本发明涉及烟草转基因方法技术领域，具体是公开了一种降低烟草转基因苗污染率并促进其快速生根的培养方法。
背景技术：
烟草是一种重要的模式植物，在研究基因功能、致病机理和转基因植物抗病机制等过程中发挥着重要作用。烟草转基因技术应用广泛。存在的问题污染严重，生根慢，成苗率低。降低烟草转基因苗的污染率并促进其快速生根具有十分广阔的应用前景。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种降低烟草转基因苗污染率并促进其快速生根的培养方法，克服已有技术的不足，利用根癌农杆菌介导的方法，使用本生烟草叶片进行转化，既结合了农杆菌转化的优点，又克服了其他转化方法周期长，转化体少的缺点，因而可以大幅度降低烟草转基因苗污染率，促进其快速生根进而提高本生烟草的转基因效率。
本发明所采用的技术方案如下：
一种降低烟草转基因苗污染率并促进其快速生根的培养方法，包括如下步骤：
(1)、外植体的制备及侵染
取生长状态良好的本生烟草叶片，避开主脉和叶边缘切成1cm*1cm的小块，放置MS培养基上预培养2-3天，放入含有200μmol/L乙酰丁香酮的农杆菌悬浮侵染液侵染20分钟，过程中间每隔5分钟摇动培养皿一次，然后倒出菌液，用灭过菌的吸水纸吸干外植体表面菌液，转入固体共培养基中，28℃黑暗条件下倒置培养，共培养3天后使用附加1g/L头孢霉素和200mg/L二硫苏糖醇的液体共培养基清洗；
(2)、抗性材料的筛选
将上述清洗后的外植体转移到选择分化培养基上进行继代培养至外植体边缘产生大量愈伤组织和芽点；
(3)、根系培育
待上述不定芽长至1-3cm长后转入生根培养基中。
以烟草叶片为受体，通过根癌农杆菌介导的方法，利用选择培养基筛选获得抗性试材，促进其快速生根成苗；烟草叶片和农杆菌在含有200μmol/L乙酰丁香酮的农杆菌悬浮侵染液中侵染处理20分钟，可以顺利脱除愈伤组织上附着的根癌农杆菌，而不影响受体生长；共培养3天后使用附加1g/L头孢霉素和200mg/L二硫苏糖醇的液体共培养基清洗，可显著降低受体污染率，提高转化效率；含有200mg/L头孢霉素和50mg/LKan的选择分化培养基可以快速产生愈伤组织和大量芽点；将1-3cm长的不定芽转入生根培养基有利于快速形成根系；
所述的固体共培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg/L盐酸硫胺素、0.2mg/L盐酸吡哆醇、0.2mg/L烟酸、150mg/L肌醇、200μmol/L的乙酰丁香酮，1mg/L的萘氧乙酸、4％的蔗糖和0.25％的Gelrite；
所述的选择分化培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg/L盐酸硫胺素、0.2mg/L盐酸吡哆醇、0.2mg/L烟酸、150mg/L肌醇、0.2mg/L的TDZ、2mg/L的2,4-D、25mg/L的4-IPOAA、5mg/L的天冬氨酸、10g/L椰乳、200mg/L头孢霉素和50mg/L卡那霉素、4％的麦芽糖和0.28％的Gelrite；
所述生根培养基配方为1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg/L盐酸硫胺素、0.2mg/L盐酸吡哆醇、0.2mg/L烟酸、150mg/L肌醇、100mgkg-1ABT、0.2mg/L的TDZ和0.5mg/Lα-萘乙酸钠、10g/L椰乳、1％的葡萄糖、3％的蔗糖和0.28％的Gelrite。
进一步，所述的选择分化培养基和生根培养基pH均为6.2。
本发明降低烟草转基因苗污染率并促进其快速生根的培养方法，其有益效果表现在：
(1)、转化周期大大缩短；
(2)、利用附加1g/L头孢霉素和100mg/L二硫苏糖醇的液体继代培养基清洗愈伤组织可彻底脱除根癌农杆菌，而不影响胚性愈伤组织的正常生长，该方法既经济又环保。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例
一种降低烟草转基因苗污染率并促进其快速生根的培养方法，包括如下步骤：
(1)、外植体的制备及侵染：取生长状态良好的本生烟草叶片，避开主脉和叶边缘切成1cm*1cm的小块，放置MS培养基上预培养2-3天。放入含有200μmol/L乙酰丁香酮的农杆菌悬浮侵染液侵染20分钟，过程中间每隔5分钟摇动培养皿一次，然后倒出菌液，用灭过菌的吸水纸吸干外植体表面菌液，转入固体共培养基中(固体共培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg/L盐酸硫胺素、0.2mg/L盐酸吡哆醇、0.2mg/L烟酸、150mg/L肌醇、200μmol/L的乙酰丁香酮，1mg/L的萘氧乙酸、4％的蔗糖和0.25％的Gelrite)，28℃黑暗条件下倒置培养。共培养3天后使用附加1g/L头孢霉素和200mg/L二硫苏糖醇的液体共培养基清洗。
(2)、抗性材料的筛选：清洗后的外植体转移到选择分化培养基上(选择分化培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg/L盐酸硫胺素、0.2mg/L盐酸吡哆醇、0.2mg/L烟酸、150mg/L肌醇、0.2mg/L的TDZ、2mg/L的2,4-D、25mg/L的4-IPOAA、5mg/L的天冬氨酸、10g/L椰乳、200mg/L头孢霉素和50mg/L卡那霉素、4％的麦芽糖和0.28％的Gelrite，pH为6.2)进行继代培养至外植体边缘产生大量愈伤组织和芽点。
(3)、不定芽长至1-3cm长后转入生根培养基中(生根培养基配方为1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg/L盐酸硫胺素、0.2mg/L盐酸吡哆醇、0.2mg/L烟酸、150mg/L肌醇、100mg kg-1ABT、0.2mg/L的TDZ和0.5mg/Lα-萘乙酸钠、10g/L椰乳、1％的葡萄糖、3％的蔗糖和0.28％的Gelrite，pH为6.2)。
抗性愈伤组织的筛选：
侵染后，采用头孢霉素处理愈伤组织可以较为彻底地去除根癌农杆菌，头孢霉素的使用浓度及效果如表1所示；结果显示，适宜的头孢霉素浓度为200mg/L，脱菌效果较为理想。
表1利用头孢霉素脱菌及愈伤组织的恢复
以上内容仅仅是对本发明构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。