一种培育耐盐柳枝稷的方法与流程

本发明属于植物育种领域，具体涉及一种培育耐盐柳枝稷的方法。

背景技术：

柳枝稷(Panicum vrigatum L.)，禾本科黍属原产于北美大陆，是一种多年生暖季型的草本C4植物。它植株高大、根系发达，耐旱、耐贫瘠，通常被用于放牧、水土保持、生态建设、园林绿化、以及生物质能源发展等。柳枝稷于20世纪80年代被引入我国，主要用之于黄土高原的水土保持及生态建设。目前，柳枝稷作为一种具有较大发展潜力的能源作物在我国北方的研究受到越来越多的关注，并表现出良好的生态效益。利用边际性土地生产生物质原料是我国发展生物质能产业的必然选择。然而，目前适合种植于我国北方盐碱土地的能源作物品种有限，柳枝稷的耐盐性有待进一步改善。

本发明在已建立起柳枝稷幼穗离体培养高频率植株再生体系的基础上，通过高盐浓度和低温条件培育柳枝稷耐盐突变植株，旨在建立一种离体培育耐盐柳枝稷的方法，为今后耐盐柳枝稷品种的选育奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种培育耐盐柳枝稷的方法。

本发明的一种培育耐盐柳枝稷的方法，包括如下步骤：

1)诱导愈伤组织：将柳枝稷含内层苞叶的幼穗小段灭菌消毒后沿穗轴纵切为两半，接种于诱导培养基上诱导愈伤组织；

2)耐盐愈伤组织培养：将步骤1)诱导出的愈伤组织，接种到含150-200mmol/L NaCl的高盐增殖培养基上低温培养；

3)诱导芽分化：将步骤2)得到的愈伤组织接种至NaCl含量50-80mmol/L的低盐分化培养基上，诱导芽分化；

4)诱导生根：待芽长至1-2厘米后，切下芽，接种到NaCl含量120-150mmol/L的高盐生根培养基上诱导生根；

5)耐盐鉴定：待再生苗生有2-3条根后，将其转移到含200-250mmol/L NaCl的高盐筛选培养基上进行耐盐鉴定，培养4-6周后，筛选出生长明显优于未经耐盐培育的柳枝稷的植株，即为耐盐柳枝稷。

所述诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，麦芽糖质量百分含量3％、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)含量5mg/L、6-苄氨基嘌呤(6-BA)含量1.2mg/L、植物凝胶质量百分含量0.8％、pH值5.8的培养基。

所述高盐增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，麦芽糖质量百分含量3％、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)含量5mg/L、6-苄氨基嘌呤(6-BA)含量1.2mg/L、脯氨酸含量2g/L、NaCl含量150-200mmol/L、植物凝胶质量百分含量0.8％、pH值5.8的培养基。NaCl含量优选为200mmol/L。

所述低盐分化培养基是以MS培养基为基本培养基，麦芽糖质量百分含量3％、赤霉素(GA3)含量0.5mg/L、NaCl含量50-80mmol/L、植物凝胶质量百分含量0.8％、pH值5.8的培养基。NaCl含量优选为60mmol/L。

所述高盐生根培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，NaCl含量120-150mmol/L、植物凝胶质量百分含量0.6％、pH值5.8的培养基。NaCl含量优选为150mmol/L。

所述高盐筛选培养基是以MS培养基为基本培养基，NaCl含量200-250mmol/L、pH值5.8的培养基。NaCl含量优选为200mmol/L。

其中，步骤1)所述含内层苞叶的幼穗小段，其获得过程如下：在孕穗期，取柳枝稷含苞未成熟幼穗，剥去外层苞叶和叶鞘，将含内层苞叶的幼穗垂直穗轴切成1.8-2.2厘米小段，得到含内层苞叶的幼穗小段。

其中，步骤1)所述灭菌消毒，具体方法为：以体积百分含量75％的乙醇表面消毒30秒，无菌水冲洗2次，体积百分含量20％的NaClO浸泡10分钟，无菌水冲洗3～4次，吸干表面水分。

其中，步骤2)所述低温，为6-8℃。

其中，步骤5)所述未经耐盐培育的柳枝稷，是指除培养基不含有NaCl外，按照步骤1)、步骤3)、步骤4)的方法获得的柳枝稷。

其中，所述诱导愈伤组织，初代培养时间为10天，之后每2周继代一次。所述诱导愈伤组织，共培养4-6周。

其中，所述耐盐愈伤组织培养，4周继代一次，连续培养6-8个月。

其中，所述诱导愈伤组织，其环境条件为黑暗条件下进行，温度为25±2℃。

其中，所述耐盐愈伤组织培养，在黑暗条件下进行。

其中，所述诱导芽分化、诱导生根、耐盐鉴定，其环境条件为温度25±2℃，光照时间16小时/天，光照强度1500-2000lx。

本发明的一种培育耐盐柳枝稷的方法，优选包括如下步骤：

1)诱导愈伤组织：将柳枝稷含内层苞叶的幼穗小段灭菌消毒后沿穗轴纵切为两半，接种于诱导培养基上诱导愈伤组织；

2)耐盐愈伤组织培养：将步骤1)诱导出的愈伤组织，接种到含200mmol/L NaCl的高盐增殖培养基上6-8℃低温培养；

3)诱导芽分化：将步骤2)得到的愈伤组织接种至含60mmol/L NaCl的低盐分化培养基上，诱导芽分化；

4)诱导生根：待芽长至1-2厘米后，切下芽，接种到含150mmol/L NaCl的高盐生根培养基上诱导生根；

5)耐盐鉴定：待再生苗生有2-3条根后，将其转移到含200mmol/L NaCl的MS培养基上进行耐盐筛选，培养4-6周后，筛选出生长明显优于未经耐盐培育的柳枝稷的植株，即为耐盐柳枝稷。

本发明还提供所述的培育耐盐柳枝稷的方法，在柳枝稷育种中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明耐盐柳枝稷的培育方法成熟、稳定，以柳枝稷的幼穗为外植体诱导愈伤组织，其再生率高，再生培养技术体系成熟；诱导芽分化时采用常温低盐浓度培养克服了经高盐浓度和低温处理后胚性愈伤组织不分化的问题，采用高盐浓度对幼苗进行耐盐鉴定，从而提高了耐盐突变植株的选择效率。

附图说明

图1是实施例1中低温下高盐增殖培养基上继代培养的柳枝稷愈伤组织。

图2是实施例1中常温下低盐浓度诱导芽分化的柳枝稷愈伤组织。

图3是实施例1中常温下柳枝稷植株的耐盐鉴定。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

以低地型柳枝稷品种Alamo为研究对象，在孕穗期，剪取生长健壮的柳枝稷含苞未成熟幼穗，剥去外层苞叶和叶鞘，用手术刀切取含内层苞叶的幼穗，垂直穗轴切成1.8-2.2厘米小段，得到含内层苞叶的幼穗小段。于超净工作台上，先用体积百分含量75％的乙醇进行表面消毒30秒，无菌蒸馏水冲洗2次后，再用体积百分含量20％NaClO灭菌10分钟，最后用无菌蒸馏水洗涤3-4次，放置在灭菌滤纸上，吸干表面水分。

1)：将灭菌的含内层苞叶的幼穗小段纵切成两半，然后接种于诱导培养基(MS基本培养基+3％麦芽糖+5mg/L 2,4-D+1.2mg/L 6-BA+0.8％植物凝胶，pH值5.8)中，每个培养皿6个外植体，封口膜封好，于25±2℃黑暗条件下诱导愈伤组织，10天后继代，以后2周继代一次，培养4周。诱导率为95(±2.7)％。

2)：将步骤1)中生长良好的愈伤组织转接至高盐增殖培养基(MS基本培养基+3％麦芽糖+5mg/L 2,4-D+1.2mg/L 6-BA+2g/L脯氨酸+150-250mmol/L NaCl+0.8％植物凝胶，pH值5.8)中，NaCl具体设150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L三个浓度梯度，于6-8℃黑暗条件下进行耐盐愈伤组织培养，4周继代一次，连续培养8个月。

培养结果如下：接种到含250mmol/L NaCl培养基上的愈伤组织逐渐水渍化，死去。接种到含150mmol/L、200mmol/L NaCl培养基上愈伤组织的生长均受到抑制，其中200mmol/L NaCl对愈伤组织生长抑制更明显，其新生长愈伤组织耐盐性更佳。

3)：将步骤2)中在200mmol/L NaCl高盐增殖培养基中生长良好的愈伤组织分别转接至低盐分化培养基(MS基本培养基+3％麦芽糖+0.5mg/L GA3+50-120mmol/L NaCl+0.8％植物凝胶，pH值5.8)上，于25±2℃光照条件下(光照时间为16h/d，光照强度1500-2000lx)诱导芽分化。

培养结果如下：接种到含50-80mmol/L NaCl培养基上的愈伤组织均有分化，但随着NaCl浓度的增高愈伤组织的分化率明显降低，接种到120mmol/L NaCl培养基上的愈伤组织则不分化。

4)：当步骤3)中诱导芽长至1-2厘米，用手术刀切下转接至高盐生根培养基(1/2MS基本培养基+120-200mmol/L NaCl+0.6％植物凝胶，pH值5.8)中，于温度25±2℃、光照时间16小时/天、光照强度1500-2000lx条件下诱导生根。

培养结果如下：接种到含200mmol/L NaCl培养基上的芽难以存活，接种到含120-150mmol/L NaCl培养基上的芽不仅能存活并且能生根，其中含150mmol/L NaCl培养基得到的再生苗耐盐性更佳。

5)：当步骤4)中的幼苗长至根2-3条时，将生根幼苗转移到含200mmol/L(该筛选浓度可适当提升，如提升至250mmol/L)NaCl的MS培养基(MS基本培养基+200mmol/L NaCl，pH值5.8)上，温度25±2℃、光照时间16小时/天、光照强度1500-2000lx条件下培养4-6天，然后以未经耐盐培育的柳枝稷Alamo为对照，筛选出5个耐盐的柳枝稷植株。