本发明属于植物育种
技术领域：
，具体涉及一种利用去离子甲酰胺进行杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法。
背景技术：
：鹅掌楸的组织培养始于1986年，美国人Sommer等人对北美鹅掌楸进行了组织培养试验，得到了一些植株。Parks等利用幼胚对北美鹅掌楸进行培养。国内研究杂交鹅掌楸体胚成果最显著的是，陈金慧等人以未成熟种胚为外植体，经过愈伤组织诱导和悬浮培养，建立起的杂交鹅掌楸一整套体细胞胚胎发生系统，以及体胚快速成苗体系。该研究在杂交鹅掌楸体胚发生的各个培养阶段均优选出了最佳培养方案，其中包括愈伤组织诱导、继代、悬浮培养、平板培养以及生根培养等最佳配方。另外，其在研究体胚发生过程中的激素变化、蛋白质变化以及相关基因的表达与调控等方面，也有了比较明显的进展。再生植株的田间试验结果表明，再生植株保持了明显的杂种优势，并在生长势、株型结构上明显优于同期的扦插苗。现有的杂交鹅掌楸体胚发生体系主要包括愈伤组织诱导、胚性愈伤组织培养、悬浮培养、平板培养、体胚再生植株培养几个重要环节。这种培养方法步骤多，时间久，还不够便捷，需要对其进行进一步的创新，满足使用需求。技术实现要素：发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种利用去离子甲酰胺进行杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法，跳过体胚发生过程中悬浮培养和平板培养这两个体胚诱导环节，从而更加高效便捷地获得高质量体胚再生植株。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种利用去离子甲酰胺进行杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法，包括以下步骤：1)杂交鹅掌楸胚性愈伤组织的诱导；2)以3/4MS+VC5mg/L+蔗糖30g/L+去离子甲酰胺0.01～1mg/L为基本培养基，24℃暗培养杂交鹅掌楸胚性愈伤组织；3)待从愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，将材料转移至光照培养室组培瓶中，以3/4MS基本培养基继续培养至再生植株；4)将再生植株驯化后移栽到直径为5-8厘米的小盆中；随后进行正常的室外栽培。所述愈伤组织基因型包括：253010、C136、112040。步骤2)中，培养基为3/4MS+VC5mg/L+蔗糖30g/L+去离子甲酰胺0.1mg/L。有益效果：与现有技术相比，本发明的利用去离子甲酰胺进行杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法，通过纯固体培养方式，跳过体胚发生过程中悬浮培养和平板培养这两个体胚诱导环节，优化并丰富杂交鹅掌楸体胚发生系统，从而更加高效便捷地获得高质量体胚再生植株。建立出稳固、高频、操作简单、苗木抗性良好的杂交鹅掌楸纯固体培养基体胚发生体系，为建立更加高效的杂交鹅掌楸遗传转化受体体系提供参考。试验证实，去离子甲酰胺能够在固体培养基中诱导杂交鹅掌楸愈伤组织体胚高频发生，浓度为0.1mg/L时体胚诱导能力最强，平均每克愈伤组织体胚诱导数量高达1989个左右，体胚发生速度较3/4MS基本培养基和3/4MS+ABA体胚诱导培养基至少快25d以上。附图说明图1是去离子甲酰胺诱导的杂交鹅掌楸体胚形态图；图2是不同浓度去离子甲酰胺作用下基因型253010的体胚发生数结果图；图3是0.1mg/L浓度去离子甲酰胺诱导基因型253010体胚发生过程影响图；图中a,b,c,d分别为基因型253010体胚发生15d,30d,45d,60d；图4是不同浓度去离子甲酰胺作用下基因型C136体胚发生数结果图；图5是不同浓度去离子甲酰胺对基因型C136愈伤组织的影响结果图；图中，a为实验前胚性愈伤组织，b～h分别对应F1～F7号培养基；图6是0.1mg/L浓度去离子甲酰胺诱导基因型C136体胚发生过程结果图；图中，a,b,c,d分别为基因型C136体胚发生25d,40d,55d,70d；图7是不同浓度去离子甲酰胺作用下基因型112040体胚发生数结果图；统计及拍摄时间为处理后80d；图8是不同浓度去离子甲酰胺对基因型112040愈伤组织的影响结果图；图中，a为实验前胚性愈伤组织，b～h分别对应F1～F7号培养基；图9是0.1mg/L去离子甲酰胺诱导基因型112040体胚发生过程；图中，a,b,c,d分别为基因型112040体胚发生25d,40d,60d,75d；图10是不同基因型在去离子甲酰胺作用下的体胚发生情况结果图；图11是不同基因型在去离子甲酰胺作用下的成熟体胚发生情况结果图；图12是不同浓度培养基诱导的体胚再生植株图；a为光照15d的对照组体胚再生植株，b为光照15d、60d、30d的去离子甲酰胺体胚再生植株。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例的材料为杂交鹅掌楸胚性愈伤组织，愈伤组织基因型包括：253010、C136、112040，该愈伤组织均呈淡黄色、致密、易松散、细小的颗粒状，生长速度适中且状态稳定，如图1。该杂交鹅掌楸愈伤组织，利用未成熟胚诱导而形成，具体诱导方法为本领域常规技术。以下实施例的数据分析方法为：采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析(OneWayANOVA)，平均值的比较采用Duncan多重比较检验(Duncan,smultipletest)，显著性水平设为α＝0.05和α＝0.01两个水平。采用Excel对SPSS软件分析结果进行绘图。实施例1一种杂交鹅掌楸体胚固体培养快繁方法，包括以下步骤：1)杂交鹅掌楸胚性愈伤组织固体培养以3/4MS+VC5mg/L+蔗糖30g/L为基本培养基，分别附加不同浓度的液态去离子甲酰胺(FormamideDeionized)，纯度＞99.5％，组成杂交鹅掌楸体胚诱导培养基。以不含去离子甲酰胺的基本培养基为对照。采用3种基因型，7个浓度梯度(F10mg/L、F20.05mg/L、F30.1mg/L、F40.5mg/L、F51mg/L、F65mg/L、F710mg/L)，每个浓度至少接种3皿，每皿接5块愈伤组织，每块愈伤组织直径约0.5cm，质量约1.6g/皿。起始培养环境为24℃暗培养。每次继代时间为28d。对图1中各种形态的体胚进行统计，作为总体胚数，已发育至鱼雷形胚及以后的归为成熟体胚。其中总体胚主要为愈伤组织压平分散后，可以轻易分离的，表面光滑，呈球形、椭球形、心形或不规则长形等性状的一个个体，能够看出与愈伤组织形态明显不同。如图2所示(图中，统计及拍照时间为处理后56d。字母表示各培养基上总体胚之间的差异性比较以及成熟体胚之间的差异性比较；字母相同表示差异不显著，不相同表示差异显著，大写字母表示0.01极显著水平，小写字母表示0.05显著水平。标注“*”代表F2～F7培养基与F1(CK)之间的相互比较，其中总体胚与总体胚进行比较，成熟体胚与成熟体胚进行比较；*表示0.05显著水平，**表示0.01极显著水平。)，低浓度的去离子甲酰胺能够诱导杂交鹅掌楸愈伤组织体胚产生，而高浓度的去离子甲酰胺则会抑制其体胚的产生，甚至伤害愈伤组织细胞，浓度超过1％时就会导致愈伤组织死亡。图表显示，基因型253010对去离子甲酰胺非常敏感，仅用0.1mg/L的去离子甲酰胺就能够诱导其体胚发生，且数量达到最高，高达3097个/克；而当浓度1mg/L时，其体胚发生数量迅速下降，愈伤组织褐化，状态变差，其中浓度为1mg/L时体胚发生数量与对照组无明显差异；当浓度5mg/L时，体胚就几乎不发生了，且愈伤组织褐化严重，逐渐死亡。在对基因型253010成熟体胚发生情况进行统计观察的时候发现，F3培养基显著高于其他培养基，但是成熟子叶胚中有较多的畸形胚，很多子叶都比较膨大，扭曲。针对这种现象，本实施例对其采用3/4MS培养基进行光照培养，一个月后发现继初生子叶之后的真叶大部分发育正常，植株可以正常生长。如图3，基因型253010愈伤组织材料培养15d对其观察，发现胚状体开始产生(图3a)；30d时观察到大量球形胚和鱼雷胚(图3b)；45d～60d发育成成熟子叶胚，并从原组织上继续产生大量胚状体(图3c，图3d)。通过对杂交鹅掌楸基因型C136体胚发生数量的统计和愈伤组织状态的分析，发现：去离子甲酰胺对其诱导的最佳浓度为0.1mg/L，此时体胚发生数量高达1628个/克，成熟体胚数达483个/克，与其他浓度差异极显著，约为对照组的6倍；愈伤组织状态也比较好，颗粒饱满，大部分均能发育为体胚；但当浓度高于5mg/L时愈伤组织状态也明显恶化，褐化严重，生长速度极为缓慢，细胞遭受严重损伤，体胚不发生，如图4,5所示。研究观察到，基因型C136愈伤组织体胚发生与基因型253010相比较晚一些，在培养基上培养25d左右出现大量密集的小球形胚(图6a)；40d左右球形胚长大，有的已发育成鱼雷胚，并且愈伤组织开始大面积产生体胚(图6b)；55d左右部分体胚发育成熟(图6c)；70d时几乎所有的愈伤组织颗粒都分化成了体胚，此时应及时地进行光照培养以获得再生植株(图6d)。如图7所示，基因型112040与基因型C136、253010受去离子甲酰胺的影响相似。在F3培养基上体胚诱导数量最高，与其他培养基差异极显著，P值＜0.01；其次是F4培养基，总体胚数和成熟体胚数与其他浓度均差异显著；F6和F1培养基体胚诱导数量最低，无明显差异，但是F6愈伤组织状态比F1差距大；F7培养基愈伤组织状态差，无体胚发生。通过对基因型112040体胚发生数量和愈伤组织状态、体胚质量的研究，发现基因型112040在低浓度的去离子甲酰胺培养基上愈伤组织状态明显好于对照组，体胚数量也是对照组的4倍多；而在高浓度的去离子甲酰胺培养基上，体胚发生数量下降趋势极为明显，甚至不发生体胚，愈伤组织颗粒粗大，增殖缓慢(如图7，图8)；另外，去离子甲酰胺在浓度0.5mg/L时诱导的体胚比0.1mg/L时发育稍早，稍好。基因型112040在培养25d时，虽无胚状体产生，但是愈伤组织明显比处理前质地浓厚(图9a)；培养40d时愈伤组织呈颗粒状，轮廓清晰，但此时颗粒表面还比较粗糙，不规则(图9b)；到60d时愈伤组织呈现大面积球形胚，该球形胚轮廓清晰，表面光滑，质地坚硬(图9c)；75d时部分体胚发育为成熟胚，并有大量体胚继续产生(图9d)。由上可见，杂交鹅掌楸各个基因型对去离子甲酰胺的反应比较一致，均在浓度0.1mg/L时体胚发生数量最高，且与其他各个浓度之间差异极显著；随着浓度的继续升高体胚发生数量迅速降低；另外，愈伤组织状态也随着去离子甲酰胺浓度的升高逐渐变差，浓度不到20mg/L的时候愈伤组织就已经死亡，如图10和图11。各个基因型虽然对去离子甲酰胺反应趋势相同，但是其体胚发生能力却有着很大的差异。基因型253010体胚发生能力明显高于其他三个基因型，对去离子甲酰胺的敏感度也最强，从体胚发生数量、质量、速度以及反应程度来看，基因型253010＞C136＞112040。2)待从愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，调整培养条件，将材料转移至光照培养室组培瓶中，以3/4MS基本培养基继续培养至再生植株。将杂交鹅掌楸成熟体胚连同其基部的部分愈伤组织转移到培养瓶中，并用镊子轻轻压平，使其充分接触培养基，每瓶接5块，每块直径约0.8cm，用3/4MS基本培养基培养，培养条件为24℃光照培养。如图12所示，去离子甲酰胺诱导的体胚能够更好地发育成体胚再生植株，再生植株数量、生长速度皆优于对照组，但是畸形子叶较多，通过继续跟踪观察发现大部分子叶畸形的体胚再生植株，在真叶长出之后均能发育成正常的植株。为了进一步了解植株再生情况，对生长2个月的F1、F3两组植株的成苗率及生长势进行统计，结果如下表1。表3-2去离子甲酰胺诱导的杂交鹅掌楸植株再生情况培养基类型成苗率/％叶片数株高/cm茎长/cm根数根长/cm根粗/cmF145.3352.571.8742.390.8F386.2152.722.1431.561.4P值0.000**10.000**0.000**0.1580.000**0.007**注：**表示P＜0.01极显著性水平，*表示P＜0.05显著性水平从表1可以直观地看出，浓度为0.1mg/L的去离子甲酰胺处理下的体胚，成苗率极显著高于对照组，高达86.21％；生根数、叶片数与对照没有明显差异；植株平均高度与茎长高于对照，达到极显著水平；根长极显著低于对照组，但其根系直径极显著大于对照组植株。3)当再生苗长大后，将其驯化后移栽到直径为5-8厘米的小盆中；盆中培养基质为混合均匀的草炭土：蛭石：珍珠岩＝3:1:1(体积比)，随后进行正常的室外栽培。实施例2一种杂交鹅掌楸体胚固体培养快繁方法，同实施例1，其中在最适浓度的去离子甲酰胺培养基(3/4MS+VC5mg/L+去离子甲酰胺0.1mg/L+蔗糖30g/L)中添加2.0mg/L的ABA，对基因型253010、112040、C136进行新的一轮体胚诱导培养，重复3次实验，每5d观察记录一次体胚发生状态，待各基因型体胚发育成熟采用称重法统计体胚发生数量。结果如表2所示。表2去离子甲酰胺联合ABA对杂交鹅掌楸体胚诱导的作用注：本实施例使用的材料为新材料，因此与实施例1数据稍有差异。表2显示，杂交鹅掌楸体胚发生速度关系分别为ABA+去离子甲酰胺＜3/4MS＜ABA＜去离子甲酰胺，说明去离子甲酰胺与ABA联合诱导不利于杂交鹅掌楸体胚快速发生和发育。当前第1页1 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