专利名称：鸡痘病毒表达载体p12－18及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种有利于提高重组鸡痘病毒抵抗母源抗体干扰能力的鸡痘病毒表达载体，尤其是载体中的复制非必需区，从而提供一种能够提高重组FPV疫苗抵抗母源抗体干扰能力的方法。
背景技术：
鸡痘病毒(Fowlpox Virus，FPV)是继痘苗病毒VV之后的一种具有独特优越性和广阔应用前景的表达载体，是当今分子生物学领域的研究热点之一。禽痘病毒属痘病毒科，禽痘病毒属，鸡痘病毒是其代表种。FPV做为表达载体有其独特的优越性。其基因组庞大，长度约为VV的1.5倍，含较多的复制非必需区，可构建FPV多价和多联疫苗；FPV具有自身的酶系统和调控信号，其转录、翻译和装配均发生在胞浆中，可对外源基因的表达产物进行翻译后加工、修饰，保留其相应的生物学活性，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫；与VV相比，FPV的宿主范围较窄，仅感染禽类，不易散毒，对哺乳动物和人类无潜在的威胁；重组病毒的构建方法相对简单；表达水平较高；便于对重组鸡痘病毒免疫鸡群和自然感染鸡群进行鉴别。
近十几年来，FPV载体疫苗的研究已取得了巨大进展，有多种病原体的保护性抗原基因在FPV中得以成功表达，如MDV的gB/pp38基因、NDV的F和HN基因、IBDV的VP2/VP2-3-4基因、AIV的HA/NA/NP基因、IBV的S1基因、ALV的env基因、REV的env基因等，并在SPF鸡上有很高甚至100％的保护率。但迄今为止，重组FPV活载体疫苗在国内外尚未获得广泛应用。究其原因，主要是重组FPV疫苗的免疫效力在很大程度上受到商品鸡所携带的母源抗体的干扰，这无疑给疫苗，尤其弱毒苗和活载体疫苗的早期应用和疫情监测带来很大的困难。许多研究已经证明，针对外源蛋白的母源抗体会干扰重组FPV的免疫效力，而且母源抗体越高干扰越大。
鸡痘病毒(Fowlpox Virus，FPV)基因组庞大，长约300kb，包括约260个ORF，存在大量的复制非必需区可以做为外源基因的插入位点。构建重组FPV表达载体的第一步是要选择病毒的复制非必需区(Nonessential Region，NER)。然而，现已证实，某些复制非必需区并不是严格的复制非必需区，因为某些基因虽然是病毒在体外复制非必需的，但它们可能与病毒毒力、病毒免疫逃避或宿主范围相关，若被缺失或因插入外源基因而失活，可能导致病毒在体内的复制能力或免疫逃避能力下降，使重组FPV无法在宿主体内发挥持久而有效的免疫效力。经试验，复制非必需区FPV7S为外源基因插入位点构建了表达多种不同病原保护性抗原基因的重组FPV，在SPF鸡上均能提供100％的保护，但在有母源抗体的商品鸡上免疫效果欠佳，保护率低于50％。将FPV7S两个侧翼区的序列与Afsono等发表的美国致病株基因组的相应序列(AF198100)进行比较，发现该DNA片段共跨越FPV基因组的6个连续的编码框(ORF072-ORF077)，目的基因的插入位点位于ORF073内部。ORF073主要编码IL-18结合蛋白的类似物，IL-18bp能够抑制IL-18依赖性的IFN-γ的产生，是一种免疫调节因子。它既不是病毒的结构蛋白，也不是病毒复制、转录和翻译所必需的酶类，揭示了FPV7S适合作为转移载体复制非必需区的分子基础。但ORF073的破坏可能是影响以FPV7S为外源基因插入位点的重组FPV在有母源抗体商品鸡上免疫效力的主要原因。因此，有必要筛选适当的复制非必需区作为外源基因的插入位点，这可能是克服重组FPV母源抗体干扰的一个有效策略。克服母源抗体干扰是重组FPV疫苗研究领域亟待解决的一个难题。
发明内容
本发明目的在于设计一种有利于克服母源抗体干扰的鸡痘病毒表达载体p12-18。
本发明鸡痘病毒表达载体p12-18于2005年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO1385，其长度为10450bp，该载体以鸡痘病毒复制非必需区FPV12-18为外源基因插入位点，是一个含有鸡痘病毒复制非必需区侧翼区FPV1和FPV2的表达载体，FPV1的核苷酸长度为1863bp，FPV2的核苷酸长度为1554bp，FPV1和FPV2的DNA序列分别为FPV1gtttctaaga tcatcatgtc ctacaatttt atttctttga cgtcgtgttt atatcatttt 60ctgttttggg ataataattt tctctaatat aaaattatat attaattctt tttctatatt 120gaagtgattt aattaaagaa aatatgtaat ctttatctaa ttaggttttt ccttatctaa 180
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本发明另一目的在于设计一种能够提高重组鸡痘疫苗抵抗母源抗体干扰能力的鸡痘病毒表达载体p12-18的方法。
本发明包括以下步骤(1)定向克隆法筛选鸡痘病毒的新复制非必需区根据已发表的鸡痘病毒的基因组全序列设计两对引物P1 5’-CGTAAGACTTATCCATACCGAG-3’P2 5’-GTTTCTAAGATCATCATGTCCTAC-3’P3 5’-CTGTAGTAGTTACTACATACGCAG-3’P4 5’-AACAGAAATAGCTCCTCTCATAC-3’P1位于ORF077的内部，P2和P3均位于ORF073与ORF074两个ORF之间的间隔区，P4位于ORF071的内部。P1和P2跨幅约为1880bp，即FPV1，P3和P4跨幅约为1570bp，即FPV2。
用PCR方法分别扩增鸡痘病毒复制非必需区FPV12-18的两个侧翼区FPV1和FPV2。
(2)利用分子克隆技术将复制非必需区FPV12-18的两个侧翼区FPV1和FPV2、标记基因表达框P11-LacZ先后克隆入载体pBluescript SK(-)(以下简称pSK)，所得载体pP12与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞，转染试剂为FuGENETM6 Transfection Reagent(转染及重组病毒的筛选纯化按照转染试剂说明书进行)，重组病毒的筛选标记基因为大肠杆菌的β-半乳糖苷酶LacZ基因，经蓝斑筛选得到纯化的重组病毒载体pP12。
(3)构建鸡痘病毒表达载体p12-18将外源基因的启动子Ps插入步骤(2)中构建的载体pP12，获得一个鸡痘病毒FPV表达载体p12-18。
本发明从筛选适当FPV复制非必需区作为外源基因插入位点的角度来克服母源抗体干扰，成功地提高了重组FPV抵抗母源抗体干扰的能力。
上述步骤(3)中，将pN11S用Hind III+Sma I进行双酶切，37℃消化2h后，电泳并回收约200bp的含MCS的Ps启动子，与同时用Hind III+SmaI双酶切的载体pP12连接构建鸡痘病毒表达载体p12-18。
图1为载体pP12的构建过程。
图2为通用表达载体p12-18的构建过程图。
图3为表达新城疫病毒F基因的转移载体p1218NDF的构建图。
图4显示感染重组FPV的CEF中F基因表达产物的间接免疫荧光鉴定。
图5显示4株重组FPV在不同龄商品鸡上的4次免疫效力试验的保护率。
具体实施例方式
1、定向克隆法筛选鸡痘病毒的新复制非必需区FPV12-18病毒的增殖及基因组的提取按常规方法取9-10日龄的SPF鸡胚，制成CEF单层。接种282E4株FPV，在5％CO2，37℃的培养箱培养。待病变达80％以上弃去原培养基，细胞用PBS洗两遍后，加入适量PBS，用吸管将细胞吹下。低速离心弃上清，用少量PBS(50ml的细胞培养瓶用200μl)悬浮。提取方法参照High Pure PCRTemplate Preparation Kit说明书进行1.5ml的Eppendorf管中依次加入上述200μl样品、200μl Binding Buffer和40μl Proteinase K，混匀；72℃作用10min后，加入100μl异丙醇；将上述混合物混匀后加入特定的离心管，8000rpm离心1min，弃滤液；然后加入500μl Washing Buffer，离心，洗涤两遍；13000rpm离心10s，去除残余的液体；加入200μl Elution Buffer(70℃预热)，8000rpm1min离心至干净的Eppendorf管中，所得即为282E4株FPV基因组DNA。
PCR扩增FPV复制非必需区FPV12-18的侧翼区FPV1和FPV2根据已发表的美国致病株鸡痘病毒FPV的基因组全序列(AF198100)设计两对引物，引物表达式P1 5’-CGTAAGACTTATCCATACCGAG-3’P2 5’-GTTTCTAAGATCATCATGTCCTAC-3’P3 5’-CTGTAGTAGTTACTACATACGCAG-3’P4 5’-AACAGAAATAGCTCCTCTCATAC-3’P1位于ORF077的内部，P2和P3均位于ORF073与ORF074两个ORF之间的间隔区，P4位于ORF071的内部。P1和P2跨幅约为1880bp，即FPV1，P3和P4跨幅约为1570bp，即FPV2。
两对引物分别用于扩增鸡痘病毒FPV复制非必需区各自的两个侧翼区(FPV1和FPV2)。引物中加入了便于克隆操作的限制性酶切位点和保护性碱基。以282E4株FPV的基因组DNA为模板，用高保真PCR系统(ExpandHigh Fidelity PCR System)扩增FPV复制非必需区侧翼区FPV1和FPV2并进行序列测定。
经测定，FPV1的核苷酸长度为1863bp，DNA序列(不含引物中附加的酶切位点)为gtttctaaga tcatcatgtc ctacaatttt atttctttga cgtcgtgttt atatcatttt 60ctgttttggg ataataattt tctctaatat aaaattatat attaattctt tttctatatt 120gaagtgattt aattaaagaa aatatgtaat ctttatctaa ttaggttttt ccttatctaa 180taatagaact gtatacctgg tgatcttcct acttgattta cgtgacctaa tataattatt 240tagatattta cctgtttttc gcataaatat aattcctaaa aatattatta ttaagatatt 300aatatctatt atccatgata atatatagag aaacattata ttaatcgcca atcgaatatg 360aataacatac atagtaataa taaagatagc agttaatggc aaactaatat tattcatgat 420aactgctata aaagaagata atatagcaag atatattgaa gtgtctatca tatcttattt 480tatggataaa cctttaacgg caacttctaa gttacttatt ttttggttta ttaaactatt 540ggttttttcg tacttttctt ccaatttttt tgtatttttc tttaatttta atatctcatt 600atcatgaatg tcgtatagta ttttacttat accctcagag aagaagccgc ttcgtatctg 660atcttcatta tcagaacctt ttttaagcct cgtgcaatag gagttagaaa gataggagtt 720aagtatcttg gaaaaattaa gtgcaatact aggaaaaacc caacagataa tatgaggcac 780gagatcgata tgcacatatg ttcctacaag ttcgtattta taggcactat ttgatgctaa 840tccgatttct aaaacggctt tattatagat accgttttta tagttcaatg tttttatgag 900ttttttagat gactctagtc tacaccactg cctaaagttc ttatttccaa gatcacatat 960tttagtagca tttatatatc cgttgtattt taacatgatt acttctatgt tcgcatagtt 1020gataaagcaa aagttctcat ctatatgttt aacggtgtta ggtacaaact ccatattgta 1080atactttcat tcagaatagt attgttttta cattttttat tataaggaaa aaactggttt 1140attcattttc ttttaaccat gcatacacaa tttacaggaa ctgatacatg tttagtcatt 1200acagcattat tttcaccaag atacattatt tttttaattt ctgtgaccgt agaacagtaa 1260gattcccatc ttgactcatc aatgccctta caaggagatg tagaattagg gaatcccatg 1320cagctaatca tttgaatgta ttgtgtgtat ccatctcctt tctcagaata tctgcccaaa 1380gattctattt tactgacacc agttccatta acagggctta cttctctaat atctacccat 1440gtagttacta attcacaagc gggttcgtat aaataaacag tagtattatc attactagat 1500gtctgggtat cgtataatac agctgcatga tagtactgaa aacatgttag taacacaagt 1560atatgtgtaa cgtacataat agaaaaaagt ataatttatg ccttattttt acattatagt 1620taaaaccata aaactatctt aattacaaat aaaatactat gtagttacat tatttttgat 1680cgcattaaat gaaaggaact attatattgt ttggtaaacc aaattgcccg ttatgtaaat 1740tttcaaacga aatactttcg aataaaaaga tagctagtaa atatgaaatc gttagaataa 1800atatagctac attcttcgat aaatcaaagg tcgtagaaat actcggtatg gataagtctt 1860acg
FPV2核苷酸长度为1554bp，DNA序列(不含引物中附加的酶切位点)序列为agaacagaaa tagctcctct catacccgta ctaaaattct ctaaaaatct gactggtttt 60ttttctaaag atactctagt ccctccagat gtgactaaag ctacacgcct gtttttctct 120ttttgtaatt ttacccaatt attaatgtta gtagtcgtgt ccattttttt aatataagaa 180tttatattag tttaatttat aagaaaccaa tactttaaat ctataattcg ttgttctaaa 240caacagttat ggtttcttaa attgttgatt catgataata ttatcgtaat aattctatta 300ttgaaatatc tagtctcgtt tttgagataa atattacgaa taaagcatat tcatatcaaa 360gcaacattag ctttacattt aagttgtact acgcatacgc acgaagtacc tattcttata 420tattcccagg aaggcattcc atttttaata actatagagt taacaaaaga atgagacgta 480gaacaataag aggaccaaaa tcgtgtatct attcctaaac agccactaat agccggatgc 540tccttacact tggtttcgaa taggtactga tagtaaactt gtttattatg tactatttga 600tccaatagtt ctagtttatt acctctgtga tcaaagactg tagttttgtt agcgacccat 660gtagaactac tttcacaaga taagtatatt ccttcactgg tattacctac agacaataat 720tcatctatgc ttcgtttacc acgatgttct atattcggag tacgagtact aaaaacaact 780ttagatgtat ctaatttatc gtttataaga taaggattag taaattggag taacgatccc 840ttgcatacta tacctaatac acatataaag attagccttc taaaattaca ggggtgcgta 900tggtatgcca ttcttattta tatatgaact tactaattaa gtaatagaat atgtctcagt 960aataattgac ggtacactgt agtatttgat tccactagta aacacataaa ttccttacca 1020ttatgtttat tatccactaa tagttctcta ataaaaaatg tagagttttg taacggaatt 1080gttacaggac ttttatgaat taccgattcc atttcgctaa tgggtttacc accgggaccg 1140gcccaaaaca ttctcgctga cgaacctttc ctaccacacc ctacacatat taagctagta 1200gtatttatat cttcaggcag tctagtaata ttaacgtagg tacaatcttc gcgtgttaca 1260ggacagcatt ctcgcacacc gtcggaattt tttcttgcgt tttccggaag atatccttct 1320aggtctagaa aaatagtttc gtcactatca tcttcctcat aactaactgt actgtaatct 1380ccttcatcgc catagtctat cggattcaag agtacgggta ttatcaaaca tagaataaaa 1440atagttctat acatcatgtt aatttagata tttcttctgg acacgatatc tatcctacta 1500agtatgtatg gtatttattt atcaattaat ctgcgtatgt agtaactact acag2、构建载体pP12如图1所示(1)用Hind III+Xho I双酶切克隆载体pSK和上述回收的FPV2片段，37℃消化2h以后，电泳并回收约3.0kb的载体片段和约1.57kb的FPV2。然后按一定比例进行连接成pSKP2，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取白色菌落提质粒并以Hind III+Xho I双酶切(20μl体系)，37℃消化1.5h以后，加4μl6×Loading buffer，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。阳性质粒命名为pSKP2。
(2)将pSKP2和FPV1分别用BamH I+Sac I、Bgl II+Sac I进行双酶切，37℃消化2h后，电泳并回收约4.57kb的载体片段和约1.88kb的FPV1片段，按一定比例连接形成pSKP1P2，转化宿主菌DH5α，然后挑取白色菌落提质粒并用Hind III+Sac I双酶切(20μl体系)，加4μl 6×Loading buffer，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，阳性质粒命名为pSKP1P2。pSKP1P2分别以Hind III+XhoI和Hind III+Sac I双酶切后电泳，可见预期目的条带FPV2和FPV1，条带大小分别约为1.57kb和1.93kb(其中包括约50bp的酶切位点)，表明FPV1和FPV2已成功插入载体。
(3)将pSKP1P2和pFG1175-1分别用Nhe I、Xba I进行单酶切，37℃消化2h后，电泳并回收约6.45kb的载体片段和约3.80kb的P11-LacZ标记基因表达框，按一定比例连接构成pP12L，转化宿主菌DH5α，然后挑取蓝色菌落提质粒并用Sac I进行酶切(20μl体系)，37℃消化1.5h后，加4μl6×Loading buffer，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。筛选P11-LacZ标记基因表达框正向插入的阳性质粒，阳性质粒命名为pP12。
3、FPV复制非必需区的筛选将纯化的载体质粒pP12与282E4株FPV共转染CEF，转染试剂为FuGENETM6 Transfection Reagent，转染及重组病毒的筛选纯化按照转染试剂说明书进行。在35mm培养皿中培养CEF，使形成60％的单层后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37℃吸附2小时后倾去上清培养基，加1ml含10％小牛血清的DMEM培养基；将1μg载体质粒pP12溶解于50μl的无血清DMEM培养基；取5μl转染试剂FuGENETM6缓慢加入到100μl无血清DMEM培养基中，两者混匀置室温作用15min，然后缓缓滴加至上述CEF中，边滴边混匀，置37℃培养3小时后补加1ml含10％小牛血清的DMEM培养基；12h后更换为含1％小牛血清的DMEM培养基，置37℃继续培养；CEF产生80％病变后收获病毒，反复冻融3次，低速离心去除细胞碎片，上清用于重组病毒的筛选和纯化。将上清稀释液接种60mm平皿上长成致密单层的CEF，37℃培养约72h，待出现较多病毒蚀斑后，用含有200μg/ml X-gal的营养琼脂覆盖，待出现蓝色蚀斑后挑取蓝色蚀斑，见图3，用吸管将其吸出，转入0.5ml细胞培养维持液中，冻融3次，低速离心去除细胞与琼脂碎片，取上清感染次代细胞。在60mm平皿中重复进行以上步骤后，于96孔板上筛选数次，直至在X-gal存在的条件下，重组病毒在CEF上所形成的蚀斑全部呈蓝色。即可得到纯化的重组病毒。重组病毒rFPV-1218NDF的获得表明，预先假定的复制非必需区均为真正的FPV复制非必需区，命名为FPV12-18。
4、复制非必需区的遗传稳定性试验重组鸡痘病毒接种CEF，在5％CO2，37℃的培养箱培养，2-3天后待病变达80％以上后收获，反复冻融3次，用于下次扩增，连续传10代。空斑计数后保存于-70℃冰箱备用。分别取重组病毒的0、5、10代以10-3、10-4、10-5、10-6稀释，接种生长在24孔板上单层次代CEF，100μl/孔。待出现单个蚀斑后，覆盖含200μg/ml X-gal的琼脂，37℃，CO2箱中培养1-2天观察蚀斑纯度。结果发现所有病毒蚀斑均呈蓝色。
用PBS吹下扩增的三个代次重组鸡痘病毒的单层细胞，以High Pure PCRTemplate Preparation Kit(宝灵曼公司)提取核酸模板DNA。按常规方法针对LacZ基因部分片段进行PCR并测序，检测外源基因在重组FPV传代过程中是否发生变异，结果序列没有发生任何变异。
以上试验表明，重组病毒基因组中的LacZ基因能够稳定遗传和表达，同时也证明了筛选的FPV复制非必需区FPV12-18具有良好的遗传稳定性。
5、鸡痘病毒表达载体p12-18的构建如图2所示，将pN11S用Hind III+Sma I进行双酶切，37℃消化2h后，电泳并回收约200bp的含MCS的Ps启动子，与同时用Hind III+Sma I双酶切的载体pP12按一定比例连接构建鸡痘病毒表达载体p12-18，将该载体转化宿主菌DH5α，然后挑取蓝色菌落提质粒，并用Hind III+Sma I双酶切(20μl体系)，加4μl 6×Loading buffer，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，阳性质粒分别命名为p12-18。
经检测，其长度为10450bp，该载体以鸡痘病毒复制非必需区FPV12-18为外源基因插入位点，是一个含有鸡痘病毒复制非必需区侧翼区FPV1和FPV2的表达载体。
6、以FPV12-18为外源基因插入位点，表达新城疫病毒F基因的转移载体p1218NDF的构建如图3所示，质粒pTF用Bgl II+Sal I双酶切，回收约1.7kb的ZJ1株NDV的F基因片段，与经BamH I+Sal I双酶切的表达载体p12-18进行连接构建载体P1218NDF。
转化宿主菌DH5α，然后挑取蓝色菌落提质粒，并用Hind III酶切(20μl体系)，加4μl 6×Loading buffer，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，阳性质粒可见约1.9kb的条带。用碱裂解法制备转移载体的质粒DNA并以PEG纯化质粒DNA。
7、构建新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒rFPV-1218NDF将转移载体P1218NDF与282E4株FPV共转染CEF，转染和筛选具体方法在35mm培养皿中培养CEF，使形成60％的单层后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37℃吸附2小时后倾去上清培养基，加1ml含10％小牛血清的DMEM培养基；将1μg转移载体P1218NDF溶解于50μl的无血清DMEM培养基；取5μl转染试剂FuGENETM6缓慢加入到100μl无血清DMEM培养基中，两者混匀置室温作用15min，然后缓缓滴加至上述CEF中，边滴边混匀，置37℃培养3小时后补加1ml含10％小牛血清的DMEM培养基；12h后更换为含1％小牛血清的DMEM培养基，置37℃继续培养；CEF产生80％病变后收获病毒，反复冻融3次，低速离心去除细胞碎片，上清用于重组病毒的筛选和纯化。将上清稀释液接种60mm平皿上长成致密单层的CEF，37℃培养约72h，待出现较多病毒蚀斑后，用含有200μg/ml X-gal的营养琼脂覆盖，待出现蓝色蚀斑后挑取蓝色蚀斑，用吸管将其吸出，转入0.5ml细胞培养维持液中，冻融3次，低速离心去除细胞与琼脂碎片，取上清感染次代细胞。在60mm平皿中重复进行以上步骤后，于96孔板上筛选数次，直至在X-gal存在的条件下，重组病毒在CEF上所形成的蚀斑全部呈蓝色。即可得到282E4株重组病毒rFPV-1218NDF。感染rFPV-1218NDF和阳性对照rFPV-F或rFPV-HN的CEF胞浆和胞膜区呈特异性黄绿色荧光，而感染阴性对照亲本282E4株FPV的CEF则未呈现特异性荧光着色，表明重组鸡痘病毒中的F基因已获得表达。重组鸡痘病毒rFPV-1218NDF及其阳性对照rFPV-F、阴性对照FPV282的荧光照片见图4。图4中，A图为感染rFPV-1218NDF的CEF；B图为感染rFPV-F的CEF；C图为感染野生型282E4株FPV的CEF。
重组病毒的0、5、10代接种24孔板上的单层次代CEF，待出现单个蚀斑后，覆盖含200μg/ml X-gal的琼脂，发现所有病毒蚀斑均呈蓝色。而间接免疫荧光试验发现所有病毒蚀斑均呈现特异性荧光，阴性对照组无特异性荧光。对5、10代重组病毒中的F基因进行PCR，结果均可以扩增出1.7Kb的目的条带，与预期值相符。测序结果显示，所测序列没有发生任何变异。以上试验表明，重组病毒基因组中的F基因均能够稳定地遗传和表达。
8、新构建的重组鸡痘病毒rFPV-1218NDF与原有的以FPV7S为外源基因插入位点的重组鸡痘病毒rFPV-N11SF在有母源抗体商品鸡上的免疫效力比较试验重组病毒rFPV-N11SF与重组病毒rFPV-1218NDF之间仅存在FPV复制非必需区的差异，复制非必需区分别为FPV7S和FPV12-18。为了探讨以不同复制非必需区为外源基因插入位点对重组FPV抵抗母源抗体能力的影响，将它们分别在5、10、15和25日龄的存在不同水平母源抗体的商品鸡上进行免疫效力试验。
将1日龄商品蛋鸡随机分组，25-26只/组，进行隔离饲养。1日龄ND的HI抗体效价平均约为28。分别于5、10、15、25日龄颈部皮下接种rFPV-N11SF、rFPV-1218NDF和野生型鸡痘病毒FPV282，105PFU/只，同时设ND油苗对照组，0.2ml/只。免疫后28d进行滴鼻攻毒，每只试验鸡接种105ELD50的F48E8株NDV强毒。观察14d，记录发病死亡情况。
5日龄商品鸡商品鸡5日龄时的ND母源抗体相当高，平均HI效价为2(6.0±0.4)。由表1可见，FPV复制非必需区不同的重组病毒的免疫保护率之间存在很大的差异，分别为50.0％和75.0％；ND油苗的保护率为100％。rFPV-N11SF组组与ND油苗组的保护率之间存在显著差异，而rFPV-1218NDF组与ND油苗组的保护率之间无显著差异。
表1 重组FPV在5日龄商品鸡上的免痘效力试验结果
ND HI效价＝平均HI效价(log2X)±标准差；a、b有显著差异(P＜0.05)；免疫保护率＝(攻毒对照组死亡率-疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率×100％
10日龄商品鸡商品鸡10日龄时ND母源抗体的平均HI效价为2(5.0±0.6)。由表2可见，FPV复制非必需区不同的重组病毒的免疫保护率之间也存在很大的差异，分别为50.0％和70.8％，ND油苗的保护率为83.3％。rFPV-N11SF组与ND油苗组的保护率之间存在显著差异，而rFPV-1218NDF组与ND油苗组的保护率之间无显著差异。
表2 重组FPV在10日龄商品鸡上的免疫效力试验结果
ND HI效价＝平均HI效价(log2X)±标准差；a、b有显著差异(P＜0.05)；免疫保护率＝(攻毒对照组死亡率-疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率×100％15日龄商品鸡商品鸡15日龄时ND母源抗体的平均HI效价为2(4.0±0.4)。由表3可见，rFPV-N11SF和rFPV-1218NDF组的保护率均较各自5、10日龄免疫的保护率均有一定的提高，其中rFPV-1218NDF组的保护率达到了90％以上，比rFPV-N11SF组略高；重组FPV组和ND油苗组的保护率之间没有显著差异。
表3 重组FPV在15日龄商品鸡上的免疫效力试验结果
ND HI效价＝平均HI效价(log2X)±标准差免疫保护率＝(攻毒对照组死亡率-疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率×100％25日龄商品鸡商品鸡25日龄时ND的母源抗体已经很低，平均HI效价下降到2(2.0±0.4)。由表4可见，重组FPV组较其5和15日龄免疫的保护率明显上升，rFPV-N11SF组为88％，rFPV-1218NDF组则与油苗组一样达到100％，各免疫组之间差异不大。
表4 重组FPV在25日龄商品鸡上的免疫效力试验结果
ND HI效价＝平均H1效价(log2X)±标准差免疫保护率＝(攻毒对照组死亡率-疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率×100％综上所述，商品鸡上普遍存在的母源抗体对重组FPV的免疫效力存在很大的影响；在5、10、15、25日龄的带有不同水平母源抗体的商品鸡上，以复制非必需区FPV12-18为外源基因插入位点的rFPV-1218NDF和以复制非必需区FPV7S为插入位点的rFPV-N11SF在免疫效力方面存在很大的差异。rFPV-1218NDF组较rFPV-N11SF组的保护率高，表明复制非必需区FPV12-18比FPV7S更适合于做外源基因的插入位点，从而能够使重组FPV更好地抵抗母源抗体的干扰，提高重组FPV的免疫效力。但这种差异不显著，可能与样本数太小有关。因此，将以FPV12-18为外源基因插入位点的重组病毒rFPV-1218NDF与以FPV7S为插入位点的重组病毒rFPV-N11SF分别在5、10、15和25日龄商品鸡上进行的4次免疫效力试验结果一并统计(见表5和图9)，从而将样本扩大到每组101只鸡，然后用SPSS软件对它们之间免疫保护率的差异性进行分析，结果表明它们的保护率之间差异极显著，这进一步确证了以FPV12-18为插入位点的重组病毒比相应的插入位点为FPV7S的重组病毒能够更好地抵抗母源抗体的干扰。
表5 重组FPV在不同龄商品鸡上的4次免疫效力试验结果
a、b差异极显著(P＜0.01)；免疫保护率＝(攻毒对照组死亡率-疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率×100％
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权利要求
1.鸡痘病毒表达载体p12-18，其特征在于该载体保藏号为CGMCC1385，其长度为10450bp，该载体以鸡痘病毒复制非必需区FPV12-18为外源基因插入位点，是一个含有鸡痘病毒复制非必需区侧翼区FPV1和FPV2的表达载体，FPV1的核苷酸长度为1863bp，FPV2的核苷酸长度为1554bp，FPV1和FPV2的DNA序列分别为FPV1gtttctaaga tcatcatgtc ctacaatttt atttctttga cgtcgtgttt atatcatttt 60ctgttttggg ataataattt tctctaatat aaaattatat attaattctt tttctatatt 120gaagtgattt aattaaagaa aatatgtaat ctttatctaa ttaggttttt ccttatctaa 180taatagaact gtatacctgg tgatcttcct acttgattta cgtgacctaa tataattatt 240tagatattta cctgtttttc gcataaatat aattcctaaa aatattatta ttaagatatt 300aatatctatt atccatgata atatatagag aaacattata ttaatcgcca atcgaatatg 360aataacatac atagtaataa taaagatagc agttaatggc aaactaatat tattcatgat 420aactgctata aaagaagata atatagcaag atatattgaa gtgtctatca tatcttattt 480tatggataaa cctttaacgg caacttctaa gttacttatt ttttggttta ttaaactatt 540ggttttttcg tacttttctt ccaatttttt tgtatttttc tttaatttta atatctcatt 600atcatgaatg tcgtatagta ttttacttat accctcagag aagaagccgc ttcgtatctg 660atcttcatta tcagaacctt ttttaagcct cgtgcaatag gagttagaaa gataggagtt 720aagtatcttg gaaaaattaa gtgcaatact aggaaaaacc caacagataa tatgaggcac 780gagatcgata tgcacatatg ttcctacaag ttcgtattta taggcactat ttgatgctaa 840tccgatttct aaaacggctt tattatagat accgttttta tagttcaatg tttttatgag 900ttttttagat gactctagtc tacaccactg cctaaagttc ttatttccaa gatcacatat 960tttagtagca tttatatatc cgttgtattt taacatgatt acttctatgt tcgcatagtt 1020gataaagcaa aagttctcat ctatatgttt aacggtgtta ggtacaaact ccatattgta 1080atactttcat tcagaatagt attgttttta cattttttat tataaggaaa aaactggttt 1140attcattttc ttttaaccat gcatacacaa tttacaggaa ctgatacatg tttagtcatt 1200acagcattat tttcaccaag atacattatt tttttaattt ctgtgaccgt agaacagtaa 1260gattcccatc ttgactcatc aatgccctta caaggagatg tagaattagg gaatcccatg 1320cagctaatca tttgaatgta ttgtgtgtat ccatctcctt tctcagaata tctgcccaaa 1380gattctattt tactgacacc agttccatta acagggctta cttctctaat atctacccat 1440gtagttacta attcacaagc gggttcgtat aaataaacag tagtattatc attactagat 1500gtctgggtat cgtataatac agctgcatga tagtactgaa aacatgttag taacacaagt 1560atatgtgtaa cgtacataat agaaaaaagt ataatttatg ccttattttt acattatagt 1620taaaaccata aaactatctt aattacaaat aaaatactat gtagttacat tatttttgat 1680cgcattaaat gaaaggaact attatattgt ttggtaaacc aaattgcccg ttatgtaaat 1740tttcaaacga aatactttcg aataaaaaga tagctagtaa atatgaaatc gttagaataa 1800atatagctac attcttcgat aaatcaaagg tcgtagaaat actcggtatg gataagtctt 1860acgFPV2agaacagaaa tagctcctct catacccgta ctaaaattct ctaaaaatct gactggtttt 60ttttctaaag atactctagt ccctccagat gtgactaaag ctacacgcct gtttttctct 120ttttgtaatt ttacccaatt attaatgtta gtagtcgtgt ccattttttt aatataagaa 180tttatattag tttaatttat aagaaaccaa tactttaaat ctataattcg ttgttctaaa 240caacagttat ggtttcttaa attgttgatt catgataata ttatcgtaat aattctatta 300ttgaaatatc tagtctcgtt tttgagataa atattacgaa taaagcatat tcatatcaaa 360gcaacattag ctttacattt aagttgtact acgcatacgc acgaagtacc tattcttata 420tattcccagg aaggcattcc atttttaata actatagagt taacaaaaga atgagacgta 480gaacaataag aggaccaaaa tcgtgtatct attcctaaac agccactaat agccggatgc 540tccttacact tggtttcgaa taggtactga tagtaaactt gtttattatg tactatttga 600tccaatagtt ctagtttatt acctctgtga tcaaagactg tagttttgtt agcgacccat 660gtagaactac tttcacaaga taagtatatt ccttcactgg tattacctac agacaataat 720tcatctatgc ttcgtttacc acgatgttct atattcggag tacgagtact aaaaacaact 780ttagatgtat ctaatttatc gtttataaga taaggattag taaattggag taacgatccc 840ttgcatacta tacctaatac acatataaag attagccttc taaaattaca ggggtgcgta 900tggtatgcca ttcttattta tatatgaact tactaattaa gtaatagaat atgtctcagt 960aataattgac ggtacactgt agtatttgat tccactagta aacacataaa ttccttacca 1020ttatgtttat tatccactaa tagttctcta ataaaaaatg tagagttttg taacggaatt 1080gttacaggac ttttatgaat taccgattcc atttcgctaa tgggtttacc accgggaccg 1140gcccaaaaca ttctcgctga cgaacctttc ctaccacacc ctacacatat taagctagta 1200gtatttatat cttcaggcag tctagtaata ttaacgtagg tacaatcttc gcgtgttaca 1260ggacagcatt ctcgcacacc gtcggaattt tttcttgcgt tttccggaag atatccttct 1320aggtctagaa aaatagtttc gtcactatca tcttcctcat aactaactgt actgtaatct 1380ccttcatcgc catagtctat cggattcaag agtacgggta ttatcaaaca tagaataaaa 1440atagttctat acatcatgtt aatttagata tttcttctgg acacgatatc tatcctacta 1500agtatgtatg gtatttattt atcaattaat ctgcgtatgt agtaactact acag。
2.如权利要求1所述鸡痘病毒表达载体p12-18的构建方法，其特征在于包括以下步骤(1)定向克隆法筛选鸡痘病毒的新复制非必需区根据已发表的鸡痘病毒的基因组全序列设计两对引物P15’-CGTAAGACTTATCCATACCGAG-3’P25’-GTTTCTAAGATCATCATGTCCTAC-3’P35’-CTGTAGTAGTTACTACATACGCAG-3’P45’-AACAGAAATAGCTCCTCTCATAC-3’用PCR方法分别扩增鸡痘病毒复制非必需区FPV12-18的两个侧翼区FPV1和FPV2；(2)利用分子克隆技术将复制非必需区FPV12-18的侧翼区FPV1和FPV2、标记基因表达框P11-LacZ先后克隆入载体pBluescript SK(-)，所得载体pP12与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞，转染试剂为FuGENETM6Transfection Reagent，重组病毒的筛选标记基因为大肠杆菌的β-半乳糖苷酶LacZ基因，经蓝斑筛选得到纯化的重组病毒载体pP12；(3)构建鸡痘病毒FPV表达载体p12-18将外源基因的启动子Ps插入步骤(2)中构建的载体pP12，获得鸡痘病毒表达载体p12-18。
3.根据权利要求2所述鸡痘病毒表达载体p12-18的构建方法，其特征在于步骤(3)中，将pN11S用Hind III+Sma I进行双酶切，37℃消化2h后，电泳并回收约200bp的含MCS的Ps启动子，与同时用Hind III+Sma I双酶切的载体pP12连接构建鸡痘病毒表达载体p12-18。
全文摘要
鸡痘病毒表达载体p12－18及其构建方法，涉及鸡痘病毒表达载体构建技术领域，先采用筛选鸡痘病毒的新复制非必需区，扩增鸡痘病毒复制非必需区FPV12－18的两个侧翼区；再将复制两个侧翼区、标记基因表达框P11－LacZ先后克隆入载体pBluescript SK(－)，所得载体pPl2与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞，重组病毒的筛选标记基因为大肠杆菌的β－半乳糖苷酶LacZ基因，经筛选得到重组病毒载体；最后将外源基因的启动子Ps插入载体，获得鸡痘病毒表达载体。本发明可表达多种病原体的保护性抗原基因，可使重组鸡痘病毒疫苗具有较强的抵抗商品鸡所携带的母源抗体干扰的能力。
文档编号C12N15/66GK101067140SQ20071002268
公开日2007年11月7日 申请日期2007年5月25日 优先权日2007年5月25日
发明者刘秀梵, 孙蕾, 陈素娟, 刘武杰 申请人:扬州大学