本发明涉及生物技术领域，具体涉及奶山羊人工授精技术用稀释液的制备方法。
背景技术：
精液冷冻保存与人工受精技术在现代化畜牧业生产中发挥着举足轻重的作用，应用冷冻精液进行人工授精可以不受时间、地域、品种及个体的限制，并且大量减少公畜的饲养数量，降低生产成本，提高优良种公畜的利用率，提高养殖业的经济效益。我国在奶牛及肉牛上应用冷冻精液技术及人工授精技术已发展的较为完善，在奶山羊人工授精技术推广过程中，由于市场上奶山羊人工授精的稀释液效果不佳，使得人工授精技术推广困难重重。现有的奶山羊稀释液在人工授精的精液稀释环节存在以下问题：精液稀释倍数低，通常只能稀释3倍左右；精液稀释后精子存活时间短，一般在12-24小时以内，精液稀释24小时后精子活力降低，在0.3以下；人工授精母羊受胎率低，一般在65％左右。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种奶山羊人工授精技术用稀释液的制备方法，以克服现有的奶山羊稀释液精液稀释倍数低、精液稀释后精子存活时间短、稀释后精子活力低和人工授精母羊受胎率低的问题。
本发明所采用的技术方案是：
奶山羊人工授精技术用稀释液的制备方法，其具体操作步骤如下：
步骤1，配置基础液
在环境温度为35～40℃的条件下，称取葡萄糖3～5g，柠檬酸钠1～2g和乙二胺四乙酸二钠0.05～0.2g，将这三种物质倒入一个容器中，向容器中加蒸馏水至100ml，搅拌均匀，得到混合溶液；再向该混合溶液中加入恩诺沙星，搅拌均匀，得到基础液；每100mL混合溶液中加入5000UG恩诺沙星；最后将基础液在4℃低温保存；
步骤2，配置保护液
在环境温度为35～40℃的条件下，配置质量分数为10％～15％的乙二醇溶液；再往乙二醇溶液中加入维生素C、维生素B12、催产素和前列腺素；每1ml乙二醇溶液加入0.03～0.10ml维生素C，0.01～0.5ml维生素B12，0.01～0.5ml催产素和0.01～0.5ml前列腺素，得到保护液；将保护液在4℃低温保存；
步骤3，配置营养液
在环境温度为35～40℃的条件下，在质量分数为5％的脱脂羊奶中加入硫酸卡那霉素，得到营养液；其中，100ml体积脱脂羊奶加入10万IU硫酸卡那霉素；将营养液在4℃低温保存；
步骤4，配置精液稀释液
将基础液、保护液和营养液在4℃低温的无菌条件下混合搅拌均匀，得到奶山羊人工授精技术用稀释液。
上述质量分数为5％的脱脂羊奶，其溶质为脱脂后的新鲜羊奶，溶剂为蒸馏水。
步骤4中，按质量百分比，称取60～80％的基础液，5～15％的保护液和15～25％的营养液，以上各组份的质量百分比总和为100％；将这三种物质在4℃低温的无菌条件下混合搅拌均匀，得到奶山羊人工授精技术用稀释液。
本发明的有益效果是，精液稀释倍数可高达30倍，精液稀释后保存时间长达120小时，精液稀释24小时后精子活力达到0.5-0.7，精液稀释120小时后精子活力仍然保持在0.3-0.4，保证母羊人工授精配种受胎率在85％以上；且稀释液配置方法简单，便于技术人员掌握，能有效提升养殖经济效益及人工授精鲜精技术的推广。
具体实施方式
本发明提供一种奶山羊人工授精技术用稀释液的制备方法，其具体操作步骤如下：
步骤1，配置基础液
在环境温度为35～40℃的条件下，称取葡萄糖3～5g，柠檬酸钠1～2g和乙二胺四乙酸二钠0.05～0.2g，将这三种物质倒入一个容器中，向容器中加蒸馏水至100ml，搅拌均匀，得到混合溶液；再向该混合溶液中再加入恩诺沙星，搅拌均匀，得到基础液；每100mL混合溶液中加入5000UG恩诺沙星；最后将基础液在4℃低温保存；
步骤2，配置保护液
在环境温度为35～40℃的条件下，配置质量分数为10％～15％的乙二醇溶液；再往乙二醇溶液中加入维生素C、维生素B12、催产素和前列腺素；每1ml乙二醇溶液加入0.03～0.10ml维生素C，0.01～0.5ml维生素B12，0.01～0.5ml催产素和0.01～0.5ml前列腺素，得到保护液；将保护液在4℃低温保存；
步骤3，配置营养液
在环境温度为35～40℃的条件下，在质量分数为5％的脱脂羊奶中加入硫酸卡那霉素，得到营养液；其中，100ml体积脱脂羊奶加入10万IU硫酸卡那霉素；将营养液在4℃低温保存；另外，质量分数为5％的脱脂羊奶，其溶质为脱脂后的新鲜羊奶，溶剂为蒸馏水。
步骤4，配置精液稀释液
按质量百分比，称取60～80％的基础液，5～15％的保护液和15～25％的营养液，以上各组份的质量百分比总和为100％；将这三种物质在4℃低温的无菌条件下混合搅拌均匀，得到奶山羊人工授精技术用稀释液。
基础液中，葡萄糖不仅充当精子的营养物质，同时它还可以有效的抑制卵磷脂酶的活性，防止精液中溶血卵磷脂的积累。由于葡萄糖是小分子物质，可明显改变稀释液的渗透压，可对精子起到保护作用；柠檬酸钠和乙二胺四乙酸二钠，主要作用是缓冲精子在稀释保存过程中由于代谢产生的废物使精液的pH改变而对精子活力所带来的不良影响，还可以缓和稀释液中离子对精子的损害作用，延长精子存活时间；恩诺沙星为微黄色或淡黄色结晶性粉末，半衰期长，在动物体内有良好的组织分布性，属于广效性抑菌剂，对于革兰氏阳性菌、阴性菌具有抑菌作用。
保护液中，乙二醇是比较理想的精子低温保护剂，可以渗入到精子细胞内部，调节精子细胞内、外渗透压的平衡，对精子起保护作用；维生素C是一种抗氧化剂，保护精子免于自由基的威胁，同时也作为一种辅酶，参与精子的各种代谢；维生素B12是一种生理活性物质，作为精子中几种变位酶的辅酶，延长精子存活时间，提高精卵结合机率；催产素和前列腺素可提高母畜受胎率：促进母畜子宫平滑肌收缩，提高精子运动速度，防止精液倒流，有效促进精卵结合机率。
营养液中，脱脂羊奶中含有丰富的蛋白质，对维持精液pH和鳌合一些金属离子有很好的作用，并能有效的延缓精液保存时低温打击，显著提高稀释后的精子活力；硫酸卡那霉素为氨基糖甙类广谱抗生素，主要对革兰阴性菌及耐药性强的金葡菌也有良好的抗菌作用。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
实施例1
一种奶山羊人工授精技术用稀释液的制备方法，其具体操作步骤如下：
步骤1，配置基础液
在环境温度为40℃的条件下，称取葡萄糖3g，柠檬酸钠2g和乙二胺四乙酸二钠0.1g，将这三种物质倒入一个容器中，向容器中加蒸馏水至100ml，搅拌均匀，得到混合溶液；再向该混合溶液中再加入恩诺沙星，搅拌均匀，得到基础液；每100mL混合溶液中加入5000UG恩诺沙星；最后将基础液在4℃低温保存；
步骤2，配置保护液
在环境温度为40℃的条件下，配置质量分数为11％的乙二醇溶液；再往乙二醇溶液中加入维生素C、维生素B12、催产素和前列腺素；每1ml乙二醇溶液加入0.1ml维生素C，0.15ml维生素B12，0.01ml催产素和0.08ml前列腺素，得到保护液；将保护液在4℃低温保存；
步骤3，配置营养液
在环境温度为40℃的条件下，在质量分数为5％的脱脂羊奶中加入硫酸卡那霉素，得到营养液；其中，100ml体积脱脂羊奶加入10万IU硫酸卡那霉素；将营养液在4℃低温保存；
步骤4，配置精液稀释液
按质量百分比，称取70％的基础液，10％的保护液和20％的营养液，将这三种物质在4℃低温的无菌条件下混合搅拌均匀，得到奶山羊人工授精技术用稀释液。
实施例2
一种奶山羊人工授精技术用稀释液的制备方法，其具体操作步骤如下：
步骤1，配置基础液
在环境温度为35℃的条件下，称取葡萄糖3.5g，柠檬酸钠1.5g和乙二胺四乙酸二钠0.05g，将这三种物质倒入一个容器中，向容器中加蒸馏水至100ml，搅拌均匀，得到混合溶液；再向该混合溶液中再加入恩诺沙星，搅拌均匀，得到基础液；每100mL混合溶液中加入5000UG恩诺沙星；最后将基础液在4℃低温保存；
步骤2，配置保护液
在环境温度为35℃的条件下，配置质量分数为13％的乙二醇溶液；再往乙二醇溶液中加入维生素C、维生素B12、催产素和前列腺素；每1ml乙二醇溶液加入0.08ml维生素C，0.5ml维生素B12，0.1ml催产素和0.01ml前列腺素，得到保护液；将保护液在4℃低温保存；
步骤3，配置营养液
在环境温度为35℃的条件下，在质量分数为5％的脱脂羊奶中加入硫酸卡那霉素，得到营养液；其中，100ml体积脱脂羊奶加入10万IU硫酸卡那霉素；将营养液在4℃低温保存；另外，质量分数为5％的脱脂羊奶，其溶质为脱脂后的新鲜羊奶，溶剂为蒸馏水。
步骤4，配置精液稀释液
按质量百分比，称取60％的基础液，15％的保护液和25％的营养液，将这三种物质在4℃低温的无菌条件下混合搅拌均匀，得到奶山羊人工授精技术用稀释液。
实施例3
一种奶山羊人工授精技术用稀释液的制备方法，其具体操作步骤如下：
步骤1，配置基础液
在环境温度为37℃的条件下，称取葡萄糖4.8g，柠檬酸钠1.2g和乙二胺四乙酸二钠0.18g，将这三种物质倒入一个容器中，向容器中加蒸馏水至100ml，搅拌均匀，得到混合溶液；再向该混合溶液中再加入恩诺沙星，搅拌均匀，得到基础液；每100mL混合溶液中加入5000UG恩诺沙星；最后将基础液在4℃低温保存；
步骤2，配置保护液
在环境温度为37℃的条件下，配置质量分数为15％的乙二醇溶液；再往乙二醇溶液中加入维生素C、维生素B12、催产素和前列腺素；每1ml乙二醇溶液加入0.04ml维生素C，0.01ml维生素B12，0.36ml催产素和0.5ml前列腺素，得到保护液；将保护液在4℃低温保存；
步骤3，配置营养液
在环境温度为37℃的条件下，在质量分数为5％的脱脂羊奶中加入硫酸卡那霉素，得到营养液；其中，100ml体积脱脂羊奶加入10万IU硫酸卡那霉素；将营养液在4℃低温保存；另外，质量分数为5％的脱脂羊奶，其溶质为脱脂后的新鲜羊奶，溶剂为蒸馏水；
步骤4，配置精液稀释液
按质量百分比，称取80％的基础液，5％的保护液和15％的营养液，将这三种物质在4℃低温的无菌条件下混合搅拌均匀，得到奶山羊人工授精技术用稀释液。
实施例4
一种奶山羊人工授精技术用稀释液的制备方法，其具体操作步骤如下：
步骤1，配置基础液
在环境温度为38℃的条件下，称取葡萄糖5g，柠檬酸钠1g和乙二胺四乙酸二钠0.2g，将这三种物质倒入一个容器中，向容器中加蒸馏水至100ml，搅拌均匀，得到混合溶液；再向该混合溶液中再加入恩诺沙星，搅拌均匀，得到基础液；每100mL混合溶液中加入5000UG恩诺沙星；最后将基础液在4℃低温保存；
步骤2，配置保护液
在环境温度为38℃的条件下，配置质量分数为10％的乙二醇溶液；再往乙二醇溶液中加入维生素C、维生素B12、催产素和前列腺素；每1ml乙二醇溶液加入0.03ml维生素C，0.3ml维生素B12，0.5ml催产素和0.27ml前列腺素，得到保护液；将保护液在4℃低温保存；
步骤3，配置营养液
在环境温度为38℃的条件下，在质量分数为5％的脱脂羊奶中加入硫酸卡那霉素，得到营养液；其中，100ml体积脱脂羊奶加入10万IU硫酸卡那霉素；将营养液在4℃低温保存；另外，质量分数为5％的脱脂羊奶，其溶质为脱脂后的新鲜羊奶，溶剂为蒸馏水；
步骤4，配置精液稀释液
按质量百分比，称取65％的基础液，13％的保护液和22％的营养液，将这三种物质在4℃低温的无菌条件下混合搅拌均匀，得到奶山羊人工授精技术用稀释液。
使用方法：1.采集种公羊精液；2.在显微镜下观察此精液是否符合要求，筛选出合格的公羊精液，合格要求为：新鲜精液活力大于0.8且密度大于2.0×109个/mL的精液；3.在4℃的低温环境下，将本发明稀释液和精液按30:1的比例混合，稀释后的有效精子数在0.6×108个/mL以上。
将本发明稀释液和精液混合后，进行4℃低温无菌环境存储，经过不同时间的存储，检测出稀释后精子的性能如表1所示：
表1精液稀释性能测试
精子存活时间：精子存活时间是指精子在一定条件下精子的总存活时间，与受精能力有关，存活时间越长，精子受精能力越强。精子存活时间＝第一次检查时间至倒数第二次检查之间的时间间隔+最后一次与倒数第二次检查时间间隔的一半。
精子存活指数：精子存活指数是精子存活时间和精子存活率两种指标的综合反映。精子存活指数＝相邻前后两次检查的精子平均活力与其间隔时间的乘积相加的总和。
从表1我们可以看出，用本发明稀释液对合格的奶山羊精液稀释后，在4℃低温无菌的存储条件下，可保存120个小时；120小时内，稀释的精液完全符合授精要求。
另外，本稀释液属于鲜精稀释液，鲜精技术配置的精液是液体状。
在奶山羊场人工授精过程中，种羊精液用30倍体积本发明稀释液稀释，母羊发情后，早晚各输精一次：母羊全群受胎率在85％以上，同母羊自然交配的受胎率无显著差异，精液稀释120小时，精子活力仍然保持在0.3-0.4，1000只母羊一个月配种全部结束，仅仅7只种公羊循环使用，就能满足配种需要，而且不影响种公羊生产性能。