本发明涉及组培技术，尤其涉及一种平滑山楂的组培方法。
背景技术：
平滑山楂(绿山楂冬王)Crataegus viridis′Winter King′山楂属落叶小乔木，树高4.5一6米，冠宽3.5一6米。圆形树冠，单叶互生，卵形或倒卵形，3一5裂，叶缘具锯齿。花白色，果红色，果可保留到第二年春季。生长慢，喜光，适宜湿润、肥沃土壤，适应性强，易栽培，耐修剪。原产于北美东部。我国可在北至黑龙江及内蒙古南部，南至湖南、安徽、江苏北部区域内生长。该品种以其夺目鲜红、挂果持久的山楂果而著名，树龄可达100年之久，花、果具观赏价值，适合庭园栽种，既可作庭园景观树，又可作绿篱等。
由于利用种子进行播种繁殖存在一些局限性，嫁接繁育技术目前在我国成活率较低，因此加强其无性繁殖的研究，建立无性繁殖技术体系，提高我国绿山楂冬王苗木的生产能力，能为其广泛应用于城市园林中提供技术保障。目前我国对于平滑山楂组培的研究尚无。
技术实现要素：
本发明的目的在于，针对上述问题，提出一种平滑山楂的组培方法，该方法简便高效，成本低，诱导率高，增殖系数高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种平滑山楂的组培方法，包括以下步骤：
步骤一、切取平滑山楂植株个体的半木质化茎芽进行预处理，然后接种到含0.01～0.1mg/L细胞分裂素、0.01～0.1mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的诱导培养基上，在温度为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～24h、20～30天获得无菌芽苗；
步骤二、将获得的无菌芽苗切割成1.5～5.0cm的带顶芽的茎段，接种到含0.1～1mg/L细胞分裂素、0.01～0.1mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的增殖培养基上，在温度为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～24h、每10～30天更换新鲜培养基的条件下培养1～3个月，获得丛生芽苗；
步骤三、挑选健壮的丛生芽苗，以单个芽苗为单位进行切离，将切离后的单个芽苗切割成长度为2.0～3.0cm的带顶芽的茎段，然后将茎段接种到含有0.1～0.5mg/L生长素(两种生长素，浓度均为0.1-0.5mg/L)、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的生根培养基上，在温度为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～24h条件下培养10～30天，获得再生植株；
步骤四、将株高达4cm、根系发达、叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为20～30℃、湿度为60％～80％、光照强度为40～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～18h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得平滑山楂苗木，即完成平滑山楂的微繁方法。
进一步地，步骤一所述预处理包括以下步骤：(大连地区)5-6月份，晴天上午，选生长健壮、树形优美、无病虫害的优良母本，采集一年生枝条，剪成长1.5-2.5cm的带腋芽茎段，用中性洗涤剂漂洗后，流水冲洗2h以上，后置于工作台备用；在超净工作台上，先用70％乙醇处理10-30s，后用0.1％升汞处理1-5min，然后用无菌水漂洗5次。
进一步地，步骤一、切取平滑山楂植株个体的半木质化茎芽进行预处理，然后接种到含0.01-0.04mg/L细胞分裂素、0.02-0.05mg/L生长素、25～35g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的诱导培养基上，在温度为20～25℃、湿度为50％～80％、光照强度为50～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～24h、20～30天获得无菌芽苗。
进一步地，其中步骤一中诱导培养基为MS培养基、1/2MS培养基、DKW培养基、WPM培养基或QL培养基，pH值为5～6，细胞分裂素为苄基腺嘌呤、玉米素、激动素或氯吡苯脲，生长素为萘乙酸或吲哚丁酸。
进一步地，步骤二、将获得的无菌芽苗切割成1.5～5.0cm的带顶芽的茎段，接种到含0.8-1.0mg/L细胞分裂素、0.02～0.05mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的增殖培养基上，在温度为20～30℃、湿度为60％～80％、光照强度为40～80μmol·m-2·s-1、每天光照12～20h、每10～30天更换新鲜培养基的条件下培养1～3个月，获得丛生芽苗。
进一步地，步骤二中增殖培养基为MS培养基、DKW培养基、WPM培养基或QL培养基，pH值为5～6，细胞分裂素为苄基腺嘌呤、玉米素、激动素或氯吡苯脲，生长素为萘乙酸和/或吲哚丁酸。
进一步地，步骤三、挑选健壮的丛生芽苗，以单个芽苗为单位进行切离，将切离后的单个芽苗切割成长度为2.0～3.0cm的带顶芽的茎段，然后将茎段接种到含有0.3-0.5mg/L(两种生长素、浓度均为0.3-0.5mg/L)生长素、20～35g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的生根培养基上，在温度为20～30℃、湿度为40％～60％、光照强度为50～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～20h条件下培养10～30天，获得再生植株。
进一步地，步骤三中生根培养基为生长素为1/2MS培养基或1/3MS培养基，pH值为5～6，生长素为吲哚乙酸和/或吲哚丁酸。
进一步地，步骤四、将株高达4cm、根系发达、叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为20～30℃、湿度为70％～80％、光照强度为60～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～15h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得平滑山楂苗木，即完成平滑山楂的微繁方法。
进一步地，步骤四中所述栽培基质包含体积比如下的各组分：草炭土3份，珍珠岩1-3份。优选为草炭土3份，珍珠岩2份。
本发明平滑山楂的组培方法步骤科学、合理，与现有技术相比较具有以下优点：
1、预处理简便，污染率低，无菌材料的保存率高，可达80％。
2、初代培养基的诱导率高，可达80％以上。
3、增殖培养基的增殖速度快、苗生长整齐一致、增殖系数高，可达7.0
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步说明：
实施例1
本实施例公开了一种平滑山楂的组培方法，包括以下步骤：
步骤一、切取平滑山楂植株个体的半木质化茎芽进行预处理，然后接种到含0.05mg/L细胞分裂素、0.05mg/L生长素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂的诱导培养基上，在温度为25℃、湿度为60％、光照强度为70μmol·m-2·s-1、每天光照20h、20～30天获得无菌芽苗；
步骤二、将获得的无菌芽苗切割成1.5～5.0cm的带顶芽的茎段，接种到含0.05mg/L细胞分裂素、0.05mg/L生长素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂的增殖培养基上，在温度为30℃、湿度为60％、光照强度为60μmol·m-2·s-1、每天光照20h、每20天更换新鲜培养基的条件下培养2个月，获得丛生芽苗；
步骤三、挑选健壮的丛生芽苗，以单个芽苗为单位进行切离，将切离后的单个芽苗切割成长度为2.0～3.0cm的带顶芽的茎段，然后将茎段接种到含有0.3mg/L生长素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂的生根培养基上，在温度为20～30℃、湿度为60％、光照强度为60μmol·m-2·s-1、每天光照19h条件下培养20天，获得再生植株；
步骤四、将株高达4cm、根系发达、叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为70μmol·m-2·s-1、每天光照15h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得平滑山楂苗木，即完成平滑山楂的微繁方法。
上述预处理以大连地区为例，包括以下步骤：5-6月份，晴天上午，选生长健壮、树形优美、无病虫害的优良母本，采集一年生枝条，剪成长1.5-2.5cm的带腋芽茎段，用中性洗涤剂漂洗后，流水冲洗2h以上，后置于工作台备用；在超净工作台上，先用70％乙醇处理20s，后用0.1％升汞处理3min，然后用无菌水漂洗5次。
其中步骤一中诱导培养基为MS培养基，pH值为5～6，细胞分裂素为苄基腺嘌呤，生长素为萘乙酸；步骤二中增殖培养基为MS培养基，pH值为5～6，细胞分裂素为苄基腺嘌呤，生长素为萘乙酸；步骤三中生根培养基为生长素为MS培养基，pH值为5～6，生长素为吲哚乙酸和吲哚丁酸；步骤四中栽培基质按体积份数比为3份的草炭土、2份的珍珠岩。
实施例2
本实施例公开了一种平滑山楂的组培方法，包括以下步骤：
步骤一、切取平滑山楂植株个体的半木质化茎芽进行预处理，然后接种到含0.01mg/L细胞分裂素、0.1mg/L生长素、20g/L蔗糖和7g/L琼脂的诱导培养基上，在温度为20℃、湿度为40％％、光照强度为100μmol·m-2·s-1、每天光照12h、30天获得无菌芽苗；
步骤二、将获得的无菌芽苗切割成1.5～5.0cm的带顶芽的茎段，接种到含0.1mg/L细胞分裂素、0.1mg/L生长素、40g/L蔗糖和5g/L琼脂的增殖培养基上，在温度为30℃、湿度为80％、光照强度为100μmol·m-2·s-1、每天光照24h、每30天更换新鲜培养基的条件下培养3个月，获得丛生芽苗；
步骤三、挑选健壮的丛生芽苗，以单个芽苗为单位进行切离，将切离后的单个芽苗切割成长度为2.0～3.0cm的带顶芽的茎段，然后将茎段接种到含有0.5mg/L生长素、40g/L蔗糖和7g/L琼脂的生根培养基上，在温度为20℃、湿度为40％％、光照强度为100μmol·m-2·s-1、每天光照12h条件下培养10天，获得再生植株；
步骤四、将株高达4cm、根系发达、叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为30℃、湿度为80％、光照强度为40μmol·m-2·s-1、每天光照12h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得平滑山楂苗木，即完成平滑山楂的微繁方法。
上述预处理以大连地区为例，包括以下步骤：5-6月份，晴天上午，选生长健壮、树形优美、无病虫害的优良母本，采集一年生枝条，剪成长1.5-2.5cm的带腋芽茎段，用中性洗涤剂漂洗后，流水冲洗2h以上，后置于工作台备用；在超净工作台上，先用70％乙醇处理30s，后用0.1％升汞处理5min，然后用无菌水漂洗5次。
其中步骤一中诱导培养基为DKW培养基，pH值为5～6，细胞分裂素为氯吡苯脲，生长素为吲哚丁酸；步骤二中增殖培养基为MS培养基，pH值为5～6，细胞分裂素为苄基腺嘌呤，生长素为吲哚丁酸；步骤三中生根培养基为生长素为WPM培养基，pH值为5～6，生长素为吲哚乙酸和吲哚丁酸；步骤四中栽培基质按体积份数比为3份的草炭土、2份的珍珠岩。
实施例3
本实施例公开了一种平滑山楂的组培方法，包括以下步骤：
步骤一、切取平滑山楂植株个体的半木质化茎芽进行预处理，然后接种到含0.07mg/L细胞分裂素、0.03mg/L生长素、25g/L蔗糖和5g/L琼脂的诱导培养基上，在温度为20℃、湿度为70％、光照强度为50μmol·m-2·s-1、每天光照18h、30天获得无菌芽苗；
步骤二、将获得的无菌芽苗切割成1.5～5.0cm的带顶芽的茎段，接种到含0.8mg/L细胞分裂素、0.09mg/L生长素、20g/L蔗糖和7g/L琼脂的增殖培养基上，在温度为20℃、湿度为80％、光照强度为100μmol·m-2·s-1、每天光照24h、每30天更换新鲜培养基的条件下培养2个月，获得丛生芽苗；
步骤三、挑选健壮的丛生芽苗，以单个芽苗为单位进行切离，将切离后的单个芽苗切割成长度为2.0～3.0cm的带顶芽的茎段，然后将茎段接种到含有0.5mg/L生长素、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的生根培养基上，在温度为30℃、湿度为40％、光照强度为80μmol·m-2·s-1、每天光照24h条件下培养30天，获得再生植株；
步骤四、将株高达4cm、根系发达、叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为30℃、湿度为60％、光照强度为60μmol·m-2·s-1、每天光照18h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得平滑山楂苗木，即完成平滑山楂的微繁方法。
上述预处理以大连地区为例，包括以下步骤：5-6月份，晴天上午，选生长健壮、树形优美、无病虫害的优良母本，采集一年生枝条，剪成长1.5-2.5cm的带腋芽茎段，用中性洗涤剂漂洗后，流水冲洗2h以上，后置于工作台备用；在超净工作台上，先用70％乙醇处理10s，后用0.1％升汞处理3min，然后用无菌水漂洗5次。
其中步骤一中诱导培养基为DKW培养基，pH值为5～6，细胞分裂素为激动素，生长素为吲哚丁酸；步骤二中增殖培养基为DKW培养基，pH值为5～6，细胞分裂素为氯吡苯脲，生长素为萘乙酸；步骤三中生根培养基为生长素为DKW培养基，pH值为5～6，生长素为吲哚乙酸和吲哚丁酸；步骤四中栽培基质按体积份数比为3份的草炭土、2份的珍珠岩。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。