一种刨花润楠的组培繁殖方法与流程

本发明属于植物的组织培养技术领域，具体涉及刨花润楠的组织培养繁殖方法。

背景技术：

刨花润楠(Machilus pauhoi Kanehira)隶属樟科((Lauraceae))润楠属(Machilus)，成年树高可达20m，胸径50cm。刨花润楠是典型的亚热带东部湿润气候区树种，自然分布于浙江、安徽、湖南、江西、福建、广西、广东和香港等省区。刨花润楠用途广，可做香粉，粘合剂，提取精油，单宁等，全株利用率高，既是用材树种，又是良好的经济树种，也可用于园林绿化，具有重要的经济效益与生态效益。近年来，国内对刨花润楠苗木的需求不断增大，市场供不应求。

目前刨花润楠主要通过播种育苗繁殖，导致刨花润楠苗木及其造林后的林分个体分化大，参差不齐，进而影响到人工林的造林质量、产量及经济效益。而且刨花润楠为顽拗性种子，寿命短，难贮藏，“大小年”现象又非常严重，这些问题严重制约着实际生产，因此开展刨花润楠的组织培养技术具有重要的现实意义。

经文献检索，目前尚未见任何关于刨花润楠组培快繁的报道。

技术实现要素：

基于此，有必要针对应用组培快繁技术培育刨花润楠的空白，提供一种刨花润楠的组培繁殖方法。本发明选取生长健壮、树型圆满、无病虫害，树高10m以上为采种母树，采集成熟种子为外植体，通过对外植体处理，基本培养基设计、激素种类、浓度及其配比的优化，建立离体植株再生技术，达到外植体诱导培养污染率低、时间短、不定芽多、生根率高等目的，为我国刨花润楠人工林栽培所需优质种苗的繁殖提供技术支撑，对提高刨花润楠人工林经济效益有着极其重大的意义。

本发明的一种刨花润楠的组培繁殖方法，步骤如下：

(1)外植体采集与处理：

选取生长健壮、树型圆满、无病虫害，树高10m以上的刨花润楠为采种母树，种子采集后，清水浸泡2～3d，搓掉外种皮，冲洗干净后，挑选出种实饱满，无病虫害的种子。用1000mg/L的GA₃溶液浸泡种子60min。

(2)外植体表面消毒：

在超净工作台上先将刨花润楠种子小心剥去膜质内种皮(注意不要伤及种胚)，加入0.1％升汞溶液，浸泡12min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液用无菌水冲洗5～6次。

(3)芽诱导：

将消毒好的种子接种到诱导培养基进行培养，诱导培养基的配方为MS₀培养基中添加蔗糖25～40g/L和卡拉胶8g/L制成，至培养基pH为5.8-6.0止。每瓶接种一粒种子。5～7d之后，胚开始萌动，一个月后幼苗可达到3～4cm高。

(4)丛芽增殖：

将步骤(3)萌发后培养25～30d的芽切下，切为2～3cm茎段，转接到增殖培养基中进行增殖培养；首先将茎段在添加AgNO₃ 0.5～2.0mg/L的增殖培养基中预培养10d，然后转接到不含AgNO₃的增殖培养基中培养30d，诱导不定芽，形成新芽丛。增殖培养基配方为MS培养基中添加6-BA 1.0～3.0mg/L，IBA 0.01～0.1mg/L，蔗糖25～40g/L和卡拉胶8g/L制成，至培养基pH为5.8～6.0止。培养条件是在温度为25±2℃，光照(60μmol.m^-2.s^-1)时间12h/d。

(5)生根培养：

步骤(4)得到的增殖芽丛中芽高超过2cm的嫩茎切下，接入生根培养基；生根培养基配方为1/2MS培养基中添加IBA 0.1～0.5mg/L、蔗糖15～20g/L和卡拉胶8g/L制成，至培养基pH为5.8～6.0止。培养条件是在温度为25±2℃，光照(60μmol.m^-2.s^-1)时间12h/d。

(6)生根苗移栽：将生根培养20d的生根瓶苗移到温室中适应外界环境5～7d，然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗1d，将组培苗小心取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到泥炭土：珍珠岩＝3：1混合基质上，移栽后前20d采用盖膜保湿，然后揭开薄膜按常规幼苗管理，该移栽成活率高于90％。

上述刨花润楠组织培养繁殖方法，外植体的芽诱导速度快；诱导率高，增殖系数大、达3.52，生根率可达91％。通过规模化育苗，将为我国刨花润楠优良种质快速推广提供技术支持，为提升刨花润楠人工林经济效益提供优质种苗保障，有着极其重大的意义。

附图说明

图1为优树种子萌发。

图2为下胚轴诱导形成的芽丛。

图3为增殖培养基中的增殖芽。

图4为生根培养基中的生根苗。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所述技术领域的普通实验人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例一：

外植体采集与处理：选取生长健壮、树型圆满、无病虫害，树高10m以上的刨花润楠为采种母树，种子采集后，清水浸泡2～3d，搓掉外种皮，冲洗干净后，挑选出种实饱满，无病虫害的种子。用1000mg/L的GA₃溶液浸泡种子60min。

外植体表面消毒：在超净工作台上先将刨花润楠种子小心剥去膜质内种皮(注意不要伤及种胚),加入0.1％升汞溶液，浸泡12min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液用无菌水冲洗5～6次。

芽诱导：将消毒好的种子接种到诱导培养基MS₀+蔗糖30g/L+卡拉胶8g/L，至培养基pH为5.8-6.0止。每瓶接种一粒种子。5～7d之后，胚开始萌动，一个月后幼苗可达到3～4cm高。(图1)

丛芽增殖：

将芽切下，切为2～3cm茎段，转接入增殖培养基中培养。先在MS+6-BA 3.0mg/L+IBA 0.01mg/L+AgNO₃ 1.0mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶8g/L上预培养10d，再转入MS+6-BA 3.0mg/L+IBA 0.01mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶8g/L中培养30d，培养条件是在温度为25±2℃，光照(60μmol.m^-2.s^-1)时间12h/d。增殖系数可达3.52。(图2，图3)。

生根培养：

从增殖芽丛中选取2cm的健壮有效芽，转接到1/2MS+IBA 0.2mg/L+蔗糖15g/L+卡拉胶8g/L的生根诱导培养基中培养，培养条件是在温度为25±2℃，光照(60μmol.m^-2.s^-1)时间12h/d。20d后，不定根的诱导率为91％。(图4)

生根苗移栽：将生根培养20d的生根瓶苗移到温室中适应外界环境5～7d，然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗1d，将组培苗小心取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到泥炭土：珍珠岩＝3：1混合基质上，移栽后前20d采用盖膜保湿，然后揭开薄膜按常规幼苗管理，该移栽成活率高于90％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。