专利名称：利用麦麸水解液制备米根霉菌球的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种利用麦麸水解液制备球状根霉属真菌的方法，具体涉及利用农业废弃物麦麸作为底物，通过调节培养基中玉米浆的初始浓度，从而实现对根霉属真菌菌球的制备和调控。
背景技术：
根霉属丝状真菌广泛应用于生产高附加值的工业产品，如有机酸、酶制剂、抗生素、壳聚糖等。其在深层液体发酵过程中，球状颗粒是最佳的菌体形态，同时，菌球的尺寸也直接影响着目标产物的产量和生产效率(Liu, Y.，W. Liao, and S. Chen, Study ofpellet formation of filamentous fungi Rhizopus oryzae using amultiple logisticregression model. Biotechnology and Bioengineering, 2008.99 (I): 117-128. X 丝 状真菌菌球的最适尺寸区间在不同的发酵系统中存在很大差异，过大的菌球使菌体的传氧传质受阻，直接导致菌体的生理代谢水平和目标产物的生物合成效率下降；过小的菌球会使菌体内部形成致密的结构，导致菌球中心部分的菌丝失去活性而无法正常的代谢(Sitanggang, A. B.，Wu, H. S.，Wang, S. S.，Ho, Y. C. 2010. Effect of pellet size andstimulating factor on the glucosamine productionusing Aspergillus sp.BCRC31742. Bioresource Technology, 101 (10)，3595-3601.)。因此，控制合适的菌体形态和菌球尺寸是保证根霉属真菌充分发挥其发酵性能的关键。在传统的丝状真菌菌球制备和调控工艺中，菌体形态和菌球尺寸的大小受不同预培养条件，如中和剂、培养基成分、培养温度、培养基黏度等多种因素的影响。有文献报道，通过调节培养基的初始PH，以及金属离子，如锌、镁、铁和锰的初始浓度来控制菌体形态，并实现对菌球尺寸的调节(Zhou, Y.，Du, J.，Tsao, G. T. 2000. Mycelialpellet formation by Rhizopus oryzae ATCC 20344. AppliedBiochemistry andBiotechnology, 84 (I)，779-789. )。2011年，Zhou等人报道了通过调节培养温度、搅拌速度以及培养基成分如葡萄糖、蛋白胨的初始浓度来调节米根霉菌球直径的大小，以满足发酵富马酸的需要(Zhou, Z. , Du, G. , Hua, Z. , Zhou, J. , Chen, J. 2011. Optimization offumaric acid production by Rhizopus delemar basedon the morphology formation.Bioresource Technology.)。但这些米根霉菌球培养条件受环境扰动剧烈,控制工艺复杂，可操作性差，不利于工业化放大和推广应用。因此，建立一种高效的、能利用低值原料、受环境扰动小的丝状真菌菌球制备和调控策略对工业发酵中，利用根霉属丝状真菌生物合成如富马酸、乳酸、壳聚糖、纤维素酶等高附加值生物基产品具有重要的意义。麦麸是小麦制粉工业中的农业废弃物，在中国每年有将近1000万吨麦麸产生，其价格约为精制糖的1/8，主要作为动物饲料来使用。在现代的生物炼制工业中，环境友好型的处理技术已能够将麦麸这种富含纤维素(4(Γ61%)、蛋白质(15 20%)、淀粉(10 20%)、维生素(O. 5^0. 9%)的廉价农业废弃物转化成微生物可以直接利用的生物质资源，用来生产具有高附加值的生物基平台化合物，如L-乳酸、丁醇、乙醇等(Liu, Z.，et al.，Butanolproduction by Clostridiumbeijerinckii ATCC 55025from wheat bran.Journal ofIndustrial Microbiology andBiotechnology, 2010. 37 (5) :p. 495-501. ) 然而，关于高效利用农业废弃物麦麸制备根霉属丝状真菌菌球的研究尚未见报导，需要做大量的实验研究，以获得能够利用麦麸的最适合根霉属丝状真菌菌球制备方法。
发明内容
本发明目的是提供一种利用麦麸水解液制备球状根霉属真菌的方法，使本工艺能高效的调节根霉属真菌的菌体形态和菌球尺寸，以满足发酵过程中对根霉属真菌菌体形态的要求，提高目标产物的产量和生产效率。为了实现本发明的目标，本发明的技术方案如下本发明公开了一种利用麦麸水解液制备球状根霉属真菌的方法，步骤如下
(I)调制麦麸水溶液的初始浓度为8(Tl20g/L，用硫酸调pH为2，搅拌均匀；在121°C、水解时间为4(T90min的条件下进行水解，自然冷却；每IL麦麸水解混合物中加入ri5g/L Ca (OH) 2，搅拌均匀进行脱毒处理，使麦麸水解混合物pH为4、；脱毒后的麦麸水解混合物离心进行固液分离，上清液即为麦麸水解液，获得的麦麸水解液灭菌备用。(2)将米根霉培养在35°C、7天、PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)斜面上，在室温条件下，用无菌水洗下斜面上的米根霉孢子，制备成IO4IO9个/mL的孢子悬液备用。(3)在三角瓶中，以装液量I :3飞的体积比(v/v)加入麦麸水解液，加入2g/L的CaCO3，接入ImL米根霉孢子悬液培养14 20h。可获得直径区间为2. 6^0. 71mm、光滑分散、尺寸均一的米根霉菌球。通过调节初始阶段玉米浆的添加浓度(T5g/L，可以控制米根霉菌球直径区间为
2.6 0. 71mm。所用水溶液的为自来水、蒸馏水、重蒸水或去离子水。对麦麸水解混合物进行固液分离过程中，分离装置为离心机、板框过滤或滤布过滤。所用无菌水为无菌蒸馏水、无菌去离子水或无菌重蒸水。本发明所用菌种不局限于丝状真菌米根霉，也可以为根霉属的其它丝状真菌。本发明的有益效果在于(I)利用农业废弃物麦麸作为底物，无需固定化载体制备米根霉菌球，大幅地降低了生产成本；(2)仅通过调节玉米浆的初始浓度，即可实现对丝状真菌米根霉菌球尺寸的调控，操作工艺简单；(3)培养pH不需要精确控制，摆脱了丝状真菌培养过程中对pH的依赖，适合工业化应用。
图I :在玉米浆初始浓度为4g/L条件下(CaC032g/L、麦麸水解液100g/L、200rpm、35°C、培养16h)，获得的平均直径为I. 25mm的米根霉菌球。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明实施例I :麦麸的浓度80g/L(其取值范围在8(Tl00g/L)，用10mol/L硫酸调pH为2，搅拌均匀。在121°C、水解时间为45min(其取值范围在4(T60min)的条件下进行水解，自然冷却至室温10°C ;每IL麦麸水解混合物中加入约4g(其取值范围在4 6g)的Ca(OH)2，搅拌均匀进行脱毒处理，使麦麸水解混合物的PH约为4，进行离心，上清液即为麦麸水解液，获得的麦麸水解液在115°C、30min的条件下灭菌备用。将米根霉(ATCC 20344，购买自美国模式培养物集存库)培养在35°C、7天、PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)斜面，在20°C下，用无菌水洗下斜面上的米根霉孢子，制备成IO4个/mL(其取值范围在IO4IO6个/mL)的孢子悬液备用。以装液量I :3的体积比加入麦麸水解液，加入2g/L的CaCO3，初始浓度为O. lg/L(其取值范围在(T3g/L)的玉米浆，接种量为ImL,在恒温培养箱中培养在35°C、200rpm，培养时间为18h (其取值范围在16 20h)，可获得平均直径为2. 6mm的米根霉菌球。实施例2:麦麸的浓度100g/L(其取值范围在9(Tll0g/L)，用6mol/L硫酸调pH为2，搅拌均匀。在121°C、水解时间为60min(其取值范围在5(T70min)的条件下进行水解，自然冷却至·250C ;每IL麦麸水解混合物中加入约8g(其取值范围在6 IOg)的Ca (OH) 2，搅拌均匀进行脱毒处理，使麦麸水解混合物的pH约为6. 5，进行板框过滤，液体部分即为麦麸水解液，获得的麦麸水解液在115°C、30min的条件下灭菌备用。将米根霉(ATCC 20344，购买自美国模式培养物集存库)培养在35°C、7天、PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)斜面上，在20°C下，用无菌水洗下斜面上的米根霉孢子，制备成IO9个/mL(其取值范围在107 109个/mL)的孢子悬液备用。以装液量I :6的体积比加入麦麸水解液，加入2g/L的CaCO3，初始浓度为2g/L(其取值范围在f 3g/L)的玉米浆，接种量为lmL，在恒温培养箱中培养在35°C、200rpm，培养时间为14h(其取值范围在14 18h)，可获得平均直径2. Omm的米根霉菌球。实施例3 麦麸的浓度100g/L(其取值范围在9(Tll0g/L)，用3mol/L硫酸调pH为2，搅拌均匀。在121°C、水解时间为90min(其取值范围在7(T90min)的条件下进行水解，自然冷却至350C ;每IL麦麸水解混合物中加入约15g(其取值范围在12 15g)的Ca(OH)2，搅拌均匀进行脱毒处理，使麦麸水解混合物的PH约为9，进行12000rpm，IOmin离心，上清液即为麦麸水解液，获得的麦麸水解液在115°C、30min的条件下灭菌备用。将米根霉(ATCC 20344，购买自美国模式培养物集存库)培养在35°C、7天、PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)斜面上，在20°C下，用无菌水洗下斜面上的米根霉孢子，制备成IO7个/mL(其取值范围在10卜108个/mL)的孢子悬液备用。以装液量I :5的体积比加入麦麸水解液，加入2g/L的CaCO3，初始浓度为4g/L(其取值范围在3飞g/L)的玉米浆，接种量为lmL，在恒温培养箱中培养在35°C、200rpm，培养时间为16h(其取值范围在14 18h)，可获得平均直径I. 25mm的米根霉菌球。实施例4 麦麸的浓度120g/L(其取值范围在10(Tl20g/L)，用6mol/L硫酸调pH为2，搅拌均匀。在121°C、水解时间为40min(其取值范围在4(T60min)的条件下进行水解，自然冷却至25°C ;每IL麦麸水解混合物中加入约12g(其取值范围在12 15g)的Ca (OH)2，搅拌均匀进行脱毒处理，使麦麸水解混合物的PH约为8，进行lOOOOrpm，20min离心，上清液即为麦麸水解液，获得的麦麸水解液在115°C、30min的条件下灭菌备用。将米根霉(ATCC 20344，购买自美国模式培养物集存库)培养在35°C、7天、PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)斜面上，在20°C下，用无菌水洗下斜面上的米根霉孢子，制备成IO6个/mL(其取值范围在1(Τ107个/mL)的孢子悬液备用。以装液量I :4的比体积加入麦麸水解液，加入2g/L(其取值范围在f 3g/L)的CaCO3，初始浓度为5g/L的玉米浆，接种量为lmL，在恒温培养箱中培养在35°C、200rpm，培养时间为20h(其取值范围在18 20h)，可获得平均直径O. 71mm的米根霉菌球。实施例5 麦麸的浓度100g/L(其取值范围在10(Tl20g/L)，用6mol/L硫酸调pH为2，搅拌均匀。在121°C、水解时间为60min(其取值范围在4(T80min)的条件下进行水解，自然冷却至20°C ;每IL麦麸水解混合物中加入约9g(其取值范围在7 IIg)的Ca (OH)2，搅拌均匀进 行脱毒处理，使麦麸水解混合物的PH约为6，进行lOOOOrpm，25mim离心，上清液即为麦麸水解液，获得的麦麸水解液在115°C、30min的条件下灭菌备用。将少根根霉(NRRL 1526，购买自美国农业研究菌种保藏中心)培养在35°C、7天、PDA (马铃薯葡萄糖琼脂)斜面上，在20°C下，用无菌水洗下斜面上的少根根霉孢子，制备成IO9个/mL(其取值范围在107 109个/mL)的孢子悬液备用。以装液量I :5的体积比加入麦麸水解液，加入2g/L的CaCO3，初始浓度为O. lg/L(其取值范围在(T3g/L)的玉米浆，接种量为lmL，在恒温培养箱中培养在35°C、200rpm，培养时间为16h (其取值范围在14 18h)，可获得平均直径为2. 4mm的米根霉菌球。本发明不局限于实施例中所描述的技术，它的描述是说明性的，并非限制性的。本发明由权限要求所限定，本领域技术人员依据本发明所能够变化、重组等方法得到的与本发明相关的技术，都在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种利用麦麸水解液制备球状根霉属真菌的方法，其特征在于步骤如下 (1)调制麦麸水溶液的初始浓度为8(Tl20g/L，用硫酸调pH为2，搅拌均匀；在121°C、水解时间为4(T90min的条件下进行水解，自然冷却；在麦麸水解混合物中加入ri5g/LCa(OH)2，搅拌均匀进行脱毒处理，使麦麸水解混合物pH为4、；脱毒后的麦麸水解混合物进行固液分离，液体部分即为麦麸水解液，获得的麦麸水解液灭菌备用； (2)将米根霉培养在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)斜面上，在室温条件下，用无菌水洗下斜面上的米根霉孢子，制备成IO4IO9个/mL的孢子悬液备用； (3)在三角瓶中，以装液量I:3飞的体积比加入麦麸水解液，加入2g/L的CaCO3，接入ImL米根霉孢子悬液，培养14 20h ;获得直径区间为2. 6^0. 71mm的米根霉菌球。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)中所用液体为自来水、蒸馏水、重蒸水或去离子水。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，对麦麸水解混合物进行固液分离过程中，分离装置为离心机、板框过滤或滤布过滤。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，孢子悬液制备过程中，所用无菌水为无菌蒸馏水、无菌去离子水或无菌重蒸水。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，本发明所用菌种不局限于丝状真菌米根霉，也可以为根霉属的其它丝状真菌。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(3)所述的培养温度为25 37°C。
全文摘要
本发明涉及一种利用麦麸水解液制备球状根霉属真菌的方法，调制麦麸水溶液的浓度为80~120g/L，硫酸调pH为2，搅拌均匀；在121℃水解，每1L麦麸水解混合物中加入4~15g/L Ca(OH)2，混合物pH为4~9；混合物离心进行固液分离，上清液即为麦麸水解液。将米根霉培养在35℃、7天、PDA斜面上，在室温条件下，用无菌水洗下斜面上的米根霉孢子，制备成104~109个/mL的孢子悬液备用。加入麦麸水解液，加入CaCO3，接入1mL米根霉孢子悬液培养14~20h。获得直径区间为2.6~0.71mm尺寸均一的米根霉菌球。本发明降低了生产成本；摆脱了丝状真菌培养过程中对pH的依赖，适合工业化应用。
文档编号C12N1/14GK102899257SQ20121038118
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月9日 优先权日2012年10月9日
发明者闻建平, 于守智, 王冠一 申请人:天津大学