专利名称：米根霉固态发酵薯渣生产乳酸新工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于有机酸生产技术领域，特别是涉及乳酸的生产方法。
背景技术：
乳酸是一种重要的有机酸，广泛存在于人体、动植物及微生物中。乳酸是世界公认的三大有机酸之一，是一种多用途的生物化工产品，乳酸、乳酸盐及其衍生物广泛用于食品、医药、饲料、化工、环保、农业等领域中。特别是用L一乳酸生产的聚乳酸(PLA)，除具有聚苯乙烯相似的光泽度和加工性能外，还具有生物可降解性，可用于生产生物降解塑料，为人类长期使用塑料制品所形成废弃物无法处理的难题提供了一种解决的方法，因此其应用前景十分看好。
国际乳酸需求以年均5-8％的速度持续增长，据日本有关专家预测，世界乳酸的潜在需求量可达百万吨级。显而易见，乳酸的市场前景十分看好；由于聚乳酸产量正在快速增加，因此对原料乳酸的需求量的急剧增长，这将极大地推动乳酸的工业化生产。于是有外国学者预言，在有机酸行业柠檬酸年消耗50万吨占主导地位必将有所改变，乳酸生产和需求量将会很块上升至第一位。
目前国内乳酸生产均采用液态发酵生产工艺，主要采用细菌和米根霉发酵两种生产方法；工业生产L-乳酸均以葡萄糖、淀粉为原料，生产成本高，在一定程度上限制了L-乳酸的应用，尤其是限制了聚乳酸作为可降解塑料在环保领域的应用。我国是甘薯生产大国，甘薯年产量约为1.5亿吨，甘薯渣是甘薯淀粉加工的下脚料，其淀粉含量较高，干燥薯渣淀粉含量一般在30～50％左右。薯渣在农村大部分被作为废渣，造成资源浪费，环境污染。因此，以淀粉含量高的薯渣为原料通过固态发酵生产L-乳酸，具有重要的经济和社会意义。采用薯渣为原料生产乳酸可以降低成本，减少环境污染，节约粮食提高农副产品利用率。因此以甘薯渣开发L-乳酸生产技术具有良好的开发应用前景。迄今尚未见到利用米根霉固态发酵薯渣生产乳酸的报道。
发明内容
本发明提供一种米根霉(Rhizopus oryzae)固态发酵生产L-乳酸的方法。
本发明的技术方案概述如下种子制备采用产孢培养基从斜面种子逐级扩大培养获得斜面30～36℃培养3～5天后接入装有产孢培养基的三角瓶或茄子瓶中培养，28～36℃培养70～90小时；根据种子接种量扩培后得到相应数量的米根霉孢子。
固态发酵培养将米根霉种子转接入发酵容器中(三角瓶，曲盘或固态发酵罐)，发酵容器中装有总容积15-60％的固态发酵培养基，培养条件培养温度28～36℃，湿度65～90％，发酵罐通气量10～20L/h，培养时间48～84小时。
本发明中发酵温度以30～36℃为宜，在此温度条件下，菌种发酵周期提前10～24小时，乳酸产量达到34％。
本发明中乳酸产量以甘薯渣干重为基准按照重量百分比计算，糖酸转化率是以淀粉糖含量为基准计算。
本发明中种子制备采用产孢培养基，组成比例为马铃薯600g，葡萄糖60g，琼脂18g，碳酸钙10g，水1000mL，pH自然。
固态发酵培养基各组分种类及重量百分比如下KH2PO40％～0.4％，MgSO40％～0.8％，ZnSO40％～0.2％，MnCl20％～0.2％，碳酸钙添加量20～30％，速效碳源葡萄糖0.5～1.0％，无机氮源选择1％～2％的(NH4)2SO4，其余为甘薯渣；水的添加量为上述组分总重量的60％～70％，pH自然。采用高温灭菌121℃，灭菌20～30分钟。
如说明书附图1所示，本发明中KH2PO4的较优添加量为0％～0.2％，ZnSO4的合适添加量为0.4％～0.8％，MgSO4合适添加量为0.1％～0.2％；MnCl2合适添加量为0％～0.1％。本发明氮源选择1.5％的(NH4)2SO4。
本发明中合适培养基组成为MgSO40.2％，ZnSO40.05％，MnCl20.05％，碳酸钙30％，速效碳源葡萄糖0.5％，(NH4)2SO41.5％，其余为甘薯渣。
本发明中固态发酵接种量控制在含有100g甘薯渣的固体发酵培养基中添加含1.0～9.0×108个孢子的米根霉种子培养料。
本发明中速效碳源葡萄糖合适添加量为0.5％。由于薯渣含单糖较少，微生物生长缓慢，添加速效碳源可以使微生物快速生长，缩短发酵周期，提高薯渣淀粉利用率；但葡萄糖添加过多会产生葡萄糖效应，米根霉利用葡萄糖而不再分泌淀粉酶，本发明研究了葡萄糖对乳酸生产的影响。结果如说明书附图2，葡萄糖的适当添加可以提高乳酸产量，葡萄糖浓度低于0.5％时，乳酸产量低，米根霉生长缓慢；葡萄糖浓度高于1.0％时，米根霉生长迅速，而乳酸产量低，所以葡萄糖合适添加量为0.5％，其他速效碳源，如淀粉糖浆、蔗糖、糖蜜等也可代替葡萄糖。
由于表面活性剂能增加细胞膜的通透性，利于营养物质的进入，产物和酶的释放。本发明选用吐温80进行试验，单因素试验结果见说明书附图3，吐温80添加量为固态发酵培养基重量的0％～0.25％，较优添加量为0.1％～0.2％，最优添加量为0.15％。
本发明中固态发酵培养基中合适水加量为培养基组分重量的65％～70％，在固态发酵中，培养基的湿度关系到微生物的生长状态，从而直接影响产物形成。湿度控制在70～85％。发明中碳酸钙添加量以25～35％为宜。此时按照重量百分比计算乳酸产量达到甘薯渣干重的30％以上。
本发明中甘薯渣来源安徽当地农村淀粉加工作坊获得，自然干燥粉碎后使用，经分析含淀粉39～52％。
本发明也可以用马铃薯渣、木薯渣等替代甘薯渣。
本发明中进一步的多因素优化试验的5因素4水平的正交试验见表1。
表1 L16(45)表头设计
从表1设计的试验结果分析，几种因素对产酸的影响大小顺序为B＞A＞C＞E＞D，各因素的最优水平为A2、B1、C1、D2和E2，即在(NH4)2SO41.5％、MgSO4/ZnSO4/MnCl20.2/0.05/0.05％、葡萄糖0.5％、吐温80 0.05％条件下产L-乳酸水平最高。
根据我们对米根霉PW352液体发酵产L-乳酸的研究[参见工业微生物(2004)，34(1)12-16；微生物学通报(2004)，31(5)5-8]，磷酸盐是培养基组分中不可缺少的成分，而在固态发酵中可以不添加，表明薯渣中含有较多的磷酸盐，足以供给菌体生长的所需。培养基中省去磷酸盐也就降低了生产成本。
本发明中的分析方法如下还原糖的测定以葡萄糖为标准，采用DNS比色法测定。
L-乳酸的测定采用EDTA定钙法测定。
淀粉的测定精确称取干燥的固体曲1.000g，加水煮沸10min，加入0.2ml淀粉酶和0.2ml糖化酶，40℃液化至检测不出淀粉为止，DNS比色法测还原糖量。
pH值用国产精密pH试纸测定。
生物量的测定生物量以发酵曲干重减重表示，测定固体曲的干重，与初始发酵培养基干重相减即得固曲干重减重量。
孢子数量测定采用显微镜测定。
本发明中固态发酵完毕再经浸提、过滤或离心或板框压滤后，采用离子交换等常规方法提取L-乳酸。剩余的残渣可以作为优质饲料。
本发明的有益效果本发明采用的从多株菌种中筛选得到的米根霉菌株是生产L-乳酸的优良菌株，它能在淀粉质培养基中受诱导分泌胞外淀粉酶和糖化酶，对含淀粉质原料进行边糖化边发酵的作用，不必另外添加淀粉酶和糖化酶，适合于固态发酵法直接转化淀粉发酵生产L-乳酸；实验结果表明，采用该菌种以甘薯渣为原料固态发酵生产L-乳酸切实可行。本发明采用固态发酵技术生产乳酸和液体发酵相比较，不用搅拌，可以节省能源消耗，降低生产成本。本发明采用米根霉以薯渣为原料利用固态发酵技术生产乳酸，提供了一种乳酸生产新工艺。残渣又可作为优质饲料。为综合利用甘薯提供了良好的解决方案。本发明优选的培养基组成及含量有效保证了乳酸的产量。本发明优选的固态发酵培养条件进一步促进了菌种的繁殖和乳酸的积累。
图1筛选无机盐的正交设计直观分析图；图2速效碳源葡萄糖对产L-乳酸的影响；图3吐温80对产L-乳酸的影响；图4固态发酵动力学曲线；具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
例1米根霉PW352斜面种子培养36℃培养3天；固态发酵培养培养基常规高温灭菌，接种1～2ml孢子悬液(1×107个孢子/ml)，搅拌均匀，34℃培养3天，发酵容器为250ml三角瓶。
固态发酵培养基组成为甘薯渣10g，其余各组分占甘薯渣的重量百分比如下KH2PO40％，MgSO40.60％，ZnSO40.15％，MnCl20.15％，碳酸钙添加量20％，葡萄糖1.0％，氮源选择2.0％的(NH4)2SO4，吐温80 0.10％，添加上述组分总重量66～70％的水，pH自然。
发酵72h产L-乳酸量达到甘薯渣重量的31.71(±0.72)％(w/w)，对淀粉糖的转化率为57.38％(±1.30)。
例2种子制备与固态发酵条件同例1，发酵容器为250ml三角瓶。
固态发酵培养基组分为甘薯渣10g，ZnSO40.20％，MgSO40.80％，MnCl20.20％，碳酸钙添加量20％，葡萄糖0.50％，(NH4)2SO42.5％，吐温80 0.15％，添加上述组分总重量70％的水，pH自然。
发酵72h产L-乳酸量达到甘薯渣重量的28.74(±0.48)％(w/w)，对淀粉糖的转化率为52.01％。
例3种子制备与固态发酵条件同例1，发酵容器为250ml三角瓶。
固态发酵培养基组分为甘薯渣10g，KH2PO40.4％，ZnSO40.1％，MgSO40.8％，MnCl20％，碳酸钙添加量20％，葡萄糖0.5％，(NH4)2SO42.0％，吐温80 0.20％，添加上述组分总重量70％的水，pH自然。
发酵72h产L-乳酸量达到甘薯渣重量的24.77(±0.43)％(w/w)，对淀粉糖的转化率为44.82％(±0.78)。
例4种子制备条件同例1，固态发酵培养基常规高温灭菌，接种量为1.0×107个孢子/10g干培养基，搅拌均匀，28℃培养3天，发酵容器为250ml三角瓶。
固态发酵培养基组分为甘薯渣10g，ZnSO40.10％，MgSO40.40％，MnCl20.10％，碳酸钙添加量20％，葡萄糖0.75％，(NH4)2SO41.5％，吐温80 0.20％，添加上述组分总重量70％的水，pH自然。
发酵72h产L-乳酸量达到甘薯渣重量的31.44(±0.16)％(w/w)，对淀粉糖的转化率为58.33％(±0.29)。
例5种子制备同例1，固态发酵培养基常规高温灭菌，接种量为1.0×107个孢子/10g干培养基，搅拌均匀，36℃培养3天，发酵容器为250ml三角瓶。
优化的固态发酵培养基组成为甘薯渣10克，ZnSO40.05％，MgSO40.2％，MnCl20.05％，(NH4)2SO41.5％，葡萄糖0.5％，吐温80 0.05％，碳酸钙添加量30％。添加上述组分总重量70％的水，pH自然。按常规灭菌。
发酵48h产乳酸达36.48(±0.74)％(w/w)，对淀粉糖的转化率为66.02％(±1.34)。
例6种子制备与固态发酵条件同例1，固态发酵容器为500ml三角瓶。
固态发酵培养基组成为甘薯渣20克，其余各组分占甘薯渣的重量百分比如下KH2PO40％，MgSO40.40％，ZnSO40.10％，MnCl20.10％，碳酸钙添加量30％，葡萄糖0.5％，氮源选择1.5％的(NH4)2SO4，吐温80 0.05％，添加上述组分总重量66～70％的水，pH自然。
发酵72h产L-乳酸量达到甘薯渣重量的30.27(±0.46)％(w/w)，对淀粉糖的转化率为54.78％(±0.83)。
例7种子制备同例1，发酵容器为曲盘。
固态发酵培养基组成为甘薯渣45～50克，ZnSO40.05％，MgSO40.2％，MnCl20.05％，(NH4)2SO41.5％，葡萄糖0.5％，吐温80 0.05％，碳酸钙添加量30％。添加上述组分总重量70％的水，pH自然。曲盘大小为20cm×12cm×5cm，按常规灭菌。接种量为1.0×107个孢子/10g干培养基，在36℃条件下培养。从附图4可见根霉固态发酵产L-乳酸的动力学特征还原糖量从发酵8h开始迅速增大，24h达最大值，此后开始下降；淀粉相对残留量从8h开始迅速下降，24h后变化较小，这与还原糖变化相对应。由此推断在发酵24h时固体曲淀粉酶活力达最大值，淀粉被迅速水解为葡萄糖；米根霉在经过8h的延滞期后，进入快速生长期，48h后生长减慢；乳酸积累在16～32h增长最快，此后增长缓慢；发酵72h产乳酸达38.36(±0.51)％(w/w)，对淀粉糖的转化率为69.42％(±0.92)。从降低成本考虑，以48h结束发酵为宜。
例8种子制备同例1，发酵容器为固态发酵罐。
固态发酵培养基组成比例同例3，按常规灭菌，冷却后，接种拌匀，在无菌操作条件下装入灭过菌的2～5L的固态发酵罐中。发酵罐为圆柱体，罐下部装有带网空的隔板。隔板下部侧面有一入口管，通入增湿的无菌空气；罐的上侧面有一尾气出口管。装料量部超过发酵罐上部总体积的2/3，34～36℃通气培养48～60h，通气量为10～20L/h。乳酸产量42.27(±2.10)％(w/w)，淀粉糖转化率76.49(±3.80)％。
权利要求
1.一种米根霉固态发酵薯渣生产乳酸新工艺，其生产方法包括如下步骤种子制备从米根霉斜面种子逐级扩培获得斜面30～36℃培养3～5天，接入产孢培养基中培养，28～36℃培养70～90小时，得到米根霉孢子；固态发酵培养将米根霉孢子转接入装有固态发酵培养基的容器中，培养条件培养温度28～36℃，湿度65-90％，培养时间48～84小时。
2.根据权利要求1所述的米根霉固态发酵薯渣生产乳酸新工艺，其特征在于所述固态发酵培养基组成的重量百分比为KH2PO40％～0.4％，MgSO40％～0.8％，ZnSO40％～0.2％，MnCl20％～0.2％，碳酸钙添加量20～30％，速效碳源葡萄糖0.3～1.0％，氮源选择1.5％～2.5％的(NH4)2SO4，吐温80 0.05～0.20％，其余为甘薯渣；添加上述组分总重量60％～70％(w/w)的水，pH自然。
3.根据权利要求1所述的米根霉固态发酵薯渣生产乳酸新工艺，其特征在于所述固态发酵接种量为1.0～9.0×108个米根霉孢子/100g甘薯渣；培养条件为培养温度30～36℃，湿度65-90％，发酵容器通风量10～20L/小时，培养时间48～84小时。
4.、根据权利要求2所述的米根霉固态发酵薯渣生产乳酸新工艺，其特征在于所述固态发酵培养基中葡萄糖的添加量为0.5％。
5.根据权利要求2所述的一种米根霉固态发酵薯渣生产乳酸新工艺，其特征在于所述固态发酵培养基中添加0.05％～0.20％(w/w)的吐温80。
6.根据权利要求2所述的米根霉固态发酵薯渣生产乳酸新工艺，其特征在于所述碳酸钙添加量为25～30％。
7.根据权利要求2所述的米根霉固态发酵薯渣生产乳酸新工艺，其特征在于所述固态发酵培养基组成为MgSO40.2％，ZnSO40.05％，MnCl20.05％，碳酸钙添加量25％，葡萄糖0.5％，(NH4)2SO41.5％，其余为甘薯渣；添加上述组分总重量60～70％的水，pH自然，吐温80添加量为培养基重量的0.05％。
8.根据权利要求2所述的米根霉固态发酵薯渣生产乳酸新工艺，其特征在于所述及的含淀粉质薯渣包括甘薯渣，马铃薯渣或木薯渣中的一种物质或一种以上的混合物质。
9.根据权利要求2所述的米根霉固态发酵薯渣生产乳酸新工艺，其特征在于添加的速效碳源包括葡萄糖，蔗糖，糖蜜及含糖物质的一种物质或一种以上的混合物物质。
全文摘要
本发明涉及一种米根霉固态发酵生产L－乳酸的方法，采用产孢培养基从斜面种子逐级扩大培养获得斜面30～36℃培养3～5天后接入装有产孢培养基的三角瓶或茄子瓶中培养，28～36℃培养70～90小时；根据种子接种量扩培后得到相应数量的米根霉孢子；固态发酵培养将米根霉种子转接入发酵容器中，发酵容器中装有总容积15－60％的固态发酵培养基，培养条件培养温度28～36℃，湿度65～90％，发酵罐通气量10～20L/h，培养时间48～84小时。本发明采用固态发酵技术生产乳酸和液体发酵相比较，不用搅拌，可以节省能源消耗，降低生产成本，保证了乳酸的产量。
文档编号C12R1/845GK101050471SQ200710022019
公开日2007年10月10日 申请日期2007年4月26日 优先权日2007年4月26日
发明者张洁, 潘仁瑞, 沈寿国, 刘献文, 蔡敬民, 葛春梅, 吴克 申请人:合肥学院