本发明涉及一种霍山石斛四倍体的培育方法。
背景技术：
：石斛为兰科石斛属植物，是我国传统医药学中一种名贵药材，其有效成分主要为多糖和生物碱，其中，石斛的品质优劣在很大程度上取决于石斛中多糖的含量多少。而石斛中以霍山石斛最为著名，霍山石斛多糖的药理作用主要表现在免疫、强壮、抗衰老、抗肿瘤等作用。多倍体育种是植物新品种培育的重要手段，多倍体育种起源于20世纪初，现在已广泛应用于植物新品种的培育中。多倍体由于基因组倍性的增加，往往表现出形态上的巨大性和抗性增强等特点，药用活性成分含量增加，同时增强了多倍体植株的生态适应性和对逆境的抗逆性。目前，人工诱导多倍体的方法分为物理方法、生物技术方法和化学方法。物理方法是指采用物理方法如温度的激变、机械创伤、离心力、紫外线、渗透压改变等诱导产生多倍体植株，但这类方法存在嵌合率高，危险性较大，诱导率低等缺点，逐渐被淘汰。生物技术法是指通过细胞融合、远缘杂交等方法获得多倍体，该方法还处于探索阶段，技术还不够成熟，但应用前景非常广阔。化学诱导法分为原位诱导法和离体诱导法。其中，原位诱导法即把植物种子、生长的幼苗、茎尖在非离体条件下通过诱导剂处理，诱导染色体加倍的方法；离体诱导法是通过组织培养，在离体水平上诱导细胞内染色体加倍，从而获得多倍体植株的方法，该方法诱导率高、重复性强、实验条件易于控制、获得的多倍体嵌合率低等特点，具有较好的应用前景。随着社会发展，人们对健康的关注越来越高，其需求量也会越来越大，霍山石斛次生代谢产物成分复杂，具有药用活性的主要集中在黄铜、生物碱和多糖类，是我国中药中国的珍惜名贵药材。由于霍山石斛的药用和保健作用被广泛认识，霍山石斛的市场需求量大增，而霍山石斛的目前状况生产率较低，因此常规霍山石斛的种植方法满足不来市场需求。结合多倍体诱导技术应用于石斛种植的研究，现有技术鲜有报道，因此寻求一种药用成分含量高，耐候性好的霍山石斛多倍体培养方法具有一定的经济意义和社会应用价值。技术实现要素：为解决现有技术中霍山石斛生产率低、常规生长满足不了市场需求的技术问题，本发明提供一种霍山石斛四倍体的培育方法，所述方法培育出的霍山石斛四倍体植株由于染色体的加倍，其药效成分显著增加，具有较广阔的应用前景。本发明解决技术问题采用如下技术方案：一种霍山石斛四倍体的培育方法，将霍山石斛蒴果，经清洗、消毒后将蒴果在无菌培养基皿内剪开，取出种胚进行无菌培养，使种胚萌发为绿色种胚原球茎；再将原球茎接种于添加有二甲基亚砜和秋水仙素的出牙诱导培养基上进行诱导，再转移到不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基上进行培养，得到霍山石斛四倍体植株。优选地，所述霍山石斛的清洗、消毒的方法是将蒴果置于洗洁精浸泡15~30min，清洗干净后置于体积分数为75%的酒精中消毒20~60s，在用质量分数为0.1%的氯化汞浸泡灭菌10~25min，最后用无菌水清洗3~5次。优选地，所述出种胚进行无菌培养的方法是将种胚分散在少量无菌水中，用吸管吸取含种胚的无菌水，将其接种到B5+NAA0.2mg/L的培养基上，25~30℃培养10~15d，转为光照培养30~45d。优选地，所述二甲基亚砜在培养基中含量为3%~7%。优选地，所述秋水仙素的质量分数为0.01%~0.5%。优选地，所述诱导培养基配方为MS+6-BA0.1~0.6mg/L+TDZ0.3~1.0mg/L。优选地，所述诱导培养时间为3~5天。优选地，所述不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基配方为MS+6-BA0.1~0.6mg/L+TDZ0.3~1.0mg/L。优选地，所述不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基培养时间为15~25天。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明所述的一种霍山石斛四倍体的培育方法，培育出的霍山石斛四倍体植株由于染色体的加倍，使得霍山石斛具有较高的药用成分，能大大提高霍山石斛多糖的产率，且工艺比较简单、稳定，环境友好，适合工业化生产，具有较广阔的应用前景。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：将霍山石斛蒴果置于洗洁精浸泡15min，清洗干净后置于体积分数为75%的酒精中消毒30s，再用质量分数为0.1%的氯化汞浸泡灭菌15min，最后用无菌水清洗3次。将清洗后的蒴果在无菌培养基皿内剪开，取出种胚进行无菌培养，将种胚分散在少量无菌水中，用吸管吸取含种胚的无菌水，将其接种到B5+NAA0.2mg/L的培养基上，25℃培养15d，转为光照培养30d，使种胚萌发为绿色种胚原球茎。再将原球茎接种于添加有二甲基亚砜3%和秋水仙素0.03%的出牙诱导培养基MS+6-BA0.1mg/L+TDZ0.3mg/L上进行诱导3d，再转移到不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基MS+6-BA0.1mg/L+TDZ0.3mg/L上进行培养20d，得到霍山石斛多倍体植株。取培养得到的霍山石斛植株细胞组织染色压片，镜检验证染色体倍数，选取染色体数目2n=4x=76的幼苗，是培育成功的四倍体。实施例2：将霍山石斛蒴果置于洗洁精浸泡15min，清洗干净后置于体积分数为75%的酒精中消毒30s，再用质量分数为0.1%的氯化汞浸泡灭菌15min，最后用无菌水清洗3次。将清洗后的蒴果在无菌培养基皿内剪开，取出种胚进行无菌培养，将种胚分散在少量无菌水中，用吸管吸取含种胚的无菌水，将其接种到B5+NAA0.2mg/L的培养基上，25℃培养15d，转为光照培养30d，使种胚萌发为绿色种胚原球茎。再将原球茎接种于添加有二甲基亚砜3%和秋水仙素0.03%的出牙诱导培养基MS+6-BA0.3mg/L+TDZ0.6mg/L上进行诱导3d，再转移到不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基MS+6-BA0.3mg/L+TDZ0.6mg/L上进行培养20d，得到霍山石斛多倍体植株。取培养得到的霍山石斛植株细胞组织染色压片，镜检验证染色体倍数，选取染色体数目2n=4x=76的幼苗，是培育成功的四倍体。实施例3：将霍山石斛蒴果置于洗洁精浸泡15min，清洗干净后置于体积分数为75%的酒精中消毒30s，再用质量分数为0.1%的氯化汞浸泡灭菌15min，最后用无菌水清洗3次。将清洗后的蒴果在无菌培养基皿内剪开，取出种胚进行无菌培养，将种胚分散在少量无菌水中，用吸管吸取含种胚的无菌水，将其接种到B5+NAA0.2mg/L的培养基上，25℃培养15d，转为光照培养30d，使种胚萌发为绿色种胚原球茎。再将原球茎接种于添加有二甲基亚砜5%和秋水仙素0.06%的出牙诱导培养基MS+6-BA0.1mg/L+TDZ0.3mg/L上进行诱导3d，再转移到不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基MS+6-BA0.1mg/L+TDZ0.3mg/L上进行培养20d，得到霍山石斛多倍体植株。取培养得到的霍山石斛植株细胞组织染色压片，镜检验证染色体倍数，选取染色体数目2n=4x=76的幼苗，是培育成功的四倍体。实施例4：将霍山石斛蒴果置于洗洁精浸泡15min，清洗干净后置于体积分数为75%的酒精中消毒30s，再用质量分数为0.1%的氯化汞浸泡灭菌15min，最后用无菌水清洗3次。将清洗后的蒴果在无菌培养基皿内剪开，取出种胚进行无菌培养，将种胚分散在少量无菌水中，用吸管吸取含种胚的无菌水，将其接种到B5+NAA0.2mg/L的培养基上，25℃培养15d，转为光照培养30d，使种胚萌发为绿色种胚原球茎。再将原球茎接种于添加有二甲基亚砜7%和秋水仙素0.1%的出牙诱导培养基MS+6-BA0.1mg/L+TDZ0.3mg/L上进行诱导5d，再转移到不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基MS+6-BA0.1mg/L+TDZ0.3mg/L上进行培养20d，得到霍山石斛多倍体植株。取培养得到的霍山石斛植株细胞组织染色压片，镜检验证染色体倍数，选取染色体数目2n=4x=76的幼苗，是培育成功的四倍体。实施例5：将霍山石斛蒴果置于洗洁精浸泡15min，清洗干净后置于体积分数为75%的酒精中消毒30s，再用质量分数为0.1%的氯化汞浸泡灭菌15min，最后用无菌水清洗3次。将清洗后的蒴果在无菌培养基皿内剪开，取出种胚进行无菌培养，将种胚分散在少量无菌水中，用吸管吸取含种胚的无菌水，将其接种到B5+NAA0.2mg/L的培养基上，25℃培养15d，转为光照培养30d，使种胚萌发为绿色种胚原球茎。再将原球茎接种于添加有二甲基亚砜3%和秋水仙素0.3%的出牙诱导培养基MS+6-BA0.6mg/L+TDZ1.0mg/L上进行诱导3d，再转移到不含二甲基亚砜和秋水仙素的培养基MS+6-BA0.6mg/L+TDZ1.0mg/L上进行培养25d，得到霍山石斛多倍体植株。取培养得到的霍山石斛植株细胞组织染色压片，镜检验证染色体倍数，选取染色体数目2n=4x=76的幼苗，是培育成功的四倍体。将上述培育制得的四倍体霍山石斛植株，按照常规方法制成霍山石斛粗粉，并取50g粗粉进行霍山石斛多糖提取，最后获得目标产物霍山石斛多糖及收率见下表。多糖含量/g收率%实施例112.7625.4实施例211.9523.9实施例311.6323.26实施例410.8721.74实施例510.6221.24对比例18.2816.57其中，对比例1为选取常规播种生长8个月的霍山石斛组培苗，将组培苗洗净沥干后杀青，再70℃干燥至恒重，并磨成粉末，获得的霍山石斛粗粉。通过上述对比，可以很清楚的判定本发明所述的方法所培育出的霍山石斛中多糖含量明显高于常规生长环境下获得的霍山石斛植株中多糖的含量，本发明具有较好的应用前景。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。当前第1页1 2 3