专利名称：一种去离子甲酰胺的制备方法
技术领域：
本发明涉及法医遗传学及分子生物学领域。特别涉及一种去离子甲酰胺的制备方法。
背景技术：
很多分子生物学DNA检测技术需要对样品DNA需要进行变性处理，即使DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为单链结构。凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可破坏双螺旋结构引起核酸分子变性。甲酰胺作为一种变性剂被广泛用于核酸杂交和核酸变性，如Southern， Northern, Slot blot分析，YAC筛选等，法医DNA检测中需要使用甲酰胺对样品DNA进行变性处理，以保持DNA的单链状态，便于后续毛细管电泳检测。能够满足上述应用的甲酰胺必须高度去离子化以及具备较高的纯度(无污染物)，因此甲酰胺的质量非常重要，务必使用电导率小于100μ S/cm的去离子甲酰胺。电导率大于100μ S/cm的甲酰胺含有离子，在进样时与DNA竞争，这会导致低的峰值，降低灵敏度。延长进样时间不能提高信号强度。离子交换树脂是带有官能团(有交换离子的活性基团)、具有网状结构、不溶性的高分子化合物。通常是球形颗粒物。离子交换树脂的全名称由分类名称、骨架(或基因)名称、基本名称组成。孔隙结构分凝胶型和大孔型两种，凡具有物理孔结构的称大孔型树脂， 在全名称前加“大孔”。分类属酸性的应在名称前加“阳”，分类属碱性的，在名称前加“阴”。 如大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。树脂中化学活性基团的种类决定了树脂的主要性质和类别。离子交换树脂首先区分为阳离子树脂和阴离子树脂两大类。阳离子树脂又分为强酸性和弱酸性两类，阴离子树脂又分为强碱性和弱碱性两类(或再分出中强酸和中强碱性类)。离子交换树脂通常制成珠状的小颗粒，它的尺寸也很重要。树脂颗粒较细者，反应速度较大，但细颗粒对液体通过的阻力较大，需要较高的工作压力；特别是浓糖液粘度高， 这种影响更显著。因此，树脂颗粒的大小应选择适当。如果树脂粒径在0.2mm(约为70目) 以下，会明显增大流体通过的阻力，降低流量和生产能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种去离子甲酰胺的制备方法。本发明的提供去离子甲酰胺的制备方法，包括如下步骤(1)将甲酰胺与离子交换树脂混合，得到混合液；(2)将上述步骤(1)中得到的混合液混合均勻，再将混合液通过过滤器去除离子交换树脂，收集滤液，得到所述去离子甲酰胺。步骤⑴中，所述甲酰胺与离子交换树脂的配比为(100-500)ml (2_8)g，优选为甲酰胺离子交换树脂为100ml 5g。
步骤O)中，所述混合均勻通过搅拌进行。上述搅拌是通过磁力搅拌器进行的；所述搅拌的搅拌时间为45分钟-120分钟，优选为45-60分钟；所述磁力搅拌器的转速为400-800rpm，优选是600rpm ；上述搅拌时间为如下1)或2)所述1)步骤(1)中甲酰胺的pH小于7. 0，搅拌时间为45分钟；2)步骤(1)中甲酰胺的pH大于7. 0，搅拌时间为60分钟。步骤O)中，所述混合均勻通过震荡进行。上述震荡步骤的震荡时间为2-7小时，优选为3小时。上述离子交换树脂为阳离子交换树脂或阴离子交换树脂；所述离子交换树脂优选是经过冷冻脱水处理的离子交换树脂；所述离子交换树脂为AG501-X8树脂和/或MB-3树脂；所述离子交换树脂的交联度为5%。上述过滤器为Whatman过滤器、Millipore过滤器或尼龙过滤器，所述过滤器的孔径优选为0. 22um。上述制备方法得到的去离子甲酰胺也属于本发明的保护范围。经过本发明方法获得的超纯的甲酰胺具有较高的纯度，无RNase和DNase。这使得甲酰胺成分分子生物学领域的一种理想的变性剂。甲酰胺不会引起一些珍贵DNA或RNA样本的降解。甲酰胺必须通过一个混合离子交换树脂进行预过滤以去除残留金属离子或其它降解产物。这个过滤的过程保证了溶液的最终纯度高于99. 5%，280nm处吸收值低于0. 05。 能够使DNA氢键断裂，从而实现DNA变性。本发明的去离子甲酰胺能够降低核酸的溶解温度使得核酸两条链更容易分离。通常，DNA在双链结构状态下相对比较稳定(即使是在碱基不互补的条件下)，而在单链条件下DNA结构变得不稳定，所以甲酰胺必须增加单链分子的稳定性，即本发明方法中所选用的待去离子的超纯的甲酰胺应具有较高的纯度，且无RNase和DNase。本发明的制备去离子甲酰胺的方法中所需的甲酰胺为高纯级，即纯度为99. 9%以上的甲酰胺，并在氮气的环境下包装，检测无RNA酶，磷酸酶，DNA酶以及蛋白酶。本发明的方法中需要借助一种或几种离子交换树脂的使用，从而有效地去除甲酰胺中的各种离子杂质。实验证明采用上述方案制备得到的去离子甲酰胺的含水量均在1.8%以下。实施例2所制备的甲酰胺电导大大低于100 μ S/cm,批次间重复性较好，在室温下的稳定性良好，完全能够满足应用要求(表3)。毛细管电泳检测结果如图1和图2所示，采用本发明所制备的甲酰胺进行DNA双链样本的变性处理，然后进行毛细管电泳，结果显示，内标峰型尖锐，分离度好，无非特异性杂峰出现，DNA片段进样量均勻，峰高分布正常，表明去离子甲酰胺的电导率完全符合毛细管电泳样本处理要求。
图1为实施例1得到的去离子甲酰胺与DNA样本混合进行毛细管电泳检测的电泳检测结果。图2为实施例2得到的去离子甲酰胺与DNA样本混合进行毛细管电泳检测的电泳检测结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、去离子甲酰胺的制备(1)取分析纯(99. 9%质量百分含量)甲酰胺IOOml (购自Fisher公司)，置于烧瓶瓶中。称出25g交联度为5%的Bio-Rad AG501-X8树脂。将树脂进行冷冻脱水处理，即进行冷冻脱水过夜，使离子交换树脂的水分被完全蒸干，上述树脂的粒径为300-1180um。(2)将上述步骤⑴中冷冻脱水处理后的树脂与烧瓶中的甲酰胺混合，温和震荡不超过7小时，本实施例震荡3小时，使离子交换树脂与甲酰胺充分接触。(3)将上述步骤O)中混合均勻的混合液通过预清洗的Whatmaniil过滤器(过滤器的孔径为0. 22um)过滤，收集滤液，得到去离子甲酰胺。(4)将上述步骤(3)中得到的去离子甲酰胺进行分装，在-20°C的条件下储存。实施例2、去离子甲酰胺的制备(1)取分析纯(99. 9% )甲酰胺100ml (购自Amresco公司)，置于250ml烧瓶里， 并检测其PH值。称出5g交联度为5%的Bio-Rad MB-3树脂。将树脂加入到装有甲酰胺的烧瓶中(即比例为甲酰胺离子交换树脂为 IOOml 5g)，并加入磁力搅拌子(长度为1. 2cm)。(2)盖住上述步骤(1)中已加入磁力搅拌子的烧瓶并启动磁力搅拌器进行搅拌， 搅拌的转速为600rpm。根据上述步骤(1)中检测的甲酰胺的PH值，确定搅拌时间①如果初始甲酰胺的 PH小于7. 0，磁力搅拌时间为45分；②如果初始甲酰胺的pH大于7. 0，磁力搅拌时间为60 分。至此得到搅拌后的混合液。(3)将上述步骤O)中得到的混合液通过孔径0. 2um尼龙过滤器(型号Nalgene， cat#153-0020)，收集滤液，得到去离子甲酰胺。(4)将上述步骤(3)中得到的去离子甲酰胺进行分装，在-20°C的条件下储存。实施例3、检测分析—、测定制备的去离子甲酰胺样品的含水量去离子甲酰胺的含水量是考察本制备工艺的重要的指标。同时也是评价本制备方法优劣的重要参考参数。因此，将上述实施例1和实施例2制备得到的不同批次的胺分别进行含水量的测定。其具体步骤如下1.先取400 μ L制备的去离子甲酰胺，并确定其质量；2.按照卡尔费休水分仪的操作说明注入其反应池中；3.等测试数据稳定，该数值为400uL去离子甲酰胺样品中水的质量4.用水的质量除以400uL去离子甲酰胺样品的质量即为去离子甲酰胺样品含水量值。用离子交换树脂得到的去离子甲酰胺的含水量一般在1.5% _3%，离子越多，含水量越大。表1.实施例1中获得的不同批次的去离子甲酰胺的含水量(质量百分含量)
权利要求
1.一种去离子甲酰胺的制备方法，包括如下步骤(1)将甲酰胺与离子交换树脂混合，得到混合液；(2)将上述步骤(1)中得到的混合液混合均勻，再将混合液通过过滤器去除离子交换树脂，收集滤液，得到所述去离子甲酰胺。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述甲酰胺与离子交换树脂的配比为(100-500)ml (2-8) g;优选的是，甲酰胺与离子交换树脂配比为IOOml 5g。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于步骤O)中，所述混合均勻通过搅拌进行。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述搅拌是通过磁力搅拌器进行的； 所述搅拌的搅拌时间为45分钟-120分钟，优选为45-60分钟；所述磁力搅拌器的转速为 400-800rpm,优选是 600rpm。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述搅拌时间为如下1)或2)所述1)步骤(1)中甲酰胺的PH小于7.0，搅拌时间为45分钟；2)步骤(1)中甲酰胺的pH大于7.0，搅拌时间为60分钟。
6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中，所述混合均勻通过震荡进行。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述震荡步骤的震荡时间为2-7小时， 优选为3小时。
8.如权利要求1-7中任一所述的制备方法，其特征在于所述离子交换树脂为阳离子交换树脂或阴离子交换树脂；所述离子交换树脂优选是经过冷冻脱水处理的离子交换树脂；所述离子交换树脂为AG501-X8树脂和/或MB-3树脂；所述离子交换树脂的交联度为5%。
9.如权利要求1-8中任一所述的制备方法，其特征在于所述过滤器为Whatman过滤器、Millipore过滤器或尼龙过滤器，所述过滤器的孔径优选为0. 22um。
10.权利要求1-9中任一所述制备方法得到的去离子甲酰胺。
全文摘要
本发明公开了一种去离子甲酰胺的制备方法。本发明的提供去离子甲酰胺的制备方法，包括如下步骤(1)将甲酰胺与离子交换树脂混合，得到混合液；(2)将上述步骤(1)中得到的混合液混合均匀，再将混合液通过过滤器去除离子交换树脂，收集滤液，得到所述去离子甲酰胺。采用上述方案制备得到的去离子甲酰胺的含水量均在1.8％以下，甲酰胺电导大大低于100μS/cm，批次间重复性较好，在室温下的稳定性良好，完全能够满足应用要求。毛细管电泳检测结果显示，内标峰型尖锐，分离度好，无非特异性杂峰出现，DNA片段进样量均匀，峰高分布正常，表明去离子甲酰胺的电导率完全符合毛细管电泳样本处理要求。
文档编号C07C233/03GK102241602SQ20111011523
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月5日 优先权日2011年5月5日
发明者叶健, 姜伯玮, 赵兴春 申请人:公安部物证鉴定中心