专利名称：一种利用草莓花药培养进行脱毒快繁的方法
技术领域：
本发明“一种利用草莓花药培养进行脱毒快繁的方法”属于农作物快繁技术领域，专用于草莓的脱毒快繁。
背景技术：
草莓(Fragaria ananassa.Duch)是蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本植物，2n＝8x＝56，属于多倍体植物。草莓果实为小浆果，鲜艳亮丽，柔软多汁，酸甜适中，芳香浓郁，是世界上七大水果之一。由于栽培草莓具有结果期长、植株小、繁殖快、经济效益高等特点，特别是配以大棚栽培，为冬春季的果品市场增添花色品种，尤其是在元旦、春节等重大节日供应市场，因而深受生产者和消费者的喜爱很有推广意思和发展的潜力。
但草莓在生产过程中易感染病毒，从而造成草莓品种的种性退化。因此，无性繁殖数量越大，病毒传播也越快。草莓感染病毒后易出现叶片皱缩、果实畸形、品质变劣、产量下降、植株生长缓慢等退化现象。病毒是引起草莓产量下降的一个重要因素。
本方法通过花药培养的方法获得草莓再生植株，建立一种方便实用、脱毒效果好、繁殖系数高、遗传稳定性好的草莓脱毒快繁体系，从而促进草莓脱毒技术在生产上进一步应用和推广。
发明内容
技术问题本发明的目的是针对目前草莓在我国的栽培面积和范围逐年增加，因病毒侵染造成的减产和品质下降的问题日渐突出的现状，提出一种通过草莓花药培养来实现脱毒快繁的方法。
技术方案一种利用草莓花药培养进行脱毒快繁的方法，其特征在于(1)消毒处理取长度为4-6mm的草莓花蕾，在4℃冰箱冷处理72h；然后将花蕾用无菌水冲洗一次在70％酒精浸泡5s之后再用无菌水冲洗一次置于加体积比为0.1％的吐温和质量体积比为0.1％的升汞溶液中浸泡8min；最后用无菌水冲洗8-10次，用无菌吸水纸吸干花蕾表面的水；(2)愈伤组织诱导分化将消毒处理好的花蕾剥取花药，接种到MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1的愈伤组织诱导培养基中30～60d；
将愈伤组织转到MS+BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+ZT2.0mg·L-1+琼脂6.5g·L-1的分化培养基中70～90d；然后将分化培养基中获得的草莓苗转接到MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1的继代培养基上，进行继代增殖培养20～30d；(3)生根移栽草莓苗转到1/2MS+NAA0.2g·L-1+琼脂6.5g·L-1的生根培养基进行生根处理20～30d；苗木生根后，将生根植株经过室外自然条件下锻炼7-10d，移栽时开盖加水锻炼1-2d，以蛭石和珍珠岩混合体系作为移栽基质，移栽时的温度控制在20-25℃范围。
有益效果本发明针对草莓脱毒技术目前在生产上存在的问题，在前人研究的基础上，首次建立了一种方便实用、脱毒效果好、繁殖系数高、遗传稳定性好的草莓脱毒快繁体系。草莓花药培养在国内已经有不少报道，但是如何获得很高的再生率，一直以来是一个比较难以解决的问题。
本发明方法将草莓花药培养分化率提高到37.5％，现有技术提高了28.03个百分点，突破了传统分化率很低的困境。苗木生根后，移栽成活率达到90％。可作为商业用途的草莓脱毒方法在生产上直接使用，从而促进草莓脱毒技术在生产上进一步应用和推广。
四
图1低温处理不同时间对愈伤组织诱导的影响图2雪蜜分化不定芽图片五具体实施方式
(一)最佳处理参数的确定1确定最佳花蕾的前期处理以及消毒方法的确定1.1最佳方法确定的材料和方法取自田间健壮草莓花蕾，发育时期为单核靠边期(大小约为4-6mm)，在4℃冰箱冷处理0h、48h、72h、96h。冷处理结束后取出，在超净台上进行消毒处理。
消毒时间及步骤为花蕾用无菌水冲洗一次在70％酒精浸泡5、10s之后再用无菌水冲洗一次置于0.1％升汞(加吐温)浸泡5、8、12min最后用无菌水冲洗8-10次(10min)，具体处理组合(表1)。消毒之后用无菌吸水纸吸干花蕾表面的水，将消毒处理好的花蕾剥取花药，接种到MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1培养基，30d统计污染率以及诱导率。
表1 草莓花蕾不同消毒处理
1.2低温处理对愈伤组织诱导的影响从田间取来的健壮草莓植株花蕾，去除表面杂质，将一部分置于4℃冰箱，进行低温处理，处理时间分别为48h、72h、96h。剩余部分不经过低温处理直接接种到6号培养基中。花蕾在低温处理72h时花冠开始松动，但是经过检测小孢子发育时期还处于单核靠边期。由图1可以看出，所设置的四个处理中，低温处理96h后，大部分花冠松开，不能用于接种。其他三个处理均能诱导出愈伤组织，低温处理72h的花药，在培养10d时雪蜜(钱亚明，王壮伟，苏家乐，赵密珍.草莓新品种雪蜜与丰香的设施栽培试验.落叶果树，2004(6)20)3.7％开始分裂出愈伤组织。而低温处理48h在接种后10d时雪蜜1.8％产生了愈伤组织。但是不经过低温处理直接接种的花药从接种后的15d时雪蜜4.9％产生愈伤组织。因此经过一定的低温处理有利于花药发育的启动，缩短愈伤组织开始分裂的时间。所以，本研究选择接种前花蕾低温处理72h。
1.3消毒方法对愈伤组织诱导的影响本试验选取的消毒组合，在愈伤组织诱导过程中，花药污染率控制在20％左右。表2结果表明，随酒精和升汞消毒时间增长，污染率呈下降趋势。由于花药包在花蕾中，而所取得试材控制花蕾在单核靠边期，其发育时间处于花瓣还被花萼包着，其杂菌的含量相对较低，若是消毒时间太长，对花药的伤害也较大。将消毒处理过的花药接种到愈伤组织诱导培养基中，统计消毒时间对诱导率的影响结果，发现诱导率随消毒时间增长而呈下降趋势。经过6个组合统计数据来看，随着酒精消毒时间延长，污染率降低，但是愈伤组织也随之下降，所以在酒精进行表面消毒使用时间的选择上，确定为5s，而升汞消毒时间在8min，污染率控制在14％左右，而诱导率雪蜜在41.7％。综合考虑选择该组合进行消毒处理。
表2不同消毒处理对花药污染率和愈伤组织的影响
2最佳愈伤组织诱导培养基的确定2.1材料和方法以MS为基本培养基，添加6.5g·L-1的琼脂条及不同的激素及不同浓度蔗糖(表3)，pH调到5.8，高压灭菌20min。接种后进行暗处理，暗处理时间为7d，再转入光培养的培养室培养。
培养条件为温度25℃±1℃；光照时间12h光/12h暗；光照强度2000Lx。
各诱导培养基设两个重复，每个重复接种三个培养皿，每个培养皿接种花药50枚。愈伤组织诱导率统计以花药接种后30d产生愈伤组织的花药个数为准。
愈伤组织诱导率％＝产生愈伤组织的花药数/接种的花药个数×100。
表3不同诱导培养基处理
注由于IAA、KT高温分解，故采取先将培养基高温灭菌后，再加入IAA、KT分装的配制方法。
2.2不同激素组合对愈伤组织诱导率的影响本试验采用的以MS为基本培养，设计9种不同激素组合配比，20d后观察愈伤组织诱导情况。发现组合1-3培养基接种花药后第二天即出现了褐化，而且经过40d还未分裂出愈伤组织。而组合4-9已经可以肉眼看到愈伤组织，而且未发生接种花药后褐化枯死的现象。30d后统计愈伤组织诱导率，结果显示当蔗糖浓度为30g/L时，提高BA浓度而降低NAA浓度的组合4、6、9对愈伤组织形成有很好的促进作用，愈伤组织形态上表现为紧密，表面黄绿色有颗粒状，在分化阶段的分化能力强。其中组合6诱导率显著高于其他几个组合，雪蜜有87.2％分裂成愈伤组织(表4)，而且愈伤组织形态表现为致密、黄绿色，有利于植株的分化。虽然组合5表现为愈伤组织生长速度快，但质地膨松，表面色泽暗，而后表现为水渍状，没有分化能力。因此综合考虑选用组合6(MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+琼脂6.5g·L-1)为本研究愈伤组织诱导最佳激素种类和浓度的配方。
2.3不同蔗糖组合对愈伤组织诱导率的影响表4显示，在诱导率方面蔗糖浓度为30g·L-1的组合4、6、8对愈伤组织的诱导率高于同激素组合下60g·L-1的组合5、7、9。从愈伤组织的形态上看，30g·L-1组合愈伤组织生长良好，表现为黄绿色，而60g·L-1蔗糖浓度组合则表现为后期褐色，进而转为水渍状，不能分化植株。表明30g·L-1蔗糖浓度对花药的分裂启动，愈伤组织增殖都有很好的促进作用。30d统计愈伤组织在蔗糖浓度为30g·L-1，MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+琼脂6.5g·L-1培养基组合诱导率为87.2％。因此在本试验中选取添加蔗糖浓度为30g·L-1。
表4不同激素组合和蔗糖组合对愈伤组织诱导的影响
注英文字母表示不同处理差异，大写字母代表Duncan分析中差异见显著水平(0.01)，小写字母为显著水平(0.05)以下同。
3最佳再生培养基的确立3.1材料与方法将继代2次的愈伤组织转到以MS为基本培养基，添加不同激素的分化培养基，大约70d后就分化出草莓植株(表5)。
表5不同分化培养基处理
注由于ZT高温分解，故采取先将培养基高温灭菌后，再加入ZT分装的配制方法。
分化率％＝分化的愈伤组织数/接种的愈伤组织数×100。
3.2不同激素对再生的影响将愈伤组织转入MS+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1、PH＝5.8附加不同激素浓度的分化培养基中(表6)，结果显示，多数愈伤组织在分化培养基上，颜色变绿，质地变结实，愈伤组织表面呈颗粒状。随着培养时间的延长，不同分化培养基上的愈伤组织出现了不同的结果，部分愈伤组织分化出丛生不定芽(图2)；有的愈伤组织接触培养基的一面容易变褐，并逐渐死亡。本实验表明，在同样以基本培养基添加同种类激素和浓度(BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+ZT2.0mg·L-1)情况下雪蜜草莓花药愈伤组织分化率较高，达到37.5％。花药培养分化速度慢，一般在置于分化培养基上70d后才开始进入分化。由实验结果看出，当NAA浓度由0.5mg·L-1提高到1.0mg·L-1时，分化率均降低，可见草莓花药植株的分化只在外源生长素浓度很低的条件下发生。生长素浓度高，虽然愈伤组织生长速度很快，但是愈伤组织外部形态会表现出水渍状，并且随时间的推移，逐渐变为褐色，不利于再生植株的分化。从试验结果看，当其他两个激素浓度不变，随着玉米素浓度由1.5mg·L-1增加到2.0mg·L-1时，前三个处理雪蜜愈伤组织分化率由30.9％提高到37.5％，后三个处理雪蜜愈伤组织分化率由28.6％提高到3 1.7％，从而说明玉米素在芽分化过程中具有显著的促进作用。
表6不同激素浓度组合对愈伤组织分化率的影响
4最佳继代培养基的确立4.1材料和方法当分化的组培苗长至1cm左右时，小心切下接种到增殖培养基，增殖培养基选择用MS附加BA和NAA的不同浓度对比处理(表7)，增殖培养时，每种培养基设二个重复，每个重复接种五瓶，每瓶继代组培苗株数为3株，增殖培养过程中30d继代1次，统计每组处理芽增殖数量。
表7增殖培养基处理
4.2继代培养基的确定将诱导出的雪蜜草莓健壮苗转接到继代培养基上，培养30d后，调查芽的增殖情况，结果见表8。丛生芽的生长方式有两种，一种是在母株的根基部产生愈伤组织，然后在愈伤组织上直接分化出不定芽，另外一种方式是直接在母株的一个腋芽长出新的植株。在BA浓度为0.5mg·L-1时，添加NAA会增加其增殖率，增殖系数由3.9提高到4.7。当BA浓度增加时，分化率提高，同时玻璃化现象也随之出现。一般认为，培养基中BA含量的高低，直接影响玻璃化苗的发生与否，只有细胞分裂素与生长素的合理搭配，才能达到理想的生长分化效果。本研究经过综合考虑，选取激素浓度BA为0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，芽的增殖系数为4.7，与BA为0.5mg·L-1时，NAA浓度为0.0、0.05mg·L-1存在显著差异。
表8各增殖培养基的增殖效果
5试管苗生根培养基和移栽方法的确立将继代几次生长健壮的草莓花药组培苗转接接到1/2MS(大量元素减半，其他成分不变)和1/2MS+NAA0.2g·L-1培养基，30d后观察其根的生长情况。
在增殖培养基上的草莓苗，一般也会有大量的根长出，但是在增殖培养基长出的根在根基部有愈伤组织出现，移栽后会影响其成活率，因此再生植株要转到生根培养基进行生根处理。结果表明，1/2MS培养基发根晚，而且在根部会产生大量的愈伤组织，在添加了生长素后，生根早，而且生根率高，且根部愈伤组织明显减少。
移栽前，将生根植株经过光照锻炼7-10d，移栽时开盖加水锻炼1-2d，一般以蛭石和珍珠岩混合体系作为为移栽基质。移栽后注意口罩保湿，移栽时的温度控制在20-25℃范围，移栽成活率达到90％。
(二)实施例取自田间健壮雪蜜草莓花蕾，发育时期为单核靠边期(大小约为4-6mm)，在4℃冰箱冷处理72h。冷处理结束后取出，在超净台上进行消毒处理。
消毒时间及步骤为花蕾用无菌水冲洗一次在70％酒精浸泡5s之后再用无菌水冲洗一次置于0.1％升汞(加0.1％吐温)浸泡8min最后用无菌水冲洗8-10次(10min)。消毒之后用无菌吸水纸吸干花蕾表面的水，将消毒处理好的花蕾剥取花药，接种到MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1的愈伤组织诱导培养基中。
将继代2次(30d)的愈伤组织转到以MS为基本培养基，同时添加BA1.5mg·L-1、NAA0.5mg·L-1和ZT2.0mg·L-1的分化培养基中，大约70d后就分化出草莓植株。本发明方法将草莓花药培养分化率提高到37.5％，比现有技术9.47％(查中萍，柳俊，刘定富.影响草莓花药培养因素的分析.安徽农业科学，2006，34(1)24～28)提高了28.03个百分点。
将诱导出的草莓健壮苗转接到MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1继代培养基上，进行继代增殖培养2～3次。然后转到1/2MS+NAA0.2g·L-1+琼脂6.5g·L-1的生根培养基进行生根处理。
苗木生根后，将生根植株经过光照锻炼7-10d，移栽时开盖加水锻炼1-2d，一般以蛭石和珍珠岩混合体系作为为移栽基质。移栽后注意用塑料薄膜罩口保湿，移栽时的温度控制在20-25℃范围，移栽成活率达到90％。
权利要求
1.一种利用草莓花药培养进行脱毒快繁的方法，其特征在于(1)消毒处理取长度为4-6mm的草莓花蕾，在4℃冰箱冷处理72h；然后将花蕾用无菌水冲洗一次在70％酒精浸泡5s(秒)之后再用无菌水冲洗一次置于加体积比为0.1％的吐温和质量体积比为0.1％的升汞溶液中浸泡8min(分钟)；最后用无菌水冲洗8-10次，用无菌吸水纸吸干花蕾表面的水；(2)愈伤组织诱导分化将消毒处理好的花蕾剥取花药，接种到MS(QU Shen-Chun，HUANG Xiao-De，ZHANG Zhen，YAO Quan-HONG，TAO Jian-Min，QIAO Yu-Shan，ZHANG Jun-Yi.Agrobacterium-mediated transformation of Malus robusta with tomato iron transportergene[J]，Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，2005，31(3)235-240)+BA(6-苄氨基嘌呤)0.5mg·L-1+NAA(萘乙酸)2.0mg·L-1+KT(细胞激动素)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1的愈伤组织诱导培养基中30～60d(天)；将愈伤组织转到MS+BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+ZT(玉米素)2.0mg·L-1+琼脂6.5g·L-1的分化培养基中70～90d；然后将分化培养基中获得的草莓苗转接到MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1的继代培养基上，进行继代增殖培养20～30d；(3)生根移栽草莓苗转到1/2MS+NAA0.2g·L-1+琼脂6.5g·L-1的生根培养基进行生根处理20～30d；苗木生根后，将生根植株经过室外自然条件下锻炼7-10d，移栽时开盖加水锻炼1-2d，以蛭石和珍珠岩混合体系作为移栽基质，移栽时的温度控制在20-25℃范围。
全文摘要
本发明涉及“一种利用草莓花药培养进行脱毒快繁的方法”，属于生物工程技术领域。将取自田间健壮草莓花蕾，发育时期为单核靠边期(大小约为4－6mm)，在4℃冰箱冷处理72h(小时)。然后将花蕾分别用70％酒精、0.1％升汞(加吐温)消毒之后用无菌吸水纸吸干花蕾表面的水，将消毒处理好的花蕾剥取花药，接种到愈伤组织诱导培养基中，然后转到再生培养基中，再将诱导出的草莓健壮苗转接到继代培养基上，最后转到生根培养基进行生根处理。本方法将草莓花药培养分化率提高到37.5％，比现有技术提高了28.03个百分点，突破了传统分化率很低的困境。苗木生根后移栽成活率90％，从而促进草莓脱毒技术在生产上进一步应用和推广。
文档编号C12N5/04GK101049090SQ20071002280
公开日2007年10月10日 申请日期2007年5月22日 优先权日2007年5月22日
发明者乔玉山, 渠慎春, 蔡斌华, 王三红, 高志红, 徐长宝, 杨晓春, 侯喜林, 吴震 申请人:南京农业大学