专利名称：一种生物保鲜菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种用于水果蔬菜的生物保鲜菌剂及其制备方法。
背景技术：
具有乙烯跃变性的水果如香蕉、草莓、番茄、草莓、桃、苹果等，在果实成熟后到达变软的过程中有乙烯大量产生的过程，因此香蕉、苹果等在长期保存和长期运输的过程中是用包装箱密封包装并在包装箱中加入乙烯抑制剂以达到保鲜目的。
ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸1-aminocyclopropane-1 carboxylic acid)脱氨酶是以植物正常生理过程中乙烯代谢的前体物质ACC为唯一氮源的细菌分泌的水解酶，它能水解ACC，产生α-丁酮酸和氨，阻止植物乙烯生成和释放。Kloepper等研究用ACC脱氨酶处理种子降低种子内的乙烯水平。Monsanto公司的Klee等首先将此酶表达基因转入番茄植物中，获得了转基因的番茄果实，乙烯生物合成的抑制率达97％，从而果实成熟明显延迟，且转基因的番茄能够正常开花结实，其果实在室温下保存期长达4个月。ACC脱氨酶的优势之处在于它破坏ACC，而不是靠反义抑制，因此，它具有通用性，可用于不同的作物，最近Jia等人又从青霉菌Penicillium sp.中得到了ACC脱氨酶，发现它与已发现的假单胞杆菌Pseudomonas sp.及土星汉逊酵母(Hanseunla saturnus)中的ACC脱氨酶分别有50％和54％的同源性。可见自然界中也存在着多种类型的ACC脱氨酶。
虽然转ACC脱氨酶基因技术用于果蔬保鲜已有报道，但转基因食品或多或少的存在着安全问题。因此开发生物保鲜剂，特别是开发在生产和应用中都不产生任何对环境有害的生物保鲜剂尤为重要。
蔬菜、水果生物保鲜剂的研究适应于当前有机食品的要求，国内国外研究的水果、蔬菜生物保鲜剂基本是应用生物产品的提取物质如植物、动物、微生物的提取物及代谢产物；应用的保鲜原理是抑菌、成膜保湿、抑制呼吸等，这些保鲜剂种类应确切的说是生物产品保鲜剂，如大豆、麦糠提取物，微生物发酵液提取物等。应用活菌作生物保鲜的研究现在只注重拮抗微生物对蔬菜水果的产后病原菌的防治。如Korsten L等(1993)从喷洒过、以及未喷洒过化学药剂的荔枝树上，分离得到了3个拮抗细菌，分别为Bacillusstearothermophilus、B.megaterium和B.licheniformis，离体试验表明，这些拮抗菌能有效地抑制Phomopsis sp.、Pestalotia sp.、Alternaria alternata、Penicillium sp.和7个未鉴定的荔枝采后致病菌，单独使用或混合使用这些拮抗菌，对于减少采后荔枝的腐烂、病害侵染和果实褐变比用热的水溶性苯菌灵的处理效果好。与苯菌灵处理相比较，从油梨(Perseaamericana)上分离得到的拮抗菌B.subtilis对减少荔枝采后果实腐烂更有效。用枯草杆菌控制鳄梨的褐腐病。这些研究中筛选出许多拮抗菌有细菌、真菌、少量链霉菌作为防治果疏采后病害的生防菌剂。但应用具酶活的植物内生细菌抑制植物乙烯生成达到水果和蔬菜保鲜的研究未见有报道。
在蔬菜水果表皮内大量的定植着内生细菌，这些内生细菌一部分种类在长期与植物共生中会依据其内生的条件产生能分解ACC的酶活特性，在自然条件下这些酶活内生细菌的数量较少，发挥抑制乙烯的作用也小。如果能从内生细菌中得到酶活高的、一定数量的、定植性强的菌种并制成菌剂，将有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物保鲜菌剂的制备方法，该菌剂的菌种从植物内生的具有ACC脱氨酶酶活细菌中筛选获得。
所说的生物保鲜菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)果蔬内生酶活菌的获得取新鲜的乙烯跃变性的果实，表面消毒后取果皮和果肉相连部分，在无菌匀浆器中研磨成浆液，用无菌水稀释，稀释液在富积假单胞菌的PAF培养基中富积培养，富积培养后的细菌转接到以ACC为唯一氮源的ADF培养液中培养，然后稀释分离所有能利用ACC的细菌，并纯化菌株；(2)定植菌株的筛选上述(1)得到的菌株用抗利福平标记方法，通过回接再分离选取能在果实或蔬菜植株内部和表面定值7天达105cfu/mL以上的菌株；(3)具有ACC脱氨酶酶活高的菌株的获得分别纯化上述(2)筛选到的菌株，测定各个菌株的ACC脱氨酶的酶活，选取酶活单位在0.2U/mg以上的菌株，再经2-3次反复回接再分离和ACC脱氨酶酶活测定，选择其中酶活性和定植性保持不变的菌株即为目标菌株；(4)果蔬生物保鲜菌剂的制备将上述(3)筛选得到的菌株，经菌种复壮及一级菌种、二级菌种、种子罐、发酵罐培养，再离心收集菌体、冷冻干燥等步骤得到果蔬生物保鲜菌剂。
上述所说的乙烯跃变性的果实，优选香蕉、草莓、番茄、黄瓜或青椒。
在上述步骤(2)中，在用抗利福平标记方法筛选前，可先通过无菌苗接种方法进行初筛得到能定植的菌株。这样可以降低成本和简化程序。
通过上述的富积诱导和逐步淘汰的筛选法就得到具有ACC脱氨酶的酶活细菌。
本发明的另一个目的是提供一种果蔬生物保鲜菌剂。
所说的果蔬生物保鲜菌剂，其特征在于，是由上述(1)-(4)步骤制得。
将所制得的菌剂稀释后喷施到果实的表面，可以抑制乙烯生成起到保鲜的作用。
通过本发明的方法，能获得具有ACC脱氨酶抑制乙烯产生的植物内生菌菌株，这些筛选得到的菌株经制成菌剂，能用于生产果蔬保鲜菌剂，能有效抑制果蔬乙烯跃变初期的乙烯，延缓果实成熟，增加蔬菜水果的保藏期。生产和使用方法简单，技术易推广。
图1是植物内生的具保鲜功能的酶活菌株获得流程图
具体实施例方式实施例1香蕉生物保鲜菌剂的制备1、香蕉内生酶活菌株的获得初筛将处于乙烯跃变期黄色的香蕉用70％乙醇浸泡15分钟。再用1％的次氯酸钠消毒15分钟后用无菌水充分洗净，用无菌滤纸吸干。取香蕉内皮称重10g在无菌匀浆器中研磨成浆液置于盛有90mL无菌水(内有适量玻璃珠)的250mL三角瓶内，振荡制成悬浮液。每样品转移1mL悬浮液至50mL PAF培养液中(蛋白胨10g，酪蛋白水解物10g，MgSO41.5g，K2HPO41.5g，甘油10mL，pH7.0)，在28℃旋转摇床200r/min条件下培养24h。然后，转移1mL菌悬液至另一50mL PAF培养液中，同等条件下培养24h。第三天，从PAF培养液中转移1mL菌悬液至50mL DF培养液中(母液为KH2PO44.0g，Na2HPO46.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖酸2.0g，柠檬酸2.0g和微量元素FeSO4.7H2O 1mg，H3BO310μg，MgSO4.7H2O11.19μg，ZnSO4.7H2O 124.6μg，CuSO4.5H2O 78.22μg，MoO310μg，用时加(NH4)2SO42.0g，pH7.2)，同等条件下培养24h。第四天，再转移1mL菌悬液至50mLADF培养液中(DF母液加ACC3.0mM为唯一氮源的培养基，pH7.2)，同等条件下培养24h，用于ACC脱氨酶活性细菌的筛选。
梯度稀释ADF培养液中菌悬液涂布于ADF固体平板，28℃恒温箱中培养72h，挑取单菌落纯化后保存于TSB培养基(胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.5g，K2HPO42.5g，pH7.1～7.5)斜面。所筛选菌株接种于DF和ADF培养液中，在600nm处测光密度，以枯草芽孢杆菌为对照，重复三次。确定在ADF培养基中生长的菌株为酶活菌株。共筛选到酶活菌株13株。
上述操作中凡涉及ACC为唯一氮源的步骤都应严格避免其它氮源的污染，各种器皿均需经重铬酸钾洗液浸泡过夜，双蒸水洗净。所用琼脂为流水反复洗涤的琼脂条或高纯度琼脂粉。
2、在香蕉定植性菌株的筛选对上述筛到的酶活菌株进行抗利福平的标记，直至每株菌最后筛选到抗利福平300μg/mL的突变体菌株。将抗利福平300μg/mL的菌株分别经不含药的肉汤平板交替继续培养数代，再接回利福平300μg/mL的培养基检测，以证实抗药性的遗传稳定性。观察突变菌株的培养性状及测定其ACC脱氨酶活力。将抗利福平标记的菌株在TSB培养液中24h的纯培养物4℃离心收集，无菌水洗涤离心两次后重悬浮于100mM MgSO4溶液中，在600nm处调整菌悬液光密度为1.2±0.02(菌数约108cell/mL)。将果实表面消毒，每处理20个果实，每种果实分设表面划伤和不划伤处理，用无菌喷雾器均匀喷洒果实表面，以100mM MgSO4无菌溶液处理为对照。分5天、7天、10天，每处理取5g样品在无菌匀浆器中研磨成浆液置于45mL无菌水中梯度稀释，于含利福平300μg/mL的TSB平板上培养计数。
7天后检测果实中仍能保持105cfu/mL(每克样品的菌落形成单位)以上的数量级，确定为定植菌株，经反复回接试验证明，共筛到定植菌株6株。
3、香蕉ACC脱氨酶活性高菌株的获得ACC脱氨酶的诱导将上述筛选到的酶活菌株和定植的菌株在TSB培养液中24h的纯培养物4℃离心收集，用DF母液洗涤离心两次，菌体悬浮于ADF培养液，在28℃旋转摇床200r/min的条件下培养24h，以诱导产生ACC脱氨酶。
ACC脱氨酶活性的测定4℃条件下离心收集菌体，用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.6)洗涤离心两次，重悬浮于600μL 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中，加入30μL甲苯并迅速振荡30s以破碎细胞，转移200μL含甲苯的细胞提取物，加入20μ L0.5 MACC混匀，立即于30℃水浴反应15min，加入1mL0.56M HCl后，混合均匀，离心取1mL上清液，加入800μ L0.56M HCl，然后加入300μL 0.2％2，4-二硝基苯肼(溶于2M HCl溶液中)试剂，摇匀后30℃下反应30min，加入2mL的2M NaOH显色，测540nm下的OD值。ACC脱氨酶的单位酶活为在测酶体系中每分钟形成1μmol α-丁酮酸的活性。
酶活的计算比活力(U/mg)为酶活除以酶蛋白浓度。各菌株酶活性测定均扣除样品对照中自发产物后计算，重复三次。
通过上述的富积诱导和逐步淘汰筛选法，从13株有酶活的香蕉内生的菌株中筛选到1株(代号为SZ5)，该菌株经反复回接再分离及反复酶活测定确定其酶活力达到0.2U/mg以上的，7天后定植浓度保持105cfu/mL以上，初步鉴定为假单胞细菌。
4、保鲜菌剂的制备菌株SZ5经冷冻干燥保存数管，取一管保存菌种经PAF培养基活化，用ADF培养基诱导(如因ACC纯品昂贵或难以得到可选择黄色的香蕉皮加4倍的蒸馏水研磨成浆液，静止取上层液体用0.22μm微孔滤膜无菌过滤，滤液加入DF培养基中制成诱导培养基)。酶活诱导的菌种为一级菌种，一级菌种转入TSB培养基摇瓶发酵24h制成二级菌种，二级菌种接种到5L种子罐中发酵24h，转入70-300L发酵罐发酵24h，(发酵培养基均为TSB，发酵温度28℃，转速150r/min)发酵结束离心发酵液收集菌体，加入脱脂牛奶冷冻干燥，包装制成香蕉生物保鲜菌剂。
5、保鲜活性的测定选取新鲜的香蕉(初开包装箱，绿色，无斑点)置于带盖的搪瓷盘中，每盘8-10个果实，底层铺垫无菌吸水纸保湿。菌株SZ5液体发酵24-48h，离心去发酵液，用无菌水稀释菌液浓度为108cell/ml，喷雾接种到香蕉表面，设喷无菌水为对照，每处理三个重复，置室温下(20-30℃)。分7天和14天调查颜色变化和硬度，喷施菌种的香蕉颜色在7天和14天观察变黄低于对照，黑色斑点少于对照，7天保持一定的硬度，无腐烂，认为有保鲜效果。
实施例2草莓生物保鲜菌剂的制备1、草莓内生酶活菌株的获得初筛将处于成熟期的草莓用70％乙醇浸泡15分钟。再用1％的次氯酸钠消毒15分钟后用无菌水充分洗净，用无菌滤纸吸干。约2mm厚的果皮和果肉称重10g在无菌匀浆器中研磨成浆液置于盛有90mL无菌水(内有适量玻璃珠)的250mL三角瓶内，振荡制成浮液。其余方法参照实施例1。
得到酶活菌株34株。
2、在草莓表皮定植性菌株的筛选方法同实施例1。
上述有酶活的菌株经抗利福平标记后回接到生长的草莓果实上7天后检测果实中仍能保持105cfu/mL(每克样品的菌落形成单位)以上的数量级，确定为定植菌株。筛到定植菌株18株。
3、草莓的ACC脱氨酶活性高菌株的获得方法同实施例1通过上述的富积诱导和逐步淘汰筛选法，从18株草莓内生的酶活菌株和定植菌株中筛选到2株(代号分别为CCM9、BCM2)酶活达到0.2U/mg以上的，7天后定植浓度保持105cfu/mL以上的菌株。
4、保鲜菌剂的制备方法同实施例1，制成草莓生物保鲜菌剂。
5、保鲜活性的测定选取新鲜的草莓(或盆栽结果近成熟的草莓)，果实置于带盖的搪瓷盘中，每盘10-20个果实，底层铺垫无菌吸水纸保湿。菌株CCM9、BCM2液体发酵24-48h，离心去发酵液，用无菌水稀释菌液浓度为108个/ml，喷雾接种到草莓果实表面，设喷无菌水为对照，每处理三个重复，置室温下(20-30℃)；盆栽草莓及大田栽培草莓在摘果3天前喷施菌剂，3天后采摘处理的果实分别置搪瓷盘中保存。分3天和7天调查硬度和腐烂程度，喷施菌种的草莓硬度在3天和7天观察变软低于对照，腐烂少于对照，3天保持一定的硬度，无腐烂，认为有保鲜效果。
实施例3制备番茄生物保鲜菌剂1、番茄内生酶活菌株的获得将处于成熟的番茄用70％乙醇浸泡15分钟。再用1％的次氯酸钠消毒15分钟后用无菌水充分洗净，用无菌滤纸吸干。无菌条件下去除外表皮蜡质后取番茄外皮称重10g在无菌匀浆器中研磨成浆液置于盛有90mL无菌水(内有适量玻璃珠)的250mL三角瓶内，振荡制成浮液。其余方法见实施例1。
得到酶活菌株41株。
2、在番茄定植性菌株的筛选为了减少菌株抗利福平标记的烦琐，减少操作程序，番茄定植菌株的筛选先采用无菌试管苗的接种筛选方法进行初筛。具体方法是番茄种子经70％乙醇浸泡15分钟。再用1％的次氯酸钠消毒置摇床摇15分钟后用无菌水充分洗净，用无菌滤纸吸干，种植入土壤浸液培养基(水和田园土1∶6浸24h，取上清液加入NH4NO350mg/L，KNO350mg/L，MgSO4.7H2O10mg/L，KH2PO45mg/L，蔗糖100mg/L，琼脂20g/L)，每只试管播种一粒种子，28℃光照培养，长出无菌小苗达两叶一心时接种，接种后7天再分离，选取定植7天达105cfu/mL以上的菌株。其余方法见实施例1。
重点菌株经抗利福平标记后再经反复回接再分离，直到筛到7天后检测番茄果实中仍能保持105cfu/mL(每克样品的菌落形成单位)以上的数量级，确定为定植菌株。得到定植菌株18株。
3、番茄ACC脱氨酶活性高菌株的获得方法见实施例1通过上述的富积诱导和逐步淘汰筛选法，从41株番茄内生的菌株中筛选到3株(代号为(CSNG1、CSNG12、CSNG8)酶活达到0.2U/mg以上的，回接果实7天后定植浓度保持105cfu/mL以上菌株。
4、保鲜菌剂的制备方法同实施例1，制成番茄生物保鲜菌剂。
5、保鲜活性的测定选取新鲜的番茄(或田间近成熟的番茄)，番茄果实置于带盖的搪瓷盘中，每盘10-20个果实，底层铺垫无菌吸水纸保湿。菌株CSNG1、CSNG12、CSNG8液体发酵24-48h，离心去发酵液，用无菌水稀释菌液浓度为108个/ml，喷雾接种到番茄果实表面，设喷无菌水为对照，每处理三个重复，置室温下(20-30℃)；田间栽培番茄在摘果3天前喷施菌剂，3天后采摘处理的果实分别置搪瓷盘中保存。分7天和14天调查果实颜色变化、硬度和腐烂程度，喷施菌种的番茄颜色在7天和14天观察变红程度低于对照，硬度高于对照，腐烂少于对照，7天保持一定的硬度，无腐烂，认为有保鲜效果。
实施例4青椒生物保鲜菌剂的制备1、青椒内生酶活菌株的获得初筛将处于成熟的青椒用70％乙醇浸泡15分钟。再用1％的次氯酸钠消毒15分钟后用无菌水充分洗净，用无菌滤纸吸干。去除外表皮蜡质后取青椒外皮称重10g在无菌匀浆器中研磨成浆液置于盛有90mL无菌水(内有适量玻璃珠)的250mL三角瓶内，振荡制成浮液。其他方法见实施例1。
得到酶活菌株12株。
2、在青椒表皮定植性菌株的筛选定植菌株无菌苗的初筛方法见实施例3。其余方法见实施例1。
上述有酶活的菌株经抗利福平标记后经反复回接再分离直到接种青椒果实7天后检测果实中仍能保持105cfu/mL(每克样品的菌落形成单位)以上的数量级，确定为定植菌株12株。
3、青椒ACC脱氨酶活性高菌株的获得方法见实施例1通过上述的富积诱导和逐步淘汰筛选法，从12株青椒内生的定植菌株中筛选到1株(代号为DLJ12)酶活达到0.2U/mg以上的，回接果实7天后定植浓度保持105cfu/mL以上菌株。
4、保鲜菌剂的制备方法同实施例1，制成青椒生物保鲜菌剂。
5、保鲜活性的测定经与实施例3基本相同的方法测定，有较好的保鲜效果。
权利要求
1.一种生物保鲜菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)果蔬内生酶活菌的获得取新鲜的乙烯跃变性的果实，表面消毒后取果皮和果肉相连部分，在无菌匀浆器中研磨成浆液，用无菌水稀释，稀释液在富积假单胞菌的PAF培养基中富积培养，富积培养后的细菌转接到以ACC为唯一氮源的ADF培养液中培养，然后稀释分离所有能利用ACC的细菌，并纯化菌株；(2)定植菌株的筛选上述(1)得到的菌株用抗利福平标记方法，通过回接再分离选取能在果实或蔬菜植株内部和表面定值7天达105cfu/mL以上的菌株；(3)具有ACC脱氨酶酶活高的菌株的获得分别纯化上述(2)筛选到的菌株，测定各个菌株的ACC脱氨酶的酶活，选取酶活单位在0.2U/mg以上的菌株，再经2-3次反复回接再分离和ACC脱氨酶酶活测定，选择其中酶活性和定植性保持不变的菌株即为目标菌株；(4)将上述(3)筛选得到的菌株，经菌种复壮及一级菌种、二级菌种、种子罐、发酵罐培养，再离心收集菌体、冷冻干燥等步骤得到果蔬生物保鲜菌剂。
2.根据权利要求1所说的生物保鲜菌剂的制备方法，其特征在于，其中所说的乙烯跃变性的果实，是香蕉、草莓、番茄、黄瓜或青椒。
3.根据权利要求1所说的生物保鲜菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，在用抗利福平标记方法筛选前，先通过无菌苗接种方法进行初筛得到能定植的菌株。
4.由权利要求1所说的方法制备得到的生物保鲜菌剂。
全文摘要
本发明涉及一种用于水果蔬菜的生物保鲜菌剂及其制备方法。所说的生物保鲜菌剂的制备方法是(1)从新鲜的乙烯跃变性果实中筛选得到能利用ACC的菌株；(2)将上述(1)得到的菌株用抗利福平标记方法，通过回接再分离选取能在果实或蔬菜植株内部和表面能定值的菌株；(3)纯化上述(2)筛选到的菌株ACC脱氨酶的酶活，选取酶活单位在0.2U/mg以上的菌株，再经2－3次反复回接再分离和ACC脱氨酶酶活测定，选其中酶活性和定植性保持不变的菌株即为目标菌株；(4)将上述(3)筛选得到的菌株，经菌种复壮等步骤得到果蔬生物保鲜菌剂。通过本发明的方法，能获得果蔬保鲜菌剂，能有效延缓果实成熟，增加蔬菜水果的保藏期。
文档编号A23B7/14GK101053342SQ20071002224
公开日2007年10月17日 申请日期2007年5月10日 优先权日2007年5月10日
发明者闫淑珍, 陈双林, 沈萍 申请人:南京师范大学