专利名称：重组鸡痘病毒疫苗rFPV－1218AIH9及其构建方法、用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组鸡痘病毒疫苗，特别是一种用鸡痘病毒新鉴定的复制非必需区构建表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒疫苗。
背景技术：
鸡痘病毒(Fowlpox Virus，FPV)为痘病毒科、禽痘病毒属的成员，是迄今发现的动物病毒中最大的一种病毒。最独特的性质是它们在感染细胞的胞浆复制，而不在细胞核内。成熟的病毒粒子为砖型，大小为250×350nm，FPV的基因组为双股线性DNA，大小约300kb，分子量约为2～4×105KD，G+C含量达35％，且其DNA不具有感染性。通过重组DNA技术，以FPV为载体研制禽类基因工程重组活病毒疫苗，或哺乳动物非复制型重组活病毒载体疫苗受到越来越多研究者的重视。FPV载体与已报道的病毒载体如痘苗病毒、乳头状瘤病毒、腺病毒、细小病毒、马立克氏病病毒、烟草花叶病毒等相比具有明显的优势。FPV自然条件下只感染禽类，但能在哺乳动物细胞产生顿挫性感染，虽不产生有感染性的子代病毒粒子，却能自动合成加工外源抗原并提呈到细胞表面，刺激机体产生免疫应答反应。
已有多种类型的具有生物活性的蛋白质在重组鸡痘病毒(recombinantfowlpox virus，rFPV)中得到表达。如禽流感病毒(AIV)的血凝素基因(HA)、新城疫病毒(NDV)的融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因、马立克氏病病毒(MDV)的gB基因、传染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2基因、狂犬病病毒糖蛋白和麻疹病毒融合蛋白基因等，以表达外源基因的rFPV进行免疫，在SPF鸡或无母源抗体的商品鸡均可提供特异性的免疫保护，因此，FPV载体不仅可以用作家禽的疫苗，而且可以用作哺乳动物的疫苗。
现有技术中，FPV疫苗在商品禽中已使用了70多年，此疫苗可引起轻微的、自限性局部感染。同时，FPV宿主范围较窄，仅感染禽，因此是相对比较安全的疫苗病毒。
鸡痘病毒载体已经研究了近二十年，但能应用于临床的重组病毒寥寥无几，原因何在？一个主要原因就是母源抗体的干扰。商品鸡的母源抗体也很高，其中针对H9N2亚型AIV的母源抗体高达27-28，H5N1亚型AIV的母源抗体也达到了25-26，这就给商品鸡疫苗的使用和疫情的监测带来不便。
Taylor等发现，在有较高ND母源抗体的试验鸡上，共表达NDV F和HN基因的重组FPV的抵抗NDV强毒攻击的免疫保护率较在SPF鸡上有所下降。因此，针对外源基因的抗体干扰了重组FPV的免疫。本室共构建的9个表达HPAIV基因的重组FPV无论是否能够诱导HI抗体，在SPF鸡上均能抵抗强毒AIV的攻击，免疫保护率均为100％，构建的3个共表达HPAIV和MPAIV HA基因的重组苗在SPF鸡上均能抑制MPAIV的排出，免疫效力与油苗相当。而在带有高水平AIV母源抗体的商品鸡上，保护率均有不同程度的下降。表明针对外源蛋白的母源抗体对重组FPV的免疫效力确实存在一定的影响。另有构建的NDV的主要保护性抗原的重组病毒疫苗进行的商品鸡试验试验结果也表明，重组FPV的免疫效力因存在针对NDV或AIV的母源抗体而受到很大的影响(丁炜东，曹丽萍，张体银等.表达新城疫病毒F和HN基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性和免疫效力试验.中国兽医杂志，2005，4110-14.韦栋平，刘玉良，邵卫星等.共表达新城疫F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒.微生物学报，2004，4414-18.)。
为了获得理想的重组病毒首先得进行病毒复制非必需区的克隆与筛选，外源基因只有插入到病毒基因的复制非必需区才有可能实现蛋白产物的表达，而且载体表达外源基因直接受其在载体中插入位点的制约，因此非必需区的获得是构建重组病毒的先决条件。病毒复制非必需区又有严格的非必需区及一般非必需区之分，在构建重组病毒时必须选择严格的复制非必需区，才能维持亲本株的复制能力及保证重组病毒的免疫效力。
研究发现，以前构建的插入载体p11S的复制非必需区FPV7S正好处于开放性阅读框架上，可能破坏了IL-18结合蛋白基因。目前已有学者发现，经细胞表达的IL-18结合蛋白能够抑制机体IL-18依赖性IFN-γ的产生。据实验证实，IL-18是IL-1家族中具有多种功能的致炎症细胞因子，其能够诱导机体产生IFN-γ、Th-1型免疫应答并激活NK细胞的活性，这对小鼠诱导产生有效抗VV感染的免疫应答起到重要的作用。而IL-18结合蛋白可能具有对抗机体炎症反应的功能，对病毒在宿主体内的繁殖与扩散是有利的为了解决这一缺陷，孙蕾，刘武杰，陈素娟等重新筛选了鸡痘病毒严格的复制非必需区FPV12-18，构建了新的插入载体p12-18，该载体于2005年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO1385，长度为10450bp。
发明内容
本发明的第一个目的是为了克服现有载体的不足，能增加重组鸡痘病毒基因工程疫苗在商品鸡群使用的实用性，同时保持和增强重组鸡痘病毒的免疫原性及外源插入基因的表达产物的免疫原性，可使用新的鸡痘病毒表达载体表达外源基因，使得重组鸡痘病毒活疫苗早日商品化，提供一种能在母源抗体阳性的商品鸡群使用的重组鸡痘病毒基因工程疫苗。
本发明重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9为含表达H9亚型禽流感血凝素基因的重组鸡痘病毒疫苗，保藏号为CGMCC 1913。
本发明的重组鸡痘病毒中的外源基因为H9亚型禽流感病毒的血凝素基因，不受母源抗体干扰，能增加重组鸡痘病毒基因工程疫苗在商品鸡群使用的实用性，同时保持和增强重组鸡痘病毒的免疫原性及外源插入基因的表达产物的免疫原性，使得重组鸡痘病毒活疫苗早日应用于临床。
本发明的第二个目的是提供一种重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的构建方法包括以下步骤(1)获得含H9亚型AIV HA基因整个阅读框架的基因；(2)将上述基因置于合适启动子下游，插入到含FPV复制非必需片段FPV12-18和报告基因(LacZ)的插入载体中构建成转移载体p1218AIH9，长度为11800bp；(3)用转移载体p1218AIH9转染已感染wt-FPV的鸡胚成纤维细胞(CEF)，通过同源重组获得表达H9亚型AIV HA基因的rFPV；(4)增殖和收获表达H9亚型AIV HA基因的rFPV，得到重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9。
该疫苗rFPV-1218AIH9，该载体于2007年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 1913。
通过以上方法能得到不受母源抗体干扰的重组鸡痘病毒活疫苗，其方法科学、可靠性强，获得的疫苗稳定性好，纯度高。
上述步骤(1)中H9亚型AIV HA基因可以通过以下方法获得用9-10日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因组的RNA，根据已发表的H9亚型AIV HA基因序列设计一对引物PH9A1 5’-GCTGGATCCGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGCT-3’PH9A2 5’-GTCGGATCCAAGCTTACAAAAAGCCAATTATATACAAATCTTGC-3’先反转录合成cDNA，然后PCR扩增出H9亚型AIV HA基因整个阅读框架。可将H9亚型AIV HA基因连接到T-载体，测序证明所得的基因序列的正确性。
步骤(2)中启动子可以是任何能够在重组鸡痘病毒(rFPV)感染细胞中指导基因转录的FPV启动子、痘苗病毒启动子或人工合成启动子。
步骤(2)中启动子和上述基因通过酶切加接的方法或用PCR设计引物加接的方法连接在一起，按常规方法将其插入到含FPV复制非必须片段FPV12-18和报告基因LacZ的FPV插入载体中，在将此连接产物转化到适当的宿主细胞中，按常规方法纯化并分析重组体，得到转移载体p1218AIH9。可通过碱裂解方法制备转移载体的质粒DNA并以PEG纯化质粒DNA。
转移载体p1218AIH9的构建方法是将质粒pTH9A用HindIII酶切经klenow酶补平，酚氯仿抽提回收线型质粒DNA，再用BamHI酶切电泳回收1.7kb片段，分别与用SmaI和BamHI酶切的载体质粒p12-18连接。
步骤(3)中用GeneJammerTM转染试剂将转移载体分别与wt-FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，将上清稀释液接种长成致密单层的CEF，待出现单个典型蚀斑后，用含有X-gal的营养琼脂覆盖，蓝斑筛选纯化得重组病毒rFPV-p1218AIH9。rFPV中外源基因的插入和表达，可通过核酸杂交、PCR扩增外源基因、重组病毒与特异性抗体结合的反应性及所表达外源基因产物的生物学特性等方法予以鉴定。
步骤(4)中，将表达H9亚型AIV HA基因的rFPV在CEF单层上增殖，使病毒在CEF中大量扩增。长成完全病变后收获，分别吸取0.1ml病毒液，以细胞培养液作连续10倍稀释，取10-4、10-5、10-6三个稀释度的病毒液接种生长于24孔细胞培养板内的形成致密单层的CEF，每个稀释度接种4孔，每孔接种0.1ml病毒液。37℃培养72h，然后观察病变，计算接种每一稀释度病毒液的CEF上形成的蚀斑数目，根据计数结果计算病毒原液中含有的病毒蚀斑形成单位(PFU)。接种实验用动物。
本发明的第三个目的是提供重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的用途，用于防治H9亚型禽流感病毒。鸡皮下注射，注射量为104～106PFU/只。
本方法临床操作，副作用小，不影响流行病学疫情监测。
图1为H9亚型AIV HA基因的PCR扩增产物电泳图谱。
图中，Fig1H9A gene amplified by PCR；M200bp DNA ladder maker；1F株H9A基因PCR产物。
图2为重组质粒p1218AIH9的酶切鉴定电泳图谱。
图中，MDNA Maker III；1EcoRI消化p1218AIH9。
图3为构建含H9亚型AIV HA基因的转移载体p1218AIH9的示意图。
图4为纯化重组病毒感染CEF后形成的兰色空斑照片。
图5为重组病毒感染CEF后表达外源蛋白质的荧光图。
图6为H9亚型禽流感病毒HA基因的序列。
具体实施例方式
以下将结合实施例子与附图具体说明，但是下例实施例子是在进一步解释而不是限制本发明。
本实施例中涉及鸡痘病毒表达载体p12-18，于2005年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO1385，其长度为10450bp。
步骤一H9亚型AIV HA基因的扩增、克隆及序列分析根据已知的H9亚型AIV HA的序列，设计H9N2亚型AIV HA基因的PCR扩增引物。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
H9A基因的扩增引物上游引物PH9A1的5’端引入BamH I位点和Kozak序列；下游引物PH9A2的5’端引入BamHI、HindIII位点外，还引入了痘病毒基因组早期基因的转录终止信号。上、下游引物跨幅约为1.7kb，覆盖整个H9A基因编码框。
PH9A1 5’-GCTGGATCCGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGCT-3’PH9A2 5’-GTCGGATCCAAGCTTACAAAAAGCCAATTATATACAAATCTTGC-3’以质粒pTH9A为模板，用PH9A1和PH9A2引物和Expand High FidelityPCR system对H9A基因进行PCR扩增，使H9A基因翻译起始区前连接一段Kozak序列，终止密码子后连接痘病毒早期转录终止信号T5NT。PCR循环参数94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，一共进行30个循环；循环结束后72℃再延伸10min。PCR产物通过电泳鉴定后，进行回收和纯化，并与pGEM-T easy vector进行连接。用BamHI+HindIII双酶切法筛选，以切出1.7Kb大小条带的质粒为阳性重组质粒，命名为pTH9A。阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测序确证。
步骤二转移载体(p1218AIH9)的构建转移载体(p1218AIH9)的构建策略如图3。
将质粒pTH9A用HindIII酶切经klenow酶补平，酚氯仿抽提回收线型质粒DNA，再用BamHI酶切电泳回收1.7kb片段，分别与用SmaI和BamHI酶切的载体质粒p12-18连接，构建成转移载体p1218AIH9，长度为11800bp。
步骤三转染与纯化转染按GeneJammerTM6转染试剂的说明进行。在60mm培养皿中培养SPF成纤维细胞至形成单层，以0.1MOI的wt-FPV疫苗株感染CEF，37℃培养3～4h，倒去上清用DMEM基础基洗涤两次后加4ml备用。将1-2μgp1218AIH9分别溶于30μl的TE，按1∶6将GeneJammerTM6稀释到100μlDMEM基础培养基中，轻轻混匀，置室温作用15min，将p1218AIH9的上述混合物缓慢滴加至已感染wt-FPV CEF的DMEM基础培养基中混匀；37℃培养6h后换维持液，待细胞完全病变后收获病毒，-70℃～37℃反复冻融3次，低速离心去除细胞碎片，上清用于重组病毒的筛选。
将上清稀释液接种长成致密单层的CEF，待出现单个典型蚀斑后，用含有200μg/ml X-gal的营养琼脂覆盖，37℃培养72h，待出现蓝色蚀斑后挑取蓝色蚀斑进一步克隆纯化，直至在X-gal存在的条件下，重组病毒在CEF上所形成的蚀斑全部呈蓝色。
步骤四表达H9亚型AIV HA基因的不同重组鸡痘病毒的鉴定用rFPV-1218AIH9感染已形成致密单层的CEF，并分别设rFPV-1175H5A和wt-FPV为阳性和阴性对照。在37℃、5％CO2条件下培养直至出现典型蚀斑后，倾去培养液，以PBS(0.01M，pH7.4)轻轻洗涤一次，然后用冷甲醇固定10min；加入稀释度为1∶1000的鼠抗H9亚型AIV G5株的单克隆抗体，37℃孵育1h；以含0.05％吐温-80的0.01M PBS(简称PBST，pH7.2)洗5min×3次，再加入稀释度为1∶200的羊抗鼠IgG-FITC荧光抗体，37℃孵育1h；用PBST洗涤5min×3次后置荧光显微镜下观察并拍照记录结果。
步骤五重组病毒的免疫效力实验1、SPF实验鸡接种rFPVs后抵抗H9亚型AIV感染的免疫保护作用(以攻毒后第5天的排毒为指标)7日龄白来航SPF雏鸡随机分组，分别于颈部皮下免疫rFPV-11SH9A、rFPV-1218AIH9和wt-FPV，104-106PFU/只。PBS对照组和油乳剂灭活苗对照组，0.2ml/只。于免疫后7，10，14，18，21天采血，分离血清检测HI抗体效价。结果发现，各种重组疫苗均能诱生针对H9亚型AIV的特异性HI抗体。由p12-18载体构建的疫苗比由p11S载体构建的相应疫苗诱生的HI抗体水平略高。
在SPF鸡的免疫保护试验中，rFPV-11SH9A和rFPV-p1218AIH9的PI分别为77.78和100。
表1.SPF鸡接种rFPVs后抵抗H9亚型AIV感染的免疫保护作用
2、rFPVs在商品鸡的免疫效力(以攻毒后第5天的排毒为指标)在商品鸡的免疫保护试验中，油乳剂灭活苗的PI为83；rFPV-11SH9A和rFPV-1218AIH9的PI分别为75和83。由p12-18载体构建的重组疫苗分别比相应的由p11S载体构建的重组疫苗的免疫效力略高。
表2.商品蛋鸡接种rFPVs后抵抗H9亚型AIV感染的免疫保护试验
gctggatccg ccaccatgga aacaatatca ctaatagctgtcggatcca agcttacaaa aagccaatta tatacaaatc ttgc
权利要求
1.重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9，其特征在于该疫苗为含表达H9亚型禽流感血凝素基因的重组鸡痘病毒疫苗，保藏号为CGMCC 1913。
2.如权利要求1所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)获得含H9亚型AIV HA基因整个阅读框架的基因；2)将上述基因置于合适启动子下游，插入到含FPV复制非必需片段FPV12-18和报告基因的插入载体中构建成转移载体p1218AIH9；3)用转移载体p1218AIH9转染已感染wt-FPV的鸡胚成纤维细胞，通过同源重组获得表达H9亚型AIV HA基因的rFPV；4)增殖和收获表达H9亚型AIV HA基因的rFPV，得到重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9。
3.根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制备方法，其特征在于步骤1)中H9亚型AIV HA基因可以通过以下方法获得用9-10日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因组的RNA，根据已发表的H9亚型AIV HA基因序列设计一对引物PH9A1 5’-GCTGGATCC ATGGAAACAATATCACTAATAGCT-3’PH9A2 5’-GTCGGATCC GCCAATTATATACAAATCTTGC-3’先反转录合成cDNA，然后PCR扩增出H9亚型AIV HA基因整个阅读框架。
4.根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制备方法，其特征在于步骤(2)中启动子可以是任何能够在重组鸡痘病毒rFPV感染细胞中指导基因转录的FPV启动子、痘苗病毒启动子或人工合成启动子。
5.根据权利要求2或4所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制备方法，其特征在于步骤2)中启动子和上述基因通过酶切加接的方法或用PCR设计引物加接的方法连接在一起，按常规方法将其插入到含FPV复制非必须片段FPV12-18和报告基因LacZ的FPV插入载体中，在将此连接产物转化到适当的宿主细胞中，按常规方法纯化并分析重组体，得到转移载体p1218AIH9。
6.根据权利要求5所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制备方法，其特征在于转移载体p1218AIH9的构建方法是将质粒pTH9A用HindIII酶切经klenow酶补平，酚∶氯仿抽提回收线型质粒DNA，再用BamHI酶切电泳回收1.7kb片段，分别与用SmaI和BamHI酶切的载体质粒p12-18连接。
7.根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制备方法，其特征在于步骤3)中用GeneJammerTM转染试剂将转移载体分别与wt-FPV共转染鸡胚成纤维细胞，将上清稀释液接种长成致密单层的鸡胚成纤维细胞，待出现单个典型蚀斑后，用含有X-gal的营养琼脂覆盖，蓝斑筛选纯化得重组病毒rFPV-p1218AIH9。
8.根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制备方法，其特征在于步骤4)中，将表达H9亚型AIV HA基因的rFPV在鸡胚成纤维细胞单层上增殖，使病毒在鸡胚成纤维细胞中扩增。
9.重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的用途，其特征在于用于防治H9亚型禽流感病毒。
全文摘要
重组鸡痘病毒疫苗rFPV－1218AIH9及其制备方法、用途，涉及一种重组鸡痘病毒疫苗，特别是一种用鸡痘病毒新鉴定的复制非必需区构建表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒疫苗。将含H9亚型AIV HA基因置于启动子下游，插入到含FPV复制非必需片段FPV12－18和报告基因的插入载体中构建成转移载体；用转移载体转染已感染wt－FPV的鸡胚成纤维细胞，通过同源重组获得表达H9亚型AIV HA基因的rFPV；增殖和收获表达H9亚型AIV HA基因的rFPV，得到重组鸡痘病毒疫苗。通过以上方法能得到不受母源抗体干扰的重组鸡痘病毒活疫苗，其方法可靠性强，疫苗稳定件好，纯度高。
文档编号C12N15/63GK101062412SQ20071002268
公开日2007年10月31日 申请日期2007年5月25日 优先权日2007年5月25日
发明者刘秀梵, 陈素娟, 孙蕾, 刘武杰 申请人:扬州大学