一种建立油用牡丹鳞芽高效无菌培养体系的方法与流程

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种建立油用牡丹鳞芽高效无菌培养体系的方法。

背景技术：

目前在我国推广的油用牡丹主要来自凤丹(Paeonia ostii)种群,是从统药用丹皮生产的凤丹、观赏用凤丹以及用作观赏牡丹砧木的凤丹种群选育出来的。凤丹繁殖的传统方法是播种，由于种子是自由授粉得到的半同胞家系，其基因型变异较大，得到的种苗在株高、适应性、抗逆性、开花结实方面千差万别，不适合规模化油料种子生产。因此，自2006年以来，特别是2011年卫生部批准牡丹籽油为国家新资源食品之后，许多科研院所和高校以及农林企业单位投入大量人力物力，从事油用牡丹优良品种选育，陆续推出一些经过审定的专用品种。然而，这些优良品种的繁育，遗传品质一致的壮苗获得，显然不能通过有性繁殖的方式获得，而营养繁殖的主流方式嫁接，繁殖系数低，成本高，受到木本材料来源和季节限制，所以组织培养快速繁殖成为规模化生产商品油用牡丹种苗的首选技术途径。遗憾的是，从1984年到现在的32年中，尽管包括各牡丹种群的芍药属组织培养文献超过400篇，但是牡丹组培用于商品苗生产的却没有一起成功案例，因此牡丹组培技术走出实验室并切实于生产一直是制约牡丹产业发展的瓶颈。

导致牡丹组培技术不能形成现实生产力的有四大难题：

第一，建立无菌培养体系效率低，从技术层面具体说来，目前已有的牡丹无菌培养体系外植体污染率高(40-70％)、褐化率高(50-100％)，诱导率低(小于30％)。

第二，芽增殖率低、继代增殖芽质量差，玻璃化生理畸形严重。

第三，生根率低，功能性根系不足。

第四，牡丹组培苗移栽成活率低，不超过42％。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种建立油用牡丹鳞芽高效无菌培养体系的方法。

本发明的一种建立油用牡丹鳞芽高效无菌培养体系的方法，包括如下步骤：

1)采集：于健壮油用牡丹枝条下部剪取含2-3个饱满鳞芽的茎段，并剪成长2.5-4厘米的单芽茎段；

2)单芽茎段清洗：将单芽茎段以质量百分浓度5％的二氯异氰尿酸钠溶液浸泡后，流水洗净二氯异氰尿酸钠溶液残留，再以洗洁精刷洗后去除叶柄，仔细刷洗叶柄脱离处，流水冲洗，剥除单芽茎段的韧皮部，以体积百分比70％的酒精浸泡；

3)芽体剥离：取出步骤2)处理后的单芽茎段，吸干表面液体，以酒精消毒后的刀片剥除鳞芽的鳞片，只保留最内层的一层鳞片，将刀片浸蘸50％复方苦参洗剂后，切除芽体基部皮层组织露出淡绿色维管组织，将芽体从单芽茎段上挑出，芽体基部保留少量木质部，将芽体放入盛有一薄层100mg/L青霉素钠的培养皿中；

4)外植体消毒：步骤3)所得芽体以紫外消毒，再以质量百分浓度0.1％的升汞溶液消毒，以无菌水冲洗5遍以上；

5)接种：将消毒后的芽体剪除最内层的鳞片，接种到启动培养基上进行培养，获得油用牡丹鳞芽高效无菌培养体系。

步骤1)所述采集，时间优选为1月中下旬的晴朗中午。

步骤1)所述单芽茎段，是指着生有一个鳞芽的茎段。优选单芽茎段的上端剪口距离鳞芽中心位置1-1.5厘米，下端剪口距离鳞芽中心位置1.5-2.5厘米。所述上端是指相对接近枝条稍端的端口，下端是指相对接近枝条基部的端口。

步骤2)所述二氯异氰尿酸钠溶液浸泡的时间为30分钟。

步骤2)所述流水洗净二氯异氰尿酸钠溶液残留，所用时间为30分钟。

步骤2)所述刷洗，为以小刷子刷洗，所述小刷子优选牙刷。

步骤2)所述流水冲洗，所用时间为10-20分钟。

步骤2)所述以体积百分比70％的酒精浸泡，所用时间为60秒。

步骤3)所述剥除鳞芽的鳞片，具体方法为：左手食指、拇指分别捏住单芽茎段上下两端，芽体面对操作者，以中指第一指节顶住芽体反面茎段木质部；右手持浸蘸过70％酒精的单面刀片，以刀尖剥离鳞片。

步骤3)所述将芽体从单芽茎段上挑出，具体方法为：在芽体基部左右各深切一刀至单芽茎段的木质部，用刀尖在芽体基部下侧上挑，将芽体从单芽茎段上挑出。

步骤3)所述少量木质部，优选大小约为1mm见方、0.5mm厚的木质部。

步骤4)所述紫外消毒，为以紫外灯照射20-30min。

步骤4)所述升汞溶液消毒，详细步骤为：每5枚芽体放入经过高压灭菌的无菌空三角瓶中，到入质量百分浓度0.1％的升汞溶液，滴入一滴吐温20，震荡8min，缓慢旋转三角瓶转使瓶内溶液流经三角瓶口各处，将溶液倒出。

步骤5)所述接种，芽体的木质部没入培养基。

步骤5)所述启动培养基是以改良MS培养基为基本培养基，聚乙烯比咯烷酮(PVP)含量1.0g/L、活性炭(AC)含量0.5g/L、6-苄氨基嘌呤(6-BA)含量0.5g/L、柠檬汁(Lemon)(新鲜柠檬挤压得到)含量1g/L、水解酪蛋白(CH)含量0.5g/L、赤霉素(GA3)含量0.3mg/L、蔗糖含量30g/L、琼脂含量6g/L、pH值5.8的培养基。

步骤5)所述培养，其环境条件为温度22±2℃，相对湿度30％，第一周黑暗，以后则50μmol photon·m^-2·s^-1光照。

本发明还提供所述建立油用牡丹鳞芽高效无菌培养体系的方法，在牡丹组织培养中的应用。

本发明的有益效果在于：

以本发明的方法建立的油用牡丹鳞芽高效无菌培养体系，在启动四周后，污染率≤10％；褐化率≤20％；诱导率≥70％。

附图说明

图1为实施例1步骤1)中单芽茎段的照片。

图2为实施例1步骤2)中芽体剥离下的韧皮部照片。

图3为实施例1步骤3)中用刀尖剥离鳞片的照片。

图4为实施例1步骤3)中用刀尖在芽体基部下侧上挑的示意照片。

图5为实施例1步骤3)中剥离的芽体的照片。

图6为实施例1步骤3)中将剥离的芽体放入盛有一薄层青霉素钠的培养皿中的照片。

图7为实施例1步骤5)中接种外植体的照片。

图8为实施例1步骤5)中接种后封口的照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

以下实施例涉及的部分化学试剂如下：50％复方苦参洗剂(国药准字B20020433，浙江中法制药有限公司)、100mg/L青霉素钠(国药准字H13020657华北制药股份有限公司)。其余化学试剂均为常规化学试剂，均可市购。

实施例1

1)采集：1月中下旬的晴朗中午，于健壮油用牡丹枝条下部，挑选芽体饱满者，从基部剪切枝条；选取下部2-3芽，断条时剪成2.5-4厘米单芽茎段，注意上端剪口距离芽中心位置1-1.5厘米，下端剪口距离芽中心位置1.5-2.5厘米。随即装入密封袋，封口，尽快带回实验室。

2)单芽茎段(照片见图1)清洗：材料带回实验室，将单芽茎段浸入5％二氯异氰尿酸钠溶液，浸泡30min；流水冲洗30min；以牙刷蘸洗洁精刷洗单芽茎段，去除叶柄，仔细刷洗叶柄基部位置；流水冲洗10min；剥除茎段韧皮部(剥离出来的韧皮部见图2)，然后将茎段投入70％酒精中浸泡60s。

3)芽体剥离：从酒精中迅速取出单芽茎段，干净滤纸吸干表面溶液；左手食指、拇指分别捏住单芽茎段上下两端，芽体面对操作者，以中指第一指节顶住芽体反面茎段木质部；右手持浸蘸过70％酒精的单面刀片，以刀尖剥离鳞片(见图3)，直至最后一层鳞片；经过酒精消毒的刀片，浸蘸50％复方苦参洗剂(国药准字B20020433，浙江中法制药有限公司)，用刀片将芽体基部皮层组织轻轻切除，露出淡绿色维管组织；在芽体基部上侧深切一刀，必须深达茎段木质部，左右各切一刀，然后用刀尖在芽体基部下侧轻轻上挑(具体操作参见图4)，保留大约1mm见方、0.5mm厚的木质部，将剥离的芽体(照片见图5)放进盛有一薄层100mg/L青霉素钠(国药准字H13020657华北制药股份有限公司)溶液的干净培养皿中(见图6)。

4)外植体消毒：培养皿移入超净台，打开紫外灯照射20min；开风机、关掉紫外灯；用经过消毒的镊子将芽体放入经过高压灭菌的无菌空三角瓶(150ml)中，接种前镊子和三角瓶瓶口灼烧消毒，每瓶5枚芽体(外植体)，倒入0.1％升汞，滴入一滴吐温20，震荡8min；右手持三角瓶底部，左手抵住三角瓶颈部以控制高度，缓慢旋转三角瓶，将消毒液轻轻倒入废液桶中，注意必须通过旋转使消毒液流流经三角瓶口各处、没有盲点。然后用无菌水冲洗5遍以上。

5)接种：左手横握盛有外植体无菌三角瓶(消毒瓶)，瓶口位于酒精灯火焰上部，右手持经过高压灭菌的弯头剪刀，剪除最内一层芽鳞；然后以左手横握盛有外植体的消毒瓶和盛有启动培养基的培养瓶，瓶口位于酒精灯火焰上部，右手以拇指和食指呈鸟喙状持枪形镊子，将外植体从消毒瓶移入培养瓶中，外植体基部的木质部没入培养基中(参见图7)，接种后瓶口在酒精灯火焰上放封口(参见图8)。

启动培养基：改良MS+1.0g/L PVP+0.5g/L AC+0.5g/L 6-BA+1g/L Lemon+0.5g/L CH+0.3mg/L GA₃每升培养基含蔗糖30克、琼脂6克，pH值5.8。

改良MS基本培养基配方见表1：

表1：改良MS基本培养基配方

培养条件：温度22±2℃，相对湿度30％，第一周黑暗，以后则50μmol photon·m^-2·s^-1光照。

培养结果：在启动四周后，污染率≤10％；褐化率≤20％；诱导率≥70％。