培育部分同源染色体重组的新型六倍体小麦的方法与流程

本发明属于种质创新技术领域，具体涉及将人工合成四倍体小麦自发产生的结构变异传递给普通小麦，培育部分同源染色体重组的新型六倍体小麦的方法。

背景技术：

禾本科小麦属（triticum）包括二倍体小麦、四倍体小麦和六倍体小麦。其中四倍体小麦的硬粒小麦（t.turgidumssp.durum）和六倍体的普通小麦（t.aestivuml.）在世界各地广泛种植，是重要的粮食作物。我国主要种植和食用六倍体普通小麦。国家的粮食安全需求及资源高效利用、生态环境保护的要求，对小麦新品种培育提出了更高的要求和更大的挑战。但近年我国小麦育种一直处在瓶颈期，其中一个重要制约因素就是新种质资源匮乏。

六倍体普通小麦（2n=42，基因组aabbdd）包含a、b、d三个亚基因组，每个亚基因组有14条染色体，三个亚基因组的染色体互称为部分同源染色体。a亚基因组的二倍体供体为乌拉尔图小麦（t.urartu，2n=14，基因组aa），d亚基因组的二倍体供体为粗山羊草（aegilopstauschii，2n=14，基因组dd），b亚基因组没有确定的二倍体供体，但山羊草属的拟斯卑尔托山羊草（ae.speltoides，2n=14,基因组ss）的s基因组与普通小麦b亚基因组的亲缘关系最近。小麦有着复杂的进化史，包含多次物种间杂交和基因组加倍。最新研究结果显示，d亚基因组的祖先是由含有a与b基因组的祖先杂交而来，此后，在约50万年前（0.5mya），乌拉尔图小麦与一个含有s基因组的二倍体物种（与拟斯卑尔托山羊草ae.speltoides具有密切的亲缘关系）发生了杂交和加倍，产生了四倍体小麦（t.turgiduml.，2n=28，基因组aabb）。四倍体小麦被驯化成多种人工栽培小麦，包括至今仍有种植的硬粒小麦（durum）。在大约8000年前，栽培的四倍体小麦与粗山羊草（ae.tauschii，2n=14，基因组dd）发生了第二次杂交和基因组加倍，形成异源六倍体普通小麦(t.aestivuml.，基因组为aabbdd）新物种。与大多数异源多倍体物种不同的是，天然形成的小麦，无论是四倍体还是六倍体，在染色体5b长臂上都含有一个关键基因——ph1基因，它严格控制减数分裂过程中部分同源染色体的配对和联会。ph1基因是把“双刃剑”，它不干涉正常的同源染色体配对、联会，维持了基因组的稳定，却限制了部分同源染色体之间的重组，降低了遗传变异。ph1基因的存在把六倍体小麦基因组内三个亚基因组的资源“锁”起来了，亚基因组之间基因不能相互流动。因此多倍体小麦中部分同源染色体间基本不发生重组和遗传物质的交换。也就是说，天然存在的四倍体和六倍体小麦都是不发生部分同源染色体重组的物种，这极大限制了遗传多样性的产生。

作物育种的基础是遗传多样性的产生，为克服六倍体小麦遗传基础狭窄的问题，育种家研发了多种相关技术将外源遗传物质导入小麦背景。主要包括三种：小麦诱变育种，是通过电离辐射或化学诱变剂处理小麦与野生亲缘物种的杂交种及后代。辐射可能诱导产生带有碱基突变的材料，同时辐射也会导致染色体断裂，在染色体进行同源重组修复或者非同源末端连接修复的过程中，“强行”实现小麦与外源染色体之间发生重组；小麦远缘杂交育种，是将小麦与黑麦、偃麦草、簇毛麦等野生亲缘物种杂交，通过染色体工程导入外源种质的遗传物质，产生小麦与外源种质的附加系、代换系、易位系等；人工合成六倍体小麦，是通过四倍体小麦（t.turgidum）和粗山羊草（a.tauschii）杂交，得到人工合成六倍体小麦，通过这种合成小麦作为中间亲本向六倍体普通小麦同时导入四倍体小麦和粗山羊草的基因。

虽然这些育种方法都可以将外源遗传物质导入普通小麦产生遗传变异，但它们也都存在各自的缺陷：物理或化学诱变手段能够增加突变的频率，但突变产生的位点随机，有害突变多，有利突变少，产生的变异绝大多数不能遗传；小麦远缘杂交则面临杂交不结实、杂种不育和夭亡的难题，即使能获得杂交种并得到附加系、代换系、易位系等材料，杂种衍生后代携带大量野生种的不利基因，需要多个世代的回交和分离才能去除；人工合成小麦的亲本选择局限于四倍体小麦和粗山羊草，而且ph1基因限制了两亲本之间的重组，该方法难以产生更丰富的后代类型。

人工合成四倍体小麦有两种类型，它们的基因组分别为ssdd和aadd。aa基因组来源为六倍体普通小麦a亚基因组供体的二倍体乌拉尔图小麦，ss基因组来源为与六倍体普通小麦b亚基因组供体亲缘关系近的二倍体山羊草属小麦，dd基因组来源为六倍体普通小麦d亚基因组供体的二倍体粗山羊草。由于这三种类型的二倍体小麦都没有执行类似六倍体小麦中ph1基因功能的基因，因此，经人工杂交、加倍得到的人工合成四倍体小麦能够进行部分同源染色体之间的联会、配对及重组。细胞学研究也证实：两种人工合成四倍体小麦在部分同源染色体之间，即s与d亚基因组染色体和a与d亚基因组染色体之间能够自然发生染色体易位等结构变异，从而产生不同的四倍体小麦核型。在创制小麦新种质的过程中，若要产生发生重组事件的六倍体小麦，除了传统引入外源遗传物质的方式以外，充分利用部分同源染色体之间频繁的重组，配合多种杂交转育方式，就能够将丰富的遗传变异传递给六倍体小麦。

技术实现要素：

本发明的目的在于利用人工合成四倍体小麦自发产生的部分同源染色体结构变异，在避免导入其它外源遗传物质的情况下，培育含有部分同源染色体重组的新型六倍体小麦新种质。

本发明的内容是，不导入人工合成四倍体基因组组成以外的外源遗传物质，利用人工合成四倍体小麦自发重组产生的亚基因组间部分同源染色体结构变异，通过杂交途径，以人工合成四倍体小麦为杂交亲本，将这种结构变异转移给六倍体小麦，创制六倍体普通小麦新种质。具体为：以发生大量部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦为杂交亲本，与六倍体普通小麦或者二倍体小麦杂交，将在四倍体小麦水平产生的结构变异导入六倍体普通小麦，由于其中大量结构变异的存在，将导致相应基因表达水平的可遗传改变，进而产生具有新表型的种质，成为能够在育种上直接被利用的六倍体小麦新种质。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

利用已创制的含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦为杂交亲本，通过包括人工合成四倍体小麦与普通小麦杂交及回交、人工合成四倍体小麦直接与二倍体小麦杂交，最终得到含有部分同源染色体重组的新型六倍体小麦新种质。

1、人工合成四倍体小麦与普通小麦杂交及回交：将含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦与普通小麦杂交，在得到的五倍体杂交种小麦与六倍体普通小麦的回交后代中筛选六倍体小麦。

亲本选择：含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦，基因组为aadd。含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦，基因组为ssdd。六倍体普通小麦，基因组为aabbdd。

杂交组合：

（1）人工合成四倍体小麦（aadd）与六倍体普通小麦（aabbdd）杂交，在得到的五倍体杂交种小麦与六倍体普通小麦的回交后代中筛选六倍体小麦。

（2）人工合成四倍体小麦（ssdd）与六倍体普通小麦（aabbdd）杂交，在得到的五倍体杂交种小麦与六倍体普通小麦的回交后代中筛选六倍体小麦。

2、人工合成四倍体小麦直接与二倍体小麦杂交：含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦与二倍体小麦杂交，将三倍体杂交种小麦经染色体加倍得到包含染色体结构变异的六倍体小麦。

亲本选择：含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦，基因组为aadd。含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦，基因组为ssdd。二倍体小麦为乌拉尔图小麦，基因组为aa。与六倍体普通小麦b亚基因组供体亲缘关系近的二倍体山羊草属小麦，基因组为ss。

杂交组合：

（1）人工合成四倍体小麦（aadd）与二倍体山羊草属小麦（ss）杂交，将杂交种三倍体小麦（asd）基因组加倍得到六倍体小麦（aassdd）。

（2）人工合成四倍体小麦（ssdd）与二倍体乌拉尔图小麦（aa）杂交，将杂交种三倍体小麦（asd）基因组加倍得到六倍体小麦（aassdd）。

附图说明

图1为含有染色体结构变异的人工合成四倍体小麦at1（ssdd）的基因组原位杂交图。其中s亚基因组染色体为红色，d亚基因组染色体为绿色。箭头指示含有结构变异的染色体。

图2为人工合成四倍体小麦at1与六倍体普通小麦taa10杂交所得五倍体植株。

图3为含有染色体结构变异的人工合成四倍体小麦at2（aadd）的基因组原位杂交图。其中d亚基因组染色体为红色，a亚基因组染色体为绿色。箭头指示含有结构变异的染色体。

图4为二倍体山羊草属小麦tb01（ss）与at2杂交所得三倍体。

具体实施方式

为了使本发明技术方案更加清晰，以下实施例将对本发明进一步详细说明。需要指出的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明。实施例中所述的试验方法如无特殊说明均为常规操作方法，所用的试剂均可从商业途径获得。

实施例1：含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦与普通小麦杂交及回交，获得含有部分同源染色体重组的六倍体小麦。技术步骤如下：

1、鉴定人工合成四倍体小麦at1核型（图1）：目的为从人工合成四倍体小麦中鉴定出含有部分同源染色体重组的个体。细胞学鉴定核型方法：

a)种子萌发：在铺有滤纸的培养皿中用水浸泡at1种子，待种子露白后将水倒掉，始终将培养皿放置于20℃以上的室内黑暗处，并保持滤纸湿润。

b)获取根尖：在根长达到1.5~2.0cm时，剪取根尖部分裂旺盛的区域1cm，放置于提前扎孔和湿润的0.5ml离心管中。通入一氧化二氮气体处理2小时后，在冰上用95%的冰醋酸固定5分钟，用去离子水清洗两次，最后用75%乙醇保存。

c)染色体制片：用去离子水洗去离心管中的酒精，取根尖分生区2mm放置于纤维素酶（0.02g/ml）和果胶酶（0.01g/ml）混合液中，37℃酶解35分钟。用75%的乙醇洗净酶液，将根尖研磨成匀浆状，涡旋离心后加入100%冰醋酸25μl，取8μl滴于玻璃盖玻片上，在湿盒中放置5分钟。

d)原位杂交和信号观察：

荧光原位杂交（fish）和基因组原位杂交（gish）探针：fish使用两种重复序列探针pas1和psc119.2。gish用s和d基因组dna做探针杂交at1的根尖染色体，s和d基因组dna分别提取自拟斯卑尔托山羊草和粗山羊草。探针需要避光，原位杂交过程要完全避免强光照射。

荧光原位杂交：取探针pas1和psc119.2各100ng，用2ⅹssc/1ⅹte缓冲液配成6μl/片的体系，在80℃的湿盒中变性杂交5分钟，在55℃的湿盒中复性、延伸8小时。用2xssc缓冲液轻轻洗去塑料盖玻片，滴加dapi12μl/片，盖上玻璃盖玻片，用荧光显微镜检测荧光信号。

基因组原位杂交：取基因组dna探针各100ng，用2ⅹssc/1ⅹte缓冲液配成6μl/片的体系，在80℃的湿盒中变性杂交5分钟，在55℃的湿盒中复性、延伸10小时。用2ⅹssc缓冲液轻轻洗去塑料盖玻片，滴加dapi12μl/片，盖上玻璃盖玻片，用荧光显微镜检测荧光信号。

e)核型分析：用photoshop软件，结合at1根尖染色体fish和gish信号，区分at1（ssdd）每一条染色体，确定产生的结构变异类型。

2、分期播种杂交亲本。

杂交亲本为含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦at1（ssdd）和六倍体普通小麦taa10（aabbdd）。

以10天为间隔，分3期种植at1。在种植第二期at1材料时，同期种植普通小麦taa10（aabbdd）。所有at1亲本都要先鉴定核型，将核型已知含有部分同源染色体重组的幼苗从培养皿移栽到土里。所有含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦和六倍体普通小麦放在有自然光照的玻璃温室培养，每天光照16小时，温室温度保持在25℃。

3、含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦at1与普通小麦taa10杂交。

在抽穗期，用at1作为杂交的母本。取at1未散粉的幼穗，只保留每个穗基部的两朵小花，去掉每朵小花的雄蕊，套上杂交袋并标注去雄日期。授粉期间，取父本taa10新鲜花粉抖落到已经去雄的at1幼穗柱头上。

4、杂交种幼胚拯救。

在授粉后16天取幼胚进行胚拯救，使用ms培养基。

ms培养基的成份为：ms干粉培养基4.32g/l，蔗糖30g/l，琼脂7g/l，调节ph=5.8。121℃高压灭菌15分钟，灭菌结束温度降至70℃时将培养基分装至各培养瓶中，每个培养瓶分装50ml。

胚拯救操作：将培养基、镊子、培养皿、酒精灯等用具放入超净工作台，超净工作台用紫外灯灭菌30分钟。将幼胚从穗轴上剥落，顺次用75%乙醇洗1分钟，灭菌水洗1分钟，次氯酸钠浸泡8分钟，灭菌水重复洗3次、每次各1分钟。然后把幼胚放置于装有灭菌滤纸的培养皿上，用镊子剥出幼胚放于培养瓶中，在瓶壁上标注好日期和材料名称。

5、幼苗移栽

在胚拯救的7天后，幼胚膨大并萌发成苗，幼苗长至10厘米时，用镊子将幼苗从培养瓶中取出并移栽到装有灭菌土的纸杯里，放于培养箱中。培养箱的温度及光周期为23℃/16h光照和15℃/8h黑暗。

6、五倍体幼苗的核型鉴定

在幼苗长出三片叶子时取根尖，用细胞学方法鉴定核型，真实杂交种为五倍体小麦（absdd）（图2）。

获取根尖：选择纸杯中幼苗的茁壮新根进行染色体制片。

基因组原位杂交探针体系：探针为a和d基因组dna探针各100ng，封阻为1000ng的s基因组dna，用2ⅹssc/1ⅹte缓冲液配成6μl/片的体系。

鉴定具体操作方法如以上步骤1所述。完成鉴定的五倍体小麦幼苗移动到温室继续培养。

7、五倍体小麦与普通小麦taa10回交

移栽五倍体小麦的同时种植六倍体普通小麦taa10。

在抽穗期，以五倍体小麦作为母本，取幼穗去雄、套袋，以六倍体小麦taa10为父本，取其新鲜花粉授给去雄的幼穗。

8、杂交种幼胚拯救、幼苗移栽

操作步骤同以上步骤4、5所述。

9、幼苗的核型鉴定

在幼苗长出三片叶子时取根尖进行细胞学方法鉴定核型，鉴定方法、步骤如步骤1和6所述。

在多种类型的非整倍植株中筛选具有42条染色体（染色体组成为aassdd）并且包含染色体结构变异的新型六倍体小麦材料nhw-1。

以含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦at2（aadd）和六倍体普通小麦taa10（aabbdd）为亲本，采用与上述方法相同的步骤，得到另一种亲本组合的新型六倍体小麦材料nhw-2。

实施例2：人工合成四倍体小麦直接用二倍体小麦杂交、加倍获得含有部分同源染色体重组的六倍体小麦。技术步骤如下：

1、鉴定人工合成四倍体小麦at2核型（图3）

细胞学鉴定方法：

荧光原位杂交（fish）和基因组原位杂交（gish）探针：fish使用两种重复序列探针pas1和psc119.2。gish用a和d基因组dna做探针杂交at2的根尖染色体，a和d基因组dna分别提取自乌拉尔图小麦和粗山羊草。

参见实施例1中步骤1的方法。

2、分期播种杂交亲本。

杂交亲本为二倍体山羊草属小麦tb01（ss）和人工合成四倍体小麦at2（aadd）。

分三期播种tb01，每期相隔10天，在种第二期tb01时，将染色体核型鉴定中发现结构变异的at2材料从培养皿移栽到土里。

3、二倍体小麦tb01直接与四倍体小麦at2杂交

以tb01作为杂交的母本，在抽穗期取未散粉的幼穗，每个幼穗保留基部一朵小花，去掉被保留小花的雄蕊，套好杂交袋并标注去雄日期。以at2为父本，取新鲜花粉授给tb01去雄的小花。

4、杂交种幼胚拯救

采用与实施例1中步骤4中相同的方法进行。

5、秋水仙素加倍幼苗

幼苗选择：在胚拯救后7天左右，幼胚膨大并长成幼苗（图4）。待幼苗长至6厘米左右，并能用肉眼观察到在培养基中生长的根时可以进行秋水仙素加倍。

秋水仙素溶液配制：取一个用锡箔纸包裹的螺口瓶，用去离子水配制质量分数为0.1%的秋水仙素，每100ml溶液加入2mldmso，用0.22μm无菌滤膜抽滤灭菌，每次根据用量现用现配。

加倍操作：将1ml移液器，1ml枪头放入超净工作台灭菌30分钟，通风10分钟后，用酒精棉擦净培养瓶和秋水仙素玻璃瓶外壁，放入超净工作台内。打开培养瓶，将2ml秋水仙素溶液注入培养基及表面，盖好瓶盖，放入25℃的暗培养箱培养24小时。

加倍后清洗：将灭菌水放入超净工作台灭菌30分钟，通风10分钟后进行操作。打开培养瓶，向瓶中轻轻倒入无菌水，摇晃清洗5分钟，将水倒出。重复清洗5次。完成清洗的幼苗继续放入暗培养箱培养24小时。

6、幼苗移栽

将暗培养24小时的幼苗用镊子取出，移栽到土里，放于培养箱中，培养箱的温度及光周期为23℃/16h光照和15℃/8h黑暗。

7、加倍幼苗的核型鉴定

加倍后的幼苗大部分出现萎蔫死亡。正常生长的幼苗每天浇水保持土壤湿润，待幼苗有两个分蘖时，从土里取10个根尖进行细胞学鉴定。

除了获取根尖的途径和基因组原位杂交的探针外，鉴定方法如实施例1中步骤1所述。

获取根尖：选择纸杯中幼苗茁壮的新根进行染色体制片。

基因组原位杂交探针体系：探针为a和d基因组dna探针各100ng，封阻为1000ng的s基因组dna，用2ⅹssc/1ⅹte缓冲液配成6μl/片的体系。

筛选得到染色体加倍成功的单株，即拥有42条染色体（染色体组成为aassdd）的新型六倍体小麦nhw-3。

完成鉴定的幼苗移动到温室继续培养。

以含有部分同源染色体重组的人工合成四倍体小麦at1（ssdd）和二倍体乌拉尔图小麦tmu38（aa）为亲本，采用与上述方法相同的步骤，得到另一种亲本组合的新型六倍体小麦材料nhw-4。