一种评价物理隔离措施对转基因棉花基因漂移频率影响的方法与流程

本发明涉及转基因作物安全评价领域，具体涉及一种评价物理隔离措施对转基因棉花基因漂移频率影响的方法及其所用温室。

背景技术：

随着对转基因生物环境安全评价工作的深入开展，基因漂移所带来的生物安全问题也研究的愈加深入，尤其是转基因作物商品化种植以后，相应的农田生态系统也确实由于基因漂移发生了一定的变化。虽然基因漂移对生态环境的影响后果较为严重，但是由于基因漂移具有相对保守性，因此其对环境的影响是在可以控制的范围内的。根据基因漂移发生的途径，基因漂移的发生受到以下因素的影响：转基因作物与接受种杂交的亲和性、转基因作物的花粉传播、转基因作物杂交后代的可育性及繁殖能力，同时，通过花粉传播产生基因漂移是自然界基因漂移发生的主要途径，因此，对基因漂移的防控主要通过控制花粉传播得以实现。

对花粉传播的控制主要包括物理隔离、雄性不育等手段。第一，物理隔离。主要包括距离隔离、转基因作物去雄、调整播种时间实现花期不遇、种植非转基因植物隔离带以及应用近缘种杂交不亲和的优良品种等防控措施。第二，雄性不育基因工程育种技术。目前，该手段已经在烟草中实现技术水平上的证实，且相关成果已进入商业化生产阶段。第三，应用母系遗传法(又称细胞质遗传法)。其原理为：叶绿体或线粒体遗传转化是除细胞核转化外另一种最具潜力的转化方式，而绝大多数植物叶绿体遗传方式为母系遗传，不通过花粉传递，因此可以避免外源基因通过花粉扩散到其他作物或杂草中。目前，该方法已经在烟草和西红柿中得到验证和应用。第四，种子不育法。主要通过阻止异交或种子落粒引起的外源基因扩散，从而实现对基因漂移的防控。第五，染色体组特异性选择法。利用染色体不亲和法，实现在授粉后阻止DNA重组。第六，转基因遗传调控。指利用遗传工程技术调控转基因作物对杂草的选择。

技术实现要素：

针对传统的研究基因漂移的方法存在的缺点，本发明提供一种评价物理隔离措施对转基因棉花基因漂移频率影响的方法及其所用温室。

一种评价物理隔离措施对转基因棉花基因漂移频率影响的方法，包括如下步骤：

1)沿温室长边方向顺序设置转基因棉花区，隔离区和常规棉区；隔离区和常规棉区沿温室短边方向划分为N条，将其中一条的隔离区作为空白带，其余条的隔离区作为隔离带，隔离带以待测的物理隔离措施进行隔离；

2)开花期从转基因棉花区面向常规棉区送风，此外保持常规棉区和转基因棉区种植密度、植株生长阶段、光照、温度、湿度等环境因素的统一；

3)开花期结束后，沿转基因棉花区至常规棉区的线性方向，在每条常规棉区中等距离取F₁代样本检测是否存在外源基因，确定不同隔离方式对基因漂移频率、距离的影响。

其中，所述送风，时间为每天6:00am至18:00pm。

一种评价物理隔离措施对转基因棉花基因漂移频率影响的方法，还包括开花期保持常规棉区空气流通。时间为每天6:00am至18:00pm。

其中，所述F₁代样本指F₁代种子。

其中，所述空白带为不采用任何物理隔离措施。

其中，所述待测的物理隔离措施为一种或多种；优选多种，在各隔离带分别设置待测的各种物理隔离措施，便于相互比较。

其中，所述物理隔离措施为设置隔离网和/或设置作物隔离带。

其中，所述隔离网的规格为90目、80目、60目或40目孔径。

其中，所述作物隔离带种植玉米、番茄、高粱或常规棉。

本发明还提供用于评价物理隔离措施对转基因棉花基因漂移频率影响效果的温室，其为沿温室长边方向顺序设置转基因棉花区，隔离区和常规棉区；隔离区和常规棉区沿温室短边方向划分为N条，将其中一条的隔离区作为空白带，其余条的隔离区作为隔离带，隔离带以待测的物理隔离措施进行隔离；所述转基因棉花区，设置有面向常规棉区送风的装置，N≥2。

其中，所述送风的装置，优选为落地风扇。

其中，所述常规棉区，上方设置空气流通装置，优选为吊扇。

其中，所述转基因棉花区沿温室长边方向的宽度为4-5米，优选4.5米。

其中，所述作为隔离区沿温室长边方向的宽度为3-4米，优选3.5米。

其中，所述常规棉区沿温室长边方向的宽度为30-40米，优选35米。

使用本发明的温室，能精确比较几种物理隔离措施对转基因作物基因漂移效果的影响，明确物理隔离措施影响基因漂移的评价方法，得出基因漂移的距离。

附图说明

图1：本发明的温室内布局示意图。

图2：本发明实施例1、实施例2的部分温室内布局示意图。

图3：本发明实施例1作物隔离带对基因漂移影响的柱状图。

图4：本发明实施例2作物隔离带对基因漂移影响的柱状图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1不同隔离网对基因漂移的影响

1)棉花的种植

在北京市中国农业大学上庄试验站(40°08'22.92"N,116°12'16.98"E)温室(60m×8m)中进行。如图2所示，温室内沿长边方向顺序设置转基因棉花区，隔离区和常规棉区；隔离区和常规棉区沿温室短边方向划分为5条，将其中一条的隔离区作为空白带(不设置隔离网，也不种植任何作物)，其余4条的隔离区作为隔离带，4个隔离带分别设置90目、80目、60目、40目孔径隔离网(A、B、C、D分别表示90目、80目、60目、40目孔径隔离网四个处理)；按照株距为0.4m，行距为0.8m对应种植常规棉和转基因棉，具体见图2(部分，仅显示了2个处理)。由于温室内部封闭无风，不利于实验开展，为温室内处理区持久送风，在抗虫抗除草剂转基因棉区设置一台落地风扇(FS40-8A2型，广东美的环境电器制造公司)，直径约为0.5m，高度约为1.5m，面向常规棉区送风助转基因棉花花粉飘散。在常规棉区上方的温室骨架上设若干送风距离约为5m的吊扇(FB40-1205型，上海华生电器有限公司)，按沿温室长边方向每5米一台的密度设置，吊扇直径约0.5m，距地面约2m。鉴于棉花只在白天开花散粉，风扇工作时间为每天6:00am至18:00pm。除人工设置风力因素外，保持常规棉区和转基因棉区种植密度、植株生长阶段、光照、温度、湿度等环境因素的统一。

2)收获常规棉的种子

常规棉吐絮后，对其F₁代种子进行采集。在常规棉区中等距离取F₁代样本，方向为沿转基因棉花区至常规棉区的线性方向，于各常规棉区的第1、2、4、8、16、24、32行(即以常规棉区与隔离区相邻处记为0m，在0.8m、1.6m、3.2m、6.4m、12.8m、19.2m、25.6m)进行取样。有研究表明转基因棉花的异交率与所采种子在其植株上的上、中、下部位置基本不存在相关性(Umbeck et al.,1991)。因此，每个距离分别从常规棉的上、中、下部摘取棉桃取样，作为三次重复。

3)室内评价

温室采集的非转基因F₁代种子放入棉花轧花机中脱去棉絮，用于分子生物学评价和蛋白测定。主要包括种子处理、样品DNA提取和PCR评价、PCR阳性结果的蛋白评价几大方面。

4)结果分析

具体结果见图3，将空白带作为对照，针对同种孔径隔离网在不同距离上的基因漂移频率进行比较可以看出，在常规棉种植区，90目孔径隔离网只在常规棉第4、32行两个距离上发生了基因漂移，最远达到第32行，且漂移高峰出现在第4行，除第4行漂移高峰外其余各行基因漂移频率之间没有显著差异；80目孔径隔离网只在常规棉第4、8、32行三个距离上发生了基因漂移，最远达到第32行，且漂移高峰出现在第4行，除第4行漂移高峰和第8行漂移次高峰外其余各行基因漂移频率之间没有显著差异；60目孔径隔离网在常规棉第2、4、8、16、32行五个距离上发生了基因漂移，最远达到第32行，除第4行漂移高峰和第16行漂移次高峰外其余各行基因漂移频率之间没有显著差异，且漂移高峰出现在第4行；40目孔径隔离网在常规棉第1、4、8、16、32行五个距离上发生了基因漂移，最远达到第32行，漂移高峰出现在第4行，且发生基因漂移的这五个距离中有四个的漂移率较高，其中第16、32行与漂移高峰第4行的基因漂移频率没有显著差异。可见90目、80目、60目、40目孔径隔离网的基因漂移最远距离都达到了第32行，且四个处理的漂移高峰都出现在第4行。90、80、60、40目隔离网对应的出现基因漂移的距离数量分别为2、3、5、5个。基因漂移的频率随距离增加总体呈下降趋势。其中90目隔离网隔离效果最好。

实例2作物隔离带对基因漂移的影响

1)棉花的种植

分别在北京市中国农业大学上庄试验站(40°08'22.92"N,116°12'16.98"E)两个温室(各60m×8m)中，按照图2，温室内沿长边方向顺序设置转基因棉花区，隔离区和常规棉区；隔离区和常规棉区沿温室短边方向划分为5条，将其中一条的隔离区作为空白带，其余4条的隔离区作为隔离带，4个隔离带分别玉米、番茄、高粱、空白四个作物隔离处理；按株距为0.4m，行距为0.8m在对应区域种植常规棉和转基因棉，隔离作物的株距为0.4m，行距为0.8m，种植宽度为3.5米。由于温室内部封闭无风，不利于实验开展，为温室内处理区持久送风，在抗虫抗除草剂转基因棉区设置一台落地风扇(FS40-8A2型，广东美的环境电器制造公司)，直径约为0.5m，高度约为1.5m，面向常规棉区送风助转基因棉花花粉飘散。在常规棉区上方的温室骨架上设若干送风距离约为5m的吊扇(FB40-1205型，上海华生电器有限公司)，按沿温室长边方向每5米一台的密度设置，吊扇直径约0.5m，距地面约2m。鉴于棉花只在白天开花散粉，风扇工作时间为每天6:00am至18:00pm。除人工设置风力因素外，保持常规棉区和转基因棉区种植密度、植株生长阶段、光照、温度、湿度等环境因素的统一。

2)收获常规棉的种子

常规棉吐絮后，对其F₁代种子进行采集。在常规棉区中等距离取F₁代样本，方向为沿转基因棉花区至常规棉区的线性方向，于各常规棉区的第1、2、4、8、16、24、32行(即以常规棉区与隔离区相邻处记为0m，在0.8m、1.6m、3.2m、6.4m、12.8m、19.2m、25.6m)进行取样。有研究表明转基因棉花的异交率与所采种子在其植株上的上、中、下部位置基本不存在相关性(Umbeck et al.,1991)。因此，每个距离分别从常规棉上、中、下部摘取棉桃取样，作为三次重复。

3)室内评价

温室采集的非转基因F₁代种子放入棉花轧花机中脱去棉絮，用于分子生物学评价和蛋白测定。主要包括种子处理、样品DNA提取和PCR评价、PCR阳性结果的蛋白评价几大方面。

4)结果分析

结果见图4，两个温室的结果相同，四个作物隔离带处理之间在第1、2、8、16、24行的基因漂移频率存在显著差异，在第1、2行，空白隔离带处理的基因漂移频率显著高于玉米、高粱隔离带，番茄隔离带处理的基因漂移频率显著高于高粱隔离带，玉米隔离带处理的基因漂移频率与高粱处理之间没有显著差异；在第8行，空白隔离带和玉米隔离带处理的基因漂移频率显著高于高粱隔离带，番茄隔离带处理的基因漂移频率与其余各处理之间没有显著差异；在第16、24行，三种作物隔离带处理的基因漂移频率都显著低于空白隔离带。在多数距离上，作物隔离带相较于空白隔离都能使基因漂移频率显著下降。其中高粱隔离带的基因漂移频率相较于空白有5个距离存在显著下降，玉米有4个，番茄有2个，且高粱隔离带的基因漂移频率不仅相较于空白隔离带显著下降位点最多，其基因漂移频率在各个存在显著差异的距离上都是最低的，虽然高粱隔离带在常规棉第4行的基因漂移频率高于玉米和番茄隔离带处理但各处理之间在该位点不存在显著差异。玉米和番茄隔离带处理都将基因漂移的发生阻止在了第24行，相较于空白隔离带的32行有所减少，这两种作物隔离带在各个距离上的基因漂移频率都要小于空白隔离带，并随距离的增加其漂移频率呈下降趋势，可见玉米和番茄隔离带对防止基因漂移存在一定的作用。所以在三种作物隔离带中，高粱隔离带的效果最好且明显优于玉米和番茄隔离带，能将基因漂移控制在非常小的范围内；玉米隔离带对基因漂移的控制效果有限，番茄隔离带的效果最差。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。