乙醇表面消毒1min，再用10％的H2O2双氧水消毒30min，然后用无菌水冲洗三遍，接种到种子发芽培养基中，每50ml的三角瓶中放入1粒种子，培养室温度为26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养，光强为2000lux，经过16～20天，约38％乌桕种子子叶展开，有3～4片未展开真叶的顶芽，2～3cm长的下胚轴，根系亦得到迅速发育，并有侧根形成的种子苗(见图1)。
上述种子苗的子叶、顶芽、下胚轴以及根均可以作为本发明中用于不定芽诱导的外植体材料。
实施例2乌桕不同外植体不定芽的诱导培养A基本培养基WPM，蔗糖质量比3％，琼脂条质量比0.8％，pH5.8；子叶不定芽诱导培养基WPM+0.2mg/L IBA+1.0mg/L KT+2.0mg/L6-BA。
顶芽、下胚轴和根不定芽诱导培养基WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/LIAA+0.2mg/L 6-BA。
上述各培养基均需在高压灭菌前用氢氧化钾调整pH值至5.8。
培养室环境温度26℃～28℃，每天散射光照16h，光强为2000lux。
不定芽的诱导培养将无菌的乌桕种子苗，在无菌条件下，将其纵向一分为二分割获得子叶块、含未展开真叶的顶芽以及横向分割获得5mm长的下胚轴切段和根切段，将它们分别接种在相应的子叶、顶芽、下胚轴以及根不定芽诱导培养基上，21d后获得嫩绿色不定芽丛。
子叶诱导的不定芽(参见图2)，诱导率可达100％，是在一定的愈伤基础上诱导出不定芽丛，该培养基较适合乌桕突变体筛选和运用农杆菌介导法转化外源基因；下胚轴不定芽培养基WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/LIAA+0.2mg/L 6-BA是在诱导一定的愈伤组织基础上，分化不定芽丛，其中单个外植体平均肉眼可见不定芽数超过7个(参见图4)，诱导率高达100％，该培养基较适合乌桕突变体筛选和运用农杆菌介导法转化外源基因；诱导根形成不定芽的培养基WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA+0.2mg/L 6-BA诱导根产生不定芽丛主要集中在外植体两段以及较粗根系上，是在一定的愈伤基础上诱导出不定芽丛(参见图6)，不定芽诱导率达95％；而带未展开真叶的顶芽于不定芽诱导培养基培养基中，21天后基部在一定的愈伤基础上诱导出不定芽丛，其中单个外植体平均肉眼可见不定芽数超过7个(参见图7)，不定芽的诱导率可达95％，同时顶芽亦得到迅速伸长，且侧芽大量萌发，用该培养基诱导乌桕顶芽的分化是在短时间进行乌桕基础苗快速扩繁的有效途径。该培养基也适合用乌桕顶芽做外植体进行突变体筛选和运用农杆菌介导法转化外源基因。
实施例3乌桕不同外植体不定芽的诱导培养B本实施例与实施例2的区别仅在于针对无菌的乌桕种子苗的下胚轴和根切段实施不定芽高频率植株再生的过程中，选择了不同的不定芽诱导培养基，实现了无愈伤组织直接诱导出不定芽丛。
下胚轴不定芽诱导培养基WPM+0.5mg/L IBA+2.0mg/L KT+3.0mg/L6-BA。
根不定芽诱导培养基WPM+0.5mg/L NAA+3.0mg/L 6-BA。
上述培养基均需在高压灭菌前用氢氧化钾调整pH值至5.8。
将5mm长的下胚轴切段置于这种下胚轴不定芽诱导培养基，下胚轴是在两端伤口直接分化出不定芽丛，诱导率亦高达100％(参见图3)。因未经过愈伤阶段，从而降低了乌桕芽的突变率，该培养基较适合乌桕保持原种种性的扩大繁殖以及运用农杆菌介导法转化外源基因。
将5mm长的根切段置于这种根不定芽诱导培养基，未见愈伤组织直接分化出不定芽丛，不定芽诱导率达95％以上，由图5可见，不定芽不限在外植体切口端，其中细根较粗根不定芽诱导量大，因未经过愈伤阶段，该培养基较适合乌桕保持原种种性的扩大繁殖；但因不定芽不限在外植体切口处，不适于运用农杆菌介导法转化外源基因。
实施例4不定芽丛的伸长生长不定芽伸长培养基WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA+0.2mg/L 6-BA，培养基需在高压灭菌前用氢氧化钾调整pH值至5.8。
将实施例2获得的乌桕下胚轴嫩绿色不定芽丛置于不定芽丛伸长培养基，培养室温度应该控制在26℃～28℃，光强为2000lux，每天光照16h，生长20～25d后，长出2～3cm高的具未展开3～5片真叶的健壮幼苗(参见图8)。
实施例5芽的增殖生长与生根幼苗扩繁培养基WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA+0.2mg/L 6-BA+5.0mg/L Vc+5.0mg/LAgNO3。
幼苗生根培养基1/2MS培养基，培养基含有质量比3％的蔗糖和质量比0.8％的琼脂条，附加0.5mg/L IBA。
上述培养基均需在高压灭菌前用氢氧化钾调整pH值至5.8。
将实施例4获得的2～3cm高的3～5片真叶的健壮幼苗转入幼苗扩繁培养基进行扩大繁殖，培养室温度应该控制在26℃～28℃，光强为2000lux，每天光照14～16h，在散射光下生长14～21d后，使健壮幼苗的真叶展开，同时诱导大量的侧芽萌发，且枝条健壮，叶色深绿，常大，增殖率达5倍以上(参见图9)，该培养既可保持原芽的种性，又可得到迅速增殖。
将具有3～5片展开真叶的增殖芽转接于生根培养基上，培养室温度应该控制在26℃～28℃，光强为2000lux，每天光照14～16h，在散射光下生长15d，皆可获得根系发达的试管植株(图10)。最后移栽到菜园土经湿热高压灭菌的营养钵中在室外自然光照条件下练苗，移栽成活率可达95％以上。
实施例6不同培养基对乌桕组织培养的影响选择的培养基的组合见表1表1
注WPM中含有质量比3％的蔗糖和质量比0.8％的琼脂条。
不同培养基对不同外植体不定芽诱导的影响，见表2表2
注培养21d的平均数不同培养基组分对不定芽丛的伸长生长的影响参见表3表3
不同增殖培养对植株生长的影响参见表4
表4
注培养21d的平均数上述各实施例不是对本发明的具体限制，可以在权利要求限定的范围内配制各种培养基，通过乌桕种子培育外植体材料，利用子叶、顶芽、下胚轴以及根在不定芽诱导培养基中诱导不定芽，然后通过不定芽在相应的培养基中伸长、幼苗扩繁、生根，最后移栽到菜园土经湿热高压灭菌的营养钵中在室外自然光照条件下练苗，得到乌桕的健壮苗。在本发明涉及的各种培养基中，IBA吲哚丁酸；IAA吲哚乙酸；KT细胞分裂素；6-BA6-苄基氨基嘌呤；Vc抗坏血酸；AgNO3硝酸银；NAA萘乙酸。
权利要求
1.一种乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法，其特征在于取乌桕种子去除种皮，表面消毒后接种到种子发芽培养基中，每50ml的三角瓶中放入1粒种子，置于培养室培养，经过16～20d，长出完整的乌桕植株；在无菌条件下，沿乌桕种子苗的纵向一分为二分割获得子叶块、含未展开真叶的顶芽以及横向分割获得下胚轴切段和根切段，将它们分别接种于子叶、顶芽、下胚轴以及根不定芽诱导培养基，置于培养室培养，20d后获得嫩绿色不定芽丛；将嫩绿色不定芽丛移入不定芽伸长培养基，置于培养室生长20～25d后，长出2～3cm高的具展开3～5片真叶的健壮幼苗；再转入幼苗扩繁培养基置于培养室进行扩大繁殖，14～21d后将经扩繁的幼苗转接于生根培养基置于培养室，12～15d长成根系发达的健壮试管植株，最后移栽到菜园土经湿热高压灭菌的营养钵中在室外自然光照条件下练苗，得到乌桕的健壮苗；培养室的温度为26℃～28℃，每天由散射光照14～16h。
2.根据权利要求1所述的乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法，其特征在于所述的表面消毒是指用75％的乙醇表面消毒1min，再用10％的H2O2双氧水消毒30min，然后用无菌水冲洗三遍；所述的下胚轴和根切段的长度为5mm；所述的培养室的散射光的光强为2000lux。
3.根据权利要求1所述的乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法，其特征在于所述的乌桕种子为中国原产的乌桕种子；基本培养基为含有质量比3％的蔗糖和质量比0.8％的琼脂条的WPM；所述的种子发芽培养基采用基本培养基WPM；所述的不定芽诱导培养基、不定芽伸长培养基、幼苗扩繁培养基均以基本培养基WPM为基础；不定芽诱导培养基的WPM中包括添加量为0.2～3.0mg/L的6-BA，其中，子叶、顶芽、下胚轴的不定芽诱导培养基还包括添加量为0.1～0.5mg/L的IBA，根不定芽诱导培养基中还包括添加量为0.1～0.5mg/L的IBA或包括添加量为0.5mg/L的NAA；不定芽伸长培养基为WPM+0.1mg/LIBA+0.2mg/L 6-BA；幼苗扩繁培养基为WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA+0.2mg/L 6-BA+5.0mg/L Vc+5.0mg/L AgNO3；所述的生根培养基为含有质量比3％的蔗糖和质量比0.8％的琼脂条的1/2MS，并附加0.5mg/L IBA；上述各种培养基均需要在高压灭菌前用氢氧化钾调整pH值至5.8。
4.根据权利要求3所述的乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法，其特征在于所述的子叶不定芽诱导培养基WPM+0.2mg/L IBA+1.0mg/LKT+2.0mg/L 6-BA；所述的顶芽不定芽诱导培养基WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA+0.2mg/L 6-BA；所述的下胚轴不定芽诱导培养基WPM+0.2～0.5mg/L IBA+0.5～2.0mg/L KT+2.0～3.0mg/L 6-BA，或WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA+0.2mg/L 6-BA；所述的根不定芽诱导培养基WPM+0.5mg/L NAA+3.0mg/L 6-BA，或WPM+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA+0.2mg/L 6-BA，或WPM+0.5mg/L IBA+0.5mg/L KT+3.0mg/L 6-BA。
全文摘要
本发明涉及一种乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法，其特征在于取乌桕种子去除种皮，双氧水表面消毒后接种到种子发芽培养基中，长出完整的乌桕种子苗植株；将乌桕种子苗的纵向一分为二的子叶块、含未展开真叶的顶芽以及下胚轴和根切段，分别接种在适合顶芽、下胚轴和根等不定芽诱导培养基上，通过直接诱导不定芽或经过愈伤组织诱导获得嫩绿色不定芽丛；然后移入不定芽伸长培养基，获得伸长不定芽幼苗；再转入幼苗扩繁培养基进行扩大繁殖，将经扩繁的幼苗转接于生根培养基上，长成真叶展开且根系发达的健壮乌桕试管植株，最后移栽到室外在自然条件生长成活，得到乌桕的健壮苗。
文档编号C12N5/04GK101057556SQ20071002282
公开日2007年10月24日 申请日期2007年5月23日 优先权日2007年5月23日
发明者李霞, 何小兰, 周月兰, 刘桂华 申请人:江苏省农业科学院