专利名称：一种基于移动切割内切酶的dna结合蛋白检测方法
技术领域：
本发明涉及的是一种非标记检测脱氧核糖核酸(DNA)结合蛋白的方法，这里的DNA结合蛋白主要是指具有特异DNA结合序列的调控因子，这里的移动切割限制性内切酶主要是指IIS型限制性内切酶，能够在识别位点之外切割双链DNA。属于生物医学中非标记检测的技术领域。
背景技术：
DNA与蛋白质的序列特异性识别和相互作用在生物基因表达调控中发挥重要的作用，几乎所有疾病的发生和发展都与DNA结合蛋白的异常相关。DNA结合蛋白的研究已越来越受到人们的关注，成为基因组和蛋白质组研究的重要内容之一。对细胞或病态组织中某一或多种蛋白质的量的检测是至关重要的。
目前用于研究DNA与蛋白质的方法很多，如凝胶迁移率分析(EMSA)、足迹法(foot-printing)等。虽然这些常规的方法在序列特异性DNA结合蛋白的研究中发挥了重大的作用，但操作起来工作量大、费时费力，容易造成放射性物质的污染，而且还无法进行高通量的检测。当前也有一些利用非放射性标记对DNA结合蛋白进行检测的方法，但这些方法大部分在检测前必须对蛋白质进行荧光分子标记，这个过程中可能导致低丰度蛋白质的丢失，不利于提高检测效率和灵敏度，同时难以实现高通量的并行检测。最近在Nature Biotechnology、Nuclear Acid research及Clinic Chemistry等国际权威杂志上陆续报道了一些基于荧光染料的方法检测DNA结合蛋白，这些方法有效避免了放射性物质的污染，检测方便，但还是无法进行高通量操作。
IIS型(移动切割限制性内切酶)限制性内切酶是一种比较常见的II类限制性内切酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别位点之外切开DNA。这些酶的大小适中，约为400-650个氨基酸；识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。该类型酶的结合位点和切割位点不在同一位置，且其切割位点除了与结合位点在碱基间隔数目上有特异性外，没有序列特异性，因此对于检测探针的DNA结合蛋白的结合位点序列可以任意选择组合，从而使该方法对任何DNA结合蛋白都适用，具有很好的通用性。
发明内容
技术问题本发明的目的是针对上述不足之处提供一种基于移动切割限制性内切酶(IIS型限制性内切酶)的DNA(脱氧核糖核酸)结合蛋白非标记检测方法，其发展了一种非标记的可高通量并行检测的技术来检测细胞或组织中DNA结合蛋白质的丰度，尤其可以用来检测正常和病态组织中DNA结合蛋白含量的变化。
技术方案本发明的一种基于移动切割内切酶(IIS型限制性内切酶)的脱氧核糖核酸(DNA)结合蛋白非标记检测方法是采取以下方案实现的双链寡核苷酸探针的设计针对待检测的DNA结合蛋白的特异性DNA识别位点的序列信息设计一段双链寡核苷酸探针，其中一条单链5’端标记一个连接基团并固定到固相载体表面，另一条与之互补的单链的5’端引入一个信号分子；同时在含有待测DNA结合蛋白的识别位点的3’端设计一个特异的IIS型限制性内切酶识别位点，调节内切酶与待检测DNA结合蛋白识别位点间的碱基个数，使内切酶的切割位点位于待检测DNA结合蛋白结合位点之中；其检测方法为将可能含有待检测的DNA结合蛋白的溶液与固定化的上述双链寡核苷酸探针一起孵育，清洗未结合的溶液后将该固定化的双链寡核苷酸探针在IIS型限制性内切酶体系中进行酶切反应，最后检测固相载体表面残留的信号分子的强度实现间接检测溶液中含有的待检测的DNA结合蛋白的量。
“待检测的DNA结合蛋白的特异性DNA识别位点的序列信息”是指每一个DNA结合蛋白都能特异性地识别一段DNA碱基序列并能够结合到该序列位置上，不同的DNA结合蛋白其识别并结合的DNA碱基序列也不一样。
“使内切酶的切割位点位于待检测DNA结合蛋白结合位点之中”是指根据所选择的IIS型内切酶的识别位点和切割位点的信息，在双链探针上调节内切酶识别位点序列的位置，使该酶的切割位置正好位于DNA结合蛋白的结合位点之中。
“可能含有待检测的DNA结合蛋白的溶液”是指细胞的核提取物或蛋白质的表达产物或溶解有该DNA结合蛋白的缓冲液。
“固相载体”是指经过物理或化学修饰后能够共价耦合或者物理吸附生物分子的具有较大表面积的固体物质。
“探针上引入的信号分子”是指可以通过光、电、磁检测到的分子基团。
“固相载体表面残留的信号分子的强度”是指当待检测的DNA结合蛋白存在并结合到固定化的双链寡核苷酸探针时，由于空间位阻作用，限制性内切酶无法将结合有蛋白质的双链寡核苷酸探针切断，经过冲洗后信号分子仍然保留在固相载体表面，而没有待检测的DNA结合蛋白结合时，双链寡核苷酸探针便会在空闲的DNA结合蛋白结合位点中被限制性内切酶切断，经过冲洗后信号分子无法保留在固相载体表面，固相载体表面保留下来的信号分子数理论上与结合上的DNA结合蛋白的量成正相关，根据固相载体表面残留的信号分子的信号强弱可实现对DNA结合蛋白的非标记检测。
该方法可以用于DNA结合蛋白的定量化检测，先用已知浓度的某一待测DNA结合蛋白，根据上述的检测方法建立蛋白浓度与信号强度的标准曲线，再对该蛋白质在样品中的浓度进行定量检测。
如附图2，其具体的检测原理为将可能含有待检测的DNA结合蛋白的溶液与固定化的双链寡核苷酸探针一起孵育，然后在限制性内切酶体系中进行酶切反应；当待检测的DNA结合蛋白存在时，由于空间位阻作用，限制性内切酶无法将结合有蛋白质的双链寡核苷酸切断，经过冲洗后信号分子仍然保留在固相载体表面，而没有DNA结合蛋白时，双链寡核苷酸探针便会被限制性内切酶在空闲的DNA结合蛋白结合位点中切断，经过冲洗后信号分子无法保留在固相载体表面；进行信号检测，根据信号强度的多少可实现对DNA结合蛋白的非标记检测。
该方法由于将检测探针固定在固相载体表面，可以对多个DNA结合蛋白同时进行检测，具有高通量、高灵敏、直观、制备简单、成本低、无需标记蛋白质等优点。
有益效果该方法的优势之一是不需要对蛋白质进行荧光标记，同时也具有高通量检测、成本低廉、简便快捷、无放射污染等优点，非常适用于疾病的预测、致病机理的探讨以及药物筛选等研究领域。与现有技术相比，具有如下优点1、本发明的最大优点是不需要标记待检测的蛋白质，避免了在标记过程中可能造成的蛋白质的丢失，提高了检测的灵敏度。
2、本发明中设计的双链寡核苷酸探针是固定在固相载体表面的，可以对大量的DNA结合蛋白同时进行检测，反映的生物学意义更全面，同时可以节省大量的检测成本。
3、本发明避免了传统的同位素标记所带来的放射性污染，操作更安全快捷。
以下将结合附图对本发明作进一步说明。
图1是本发明的探针设计示意图。其中有连接基团1，固相载体2，DNA结合蛋白结合位点3，IIS限制性内切酶的切割位点4，IIS限制性内切酶识别位点5，信号分子6。
图2是本发明的DNA结合蛋白检测原理示意图。其中有待检测的DNA结合蛋白7，IIS限制性内切酶8。
图3是在96孔板中进行多个DNA结合蛋白的并行检测。其中A根据不同DNA结合蛋白的结合位点设计的双链DNA检测探针；B固定有检测探针的小孔；C链霉抗生物素(蛋白)包被的96孔板中不同检测探针的布局示意图。
图4是在DNA微阵列芯片上进行DNA结合蛋白的高通量检测。其中a根据不同DNA结合蛋白的结合位点设计的双链DNA检测探针；b固定有检测探针的醛基处理的玻片表面；c玻片上每个点样区域中不同检测探针的布局示意图；d在玻片上点样制备的双链DNA微阵列芯片示意图。
具体实施例方式
如附图1，针对被检测的DNA结合蛋白的特异性DNA识别序列设计一段双链寡核苷酸探针，其中一条单链5’端标记一个连接基团1并可以固定到固相载体2表面，另一条单链的5’端引入一个信号分子6；同时在含有待测DNA结合蛋白的识别位点3的3’端设计一个特异的IIS型限制性内切酶识别位点5，调节两蛋白识别位点的碱基个数，使酶的切割位点4位于待检测DNA结合蛋白结合位点3之中。
如附图2，I将含有待检测DNA结合蛋白的溶液与固定的探针进行孵育，将未结合的蛋白质清洗掉；II将上步孵育后的探针在IIS限制性内切酶的反应体系下进行酶切反应，清洗切割后游离的探针；III信号分子检测，由于结合有蛋白质的探针没有被IIS限制性内切酶切割掉而将信号分子保留在固相载体表面，理论上每一个保留的信号分子对应一个蛋白质分子。其具体操作过程为将可能含有待检测的DNA结合蛋白的溶液与固定化的双链寡核苷酸探针一起孵育，清洗未结合的溶液后将固定化的双链寡核苷酸探针在IIS型限制性内切酶体系中进行酶切反应，最后检测固相载体表面残留的信号分子6的强度。当待检测的DNA结合蛋白存在时，由于空间位阻作用，IIS型限制性内切酶无法将结合有蛋白质的双链寡核苷酸切断，经过冲洗后信号分子仍然保留在固相载体表面；而没有待检测的DNA结合蛋白时，双链寡核苷酸探针便会被IIS型限制性内切酶在空闲的DNA结合蛋白结合位点中切断，经过冲洗后信号分子无法保留在固相载体表面，根据固相载体表面残留的信号分子的信号强弱可实现对DNA结合蛋白的非标记检测。探针上引入的信号分子是指可以通过光、电、磁检测到的分子基团。
以下将结合附图对本发明作进一步说明(实例中的IIS型限制性内切酶BceAI购自于纽英伦生物技术(北京)有限公司，所有化学药品均为分析纯)。参照附图1，以表1中20种DNA结合蛋白为待检测蛋白，每一种DNA结合蛋白设计一条检测探针及其互补序列。如NF-κB蛋白，其结合序列为5’...GGGACTTTCCC...3’，HS型限制性内切酶BceA I识别序列及切割位点为5’...↓(N)14GCCGT...3’，则NF-κB蛋白非标记检测探针序列为5’...连接基团-(T)20GGGACTT↓TCCC(N)10GCCGT(N)5...3’，其互补序列为5’...信号分子-(N)5ACGGC(N)10GGGAAAGTCCCAAAAA...3’。其中(T)20表示20个连续的T，N表示A、T、C、G四种碱基中的任一碱基，且其组合的序列不含任一蛋白质结合位点和内切酶识别为典，两条互补序列对应位置的碱基必须互补，如A对应T，C对应G。为了便于表述，我们将检测寡核苷酸序列命名为Pn，其对应的互补序列命名为CPn，其中n表示不同待检测蛋白的编号。
实施例1.基于链霉抗生素蛋白包被的96孔板的DNA结合蛋白非标记检测(该方法适用于所有商品化的酶标仪检测系统，本实施例中推荐使用的检测仪器为瑞士Tecan公司的InfiniteTMF200全自动酶标仪。)1、探针的合成及固定1.1根据上面所述的探针设计方法说明及附图3，双链寡核苷酸检测探针Pn上的连接基团1为生物素分子，CPn上的信号分子6为地高辛分子。如表1所示，20条检测探针除了DNA结合蛋白的结合位点序列根据不同的待检测蛋白而异，其它序列都是相同的，另外单独合成两对互补序列分别作为阴性(-)和阳性对照(+)。
表1 转录因子蛋白DNA结合位点序列及检测探针的设计
其中Pn表示对应蛋白的检测探针编号；(N)10表示10个连续的N，N表示A、T、C、G四种碱基中的任一碱基；↓表示BceA I内切酶在蛋白质结合位点中的切割位置。1.2分别化学合成寡核苷酸探针Pn及其互补序列CPn(上海英骏生物技术有限公司)，将每条Pn分别以25μM的浓度溶于0.1M PBS(2.58g Na2HPO4·12H2O，0.44gNaH2PO4·2H2O，溶入100mL重蒸水中，pH7.4)中，取一块链霉抗生素蛋白包被的96孔板(德国Greiner bio-one公司产品)，分别在每一个孔中加入10μL溶于0.1MPBS的Pn，每个探针重复5个孔(如附图3所示)。37℃保温30分钟以上。分别用0.1M PBS和重蒸水室温下各洗涤5分钟。
1.3将对应的互补序列CPn分别以30μM的浓度溶于100mM的MgCL2溶液中，在96孔板中每一个固定有Pn的小孔中分别加入15μL对应的互补链CPn，37℃保温杂交30分钟以上。分别用0.2×SSC，0.1％SDS和重蒸水室温下各洗涤5分钟。室温晾干。固定有双链检测探针的96孔板置于4℃备用。
2、待测蛋白与固定化双链寡核苷酸探针的结合提取不同组织样本或培养细胞的核蛋白，按一定浓度溶于结合缓冲液(10mMHepes，pH 7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mMEDTA，0.05％Nonidet-P40，10％glycerol，5％BSA)中。在每一个固定有双链检测探针的96孔板的小孔中各加10μL细胞核提取物，室温下孵育1小时，用PBS及重蒸水分别清洗96孔板5分钟。
3、IIS型限制性内切酶BceA I的酶切反应BceA I内酶切以1U/μL的浓度溶入酶切缓冲液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT(pH 7.9@25℃)，100μg/ml BSA)，每孔加入酶切体系10μL，37℃温育2小时。用PBS及重蒸水分别清洗96孔板5分钟。
4、检测及结果判定洗板后加入1∶2000稀释的标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(Anti-DIG-AP)100μL/孔(酶稀释液为100mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、10g/L BSA)，37℃45分钟。充分洗板后加入底物(对硝基苯磷酸酯(PNPP)10g溶于10ml蒸馏水、87μl二乙醇胺、5μl 1M MgCl2)100μl/孔，37℃避光显色，2M NaOH 50μl终止反应，酶标仪405nm波长测吸光度A值。以大于阴性对照值2倍以上为检测阳性。取每个样品在酶标仪上测的重复值的均值作指标。
实施例2.基于DNA微阵列芯片的DNA结合蛋白非标记检测(该方法适用于所有DNA微阵列芯片的一般操作)1、检测探针的合成所有探针的设计及合成同实施例1。不同的是将Pn中的连接基团1为氨基标记，将CPn中的信号分子6为Cy3荧光分子标记。
2、微阵列的制备根据步骤1制备的探针，如图4所示，将探针Pn和其对应的互补探针CPn都以100μM的浓度混合溶入重蒸水中，95℃保温5分钟，然后自然冷却至室温过夜，使Pn和CPn充分复性为双链结构。取以上复性的溶液溶入同等体积的2×碳酸盐缓冲液(0.2M Na2CO3/0.2M NaHCO3＝1/9的体积比混合，pH9.0)中。然后通过自动化芯片点样仪将溶解于碳酸盐缓冲液中双链寡核苷酸探针按照附图4所示点在氨基硅烷化的基底上制备DNA微阵列芯片。
所有的DNA微阵列均可用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)点样仪点样制备。ChipMaker点样针的型号为CMP3，该针的直径约为90～100μm，可将约为600pL的点样液转移到基片表面。
3、芯片的杂交提取不同组织样本或培养细胞的核蛋白，按一定浓度溶于结合缓冲液(10mMHepes，pH 7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％ Nonidet-P40，10％glycerol，5％BSA)中。在每个微阵列区域上加入25μL提取物，用盖玻片小心覆盖后室温孵育1小时，用PBS及重蒸水分别清洗玻片5分钟。
4、IIS型限制性内切酶BceA I的酶切反应BceAI内酶切以1U/μL的浓度溶入酶切缓冲液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT(pH 7.9@25℃)，BSA 100μg/ml)，每个阵列上加入酶切体系25μL，用盖玻片小心覆盖后37℃温育2小时。用PBS及重蒸水分别清洗玻片5分钟。
5、芯片扫描及结果判定芯片上的荧光信号通过芯片扫描仪ScanMicroarrayLite(Packard BiochipTechnologies)在Cy3波长下进行扫描，扫描条件为85％laser power，80％PMT gain，5μm分辨率。扫描信号值为阴性对照值的2倍以上为检测阳性，取每个重复检测点的均值为指标。
权利要求
1.一种基于移动切割内切酶的DNA结合蛋白检测方法，其特征为双链寡核苷酸探针的设计针对待检测的DNA结合蛋白的特异性DNA识别位点的序列信息设计一段双链寡核苷酸探针，其中一条单链5’端标记一个连接基团(1)并固定到固相载体(2)表面，另一条与之互补的单链的5’端引入一个信号分子(6)；同时在含有待测DNA结合蛋白的识别位点(3)的3’端设计一个特异的IIS型限制性内切酶识别位点(5)，调节限制性内切酶与待检测DNA结合蛋白识别位点(3)间的碱基个数，使移动切割限制性内切酶的切割位点(4)位于待检测DNA结合蛋白结合位点(3)之中；其检测方法为将可能含有待检测的DNA结合蛋白的溶液与固定化的上述双链寡核苷酸探针一起孵育，清洗未结合的溶液后将该固定化的双链寡核苷酸探针在限制性内切酶体系中进行酶切反应，最后检测固相载体表面残留的信号分子的强度实现间接检测溶液中含有的待检测的DNA结合蛋白的量。
2.根据权利要求1所述的一种基于移动切割内切酶的DNA结合蛋白检测方法，其特征为待检测的DNA结合蛋白的特异性DNA识别位点的序列信息是指每一个DNA结合蛋白都能特异性地识别一段DNA碱基序列并能够结合到该序列位置上，不同的DNA结合蛋白其识别并结合的DNA碱基序列也不一样。
3.根据权利要求1所述的一种基于移动切割内切酶的DNA结合蛋白检测方法，其特征为移动切割限制性内切酶是指一类IIS型限制性内切酶，其针对双链DNA的切割位点和特异性的识别位点不在同一位置上，而一般相差5～15个碱基。
4.根据权利要求1所述的一种基于移动切割内切酶的DNA结合蛋白检测方法，其特征为使限制性内切酶的切割位点(4)位于待检测DNA结合蛋白结合位点(3)之中，是指根据所选择的限制性内切酶的识别位点和切割位点的信息，在双链探针上调节内切酶识别位点序列的位置，使该酶的切割位置正好位于DNA结合蛋白的结合位点之中。
5.根据权利要求1所述的一种基于移动切割内切酶的DNA结合蛋白检测方法，其特征为可能含有待检测的DNA结合蛋白的溶液是指细胞的核提取物或蛋白质的表达产物或溶解有该DNA结合蛋白的缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种基于移动切割内切酶的DNA结合蛋白检测方法，其特征为说所述固相载体是指经过物理或化学修饰后能够共价耦合或者物理吸附生物分子的具有较大表面积的固体物质。
7.根据权利要求1所述的一种基于移动切割内切酶的DNA结合蛋白检测方法，其特征为“探针上引入的信号分子”是指可以通过光、电、磁检测到的分子基团。
8.根据权利要求1所述的一种基于移动切割内切酶的DNA结合蛋白检测方法，其特征为“检测固相载体表面残留的信号分子的强度实现间接检测溶液中含有的待检测的DNA结合蛋白的量”是指当待检测的DNA结合蛋白存在并结合到固定化的双链寡核苷酸探针时，由于空间位阻作用，限制性内切酶无法将结合有蛋白质的双链寡核苷酸探针切断，经过冲洗后信号分子仍然保留在固相载体表面，而没有待检测的DNA结合蛋白结合时，双链寡核苷酸探针便会在空闲的DNA结合蛋白结合位点中被限制性内切酶切断，经过冲洗后信号分子无法保留在固相载体表面，固相载体表面保留下来的信号分子数理论上与结合上的DNA结合蛋白的量成正相关，根据固相载体表面残留的信号分子的信号强弱实现对DNA结合蛋白的非标记检测。
全文摘要
一种基于移动切割内切酶的DNA结合蛋白检测方法针对被测的DNA结合蛋白的识别序列设计一段双链核酸探针，其中一条单链5’端标记一个连接基团1并固定到固相载体表面2，另一条单链5’端标记一个信号分子6；在含有待测蛋白的识别位点3的3’端设计一个IIS型内切酶识别位点5，调节两识别位点的间距，使酶切位点4位于待测蛋白结合位点3之中。操作过程为I.将可能含有待测DNA结合蛋白的溶液与固定化的双链探针一起孵育，然后在内切酶体系中进行酶切反应；II.当待测蛋白存在时，信号分子保留在载体表面，而无待测蛋白时，探针便被内切酶在空闲的蛋白结合位点中切断；III.根据信号强度实现对待测蛋白的非标记检测。
文档编号C12Q1/68GK101059518SQ20071002237
公开日2007年10月24日 申请日期2007年5月15日 优先权日2007年5月15日
发明者白云飞, 王进科, 张定东, 孙蓓丽, 葛芹玉, 陆祖宏 申请人:东南大学