本发明属于植物种质资源保藏技术领域，具体涉及一种兰花种子的保存及育苗方法。
背景技术：
兰科植物俗称兰花，在我国有近2000年的栽培历史，是园艺花卉中的重要栽培植物。兰科植物多为珍稀濒危植物，全世界所有野生兰科植物均被列人《野生动植物濒危物种国际贸易公约》的保护范围，占该公约应保护植物的90％以上，是植物保护中的“旗舰”类群。历史上我国的花卉种质资源流失相当严重，而且现在仍然在流失，如果不采取切实有效的措施来保护我国兰花种质资源，将会给我国花卉业带来巨大损失。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种兰花种子的保存方法。
本发明的一种兰花种子的保存方法，包括以下步骤：
采收发育基本成熟而未开裂的兰花蒴果，消毒，无菌条件下将蒴果内的种子转移至灭菌的离心管内，盖上离心管盖并用透气膜密封，于4-6℃条件下保存。
优选，所述的兰花种子的保存方法，包括以下步骤：
采收发育基本成熟而未开裂的兰花蒴果，消毒，无菌条件下将单个蒴果内的种子全部脱落至无菌滤纸上，再转移至一个灭菌的1mL离心管内，盖上离心管盖并用透气膜密封，对离心管编号并记录其中种子的对应信息，于4-6℃条件下保存。
优选，所述的兰花为五唇兰(Doritis pulcherrima)、小花万代兰(Vanda coerulescens)或铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)。
优选，所述的发育基本成熟而未开裂的兰花蒴果为授粉后120天以上的未开裂的五唇兰(Doritis pulcherrima)蒴果、授粉后150天以上的未开裂的小花万代兰(Vanda coerulescens)蒴果或授粉后150天以上的未开裂的铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)蒴果。
优选，所述的消毒是将兰花蒴果在体积分数70％乙醇溶液中浸泡15～30s，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒15～20min，无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分。
本发明的第二个目的是提供一种兰花种子的保存及育苗方法。
一种兰花种子的保存及育苗方法，包括以下步骤：
a.保存：采收发育基本成熟而未开裂的兰花蒴果，消毒，无菌条件下将蒴果内的种子转移至灭菌的离心管内，盖上离心管盖并用透气膜密封，于4-6℃条件下保存；
b.育苗：将保存的种子取出，室温下放置至离心管内达到室温后，用无菌水将种子制作成种子悬浮液，然后取种子悬浮液均匀接种于一次成苗培养基上，一次培养成苗；所述的一次成苗培养基：每升含花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、香蕉泥50～100g、苹果泥10～20g、活性碳500～1000mg、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素(VB1)0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基嘌呤0.05～0.1mg、萘乙酸(NAA)0.2～2mg、蔗糖15～30g和琼脂6～7g，pH 5.4-5.6。
优选，所述的兰花为五唇兰(Doritis pulcherrima)、小花万代兰(Vanda coerulescens)或铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)。
优选，所述的发育基本成熟而未开裂的兰花蒴果为授粉后120天以上的未开裂的五唇兰(Doritis pulcherrima)蒴果、授粉后150天以上的未开裂的小花万代兰(Vanda coerulescens)蒴果或授粉后150天以上的未开裂的铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)蒴果。
优选，所述的消毒是将兰花蒴果在体积分数70％乙醇溶液中浸泡15～30s，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒15～20min，无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分。
优选，所述的种子悬浮液的浓度为10-15粒种子/mL无菌水，所述的种子悬浮液的接种量为20-30粒种子/150mL一次成苗培养基。经本方法存放的种子不需再经表面消毒处理，采用非共生萌发技术进行无菌播种，可迅速得到种苗。
本发明将兰花种子在4-6℃条件下贮存5年后，种子发芽率虽然有下降，但仍然保持较高的萌发率(75.2％)，该保存方法可以作为兰花种质资源保存的一种选择方案，其优点是所需贮存空间小，设施条件简单、廉价、无污染，保存容量巨大，一个25cm*10cm*5cm的塑料盒可以存储高达数以亿粒计的兰花种子，从目前得到的结果推算保存期可以长达10年以上，是一种高效的兰花种质资源保存方法。本发明具有贮存空间小，设施条件简单、廉价、无污染，保存容量巨大，保存成本低廉等特点，特别是对经济欠发达的国家和地区来说意义十分重大，可以花费不多、要求不高就能保存在着大量的兰花种质资源，解决一些经济欠发达的国家或地区虽种质资源丰富，但又无力建造低温库来保存种质资源而导致严重丢失的矛盾。
种子保存过程中影响其贮藏寿命的因素土要有两个，一个是种子含水量，另一个是贮藏温度。当种子水分高于14％时，微生物在种子的表面和内部繁殖侵染，显著而迅速地缩短了种子的寿命。本发明采用的具有一定透气性无菌的塑料离心管低温存储兰花种子，种子在存储过程中缓慢失水，呼吸代谢水平比较低，保存环境相对湿度较低，加上对种子进行的是无菌保存，减少了微生物对种子活力的破坏，种子无菌的条件下进行缓慢的新陈代谢，保持着较高的生命力，因此大大延长了种子的保存期。本发明的兰花种子库建立程序是对兰花进行人工授粉，果实发育120～180天时，取果实经表面消毒后，无菌条件下将兰花种子收集在已灭菌的塑料离心管中，不需经过脱水干燥处理，用透气膜密封好放置于4-6℃避光保存，即在无菌状态下透气保存，可作为兰花中长期保存方法。
兰花果实中种子数量巨大，可以利用很小的空间建立其种子库而进行中长期有效的种质资源保存，这种保存方法具有设备简单、易操作、成本低等优点，可通过种子库中存储的兰花有活力种子的萌发而达到恢复群体、培养新品种等目的，本发明具有重要的科研价值和应用价值。本发明保存的种子量大，种子轻，占空间小，1立方空间可存储8万个果实。如果一个果为一个种，那就可存储8万个种，如果一个果实有10万粒种子，那可存储80亿粒兰花种子。本发明的兰花种子是单果单管保存，保证种子的专一性和纯正性。利用本发明方法，可望在兰花种质资源存储方法上找到一条简单、容易操作、成本低廉的途径，可为有效保存兰花种质资源、新品种培育、濒危品种的种苗生产及生态恢复等奠定其物质基础，从而可为我国兰花新品种培育及其产业的可持续发展奠定基础，增强我国在世界花卉产业上的竞争力，并获得较好的经济效益和社会效益、生态效益。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例中使用的花宝1号、花宝2号为美国HYPONeX化学公司生产、台湾台和园艺企业股份有限公司分装产品。使用的透气膜是M封口膜(PM-996)，该封口膜产品的厚度均为0.005"(127μm)(4*1.25)，产地美国，从国内相关的设备销售公司购买。
实施例1：五唇兰(Doritis pulcherrima)种子的保存及育苗方法
1.人工授粉：五唇兰于当年8月初开花时，选择生长健壮植株，于白天上午十时，以灭了菌的牙签为工具，挑取开放两天左右的花朵上的有活力花粉块，将其授于另外一朵开放两天左右的花朵的柱头上，共授粉20朵花。授粉后摘除母本的唇瓣后套袋，约1星期后去袋，要挂上标签，标签上具有父、母本名称、杂交日期和授粉人等信息。
2.培育蒴果：成功进行人工授粉后，加强母本植株的肥水管理，保证人工授粉蒴果的正常发育直至成熟。
3.消毒蒴果及制作种子库：选取果龄为120天的蒴果(此时蒴果发育基本成熟而未开裂)，在体积分数70％乙醇溶液中浸泡15～30s，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒15～20min，无菌水冲洗4～5次，于超净工作台上无菌条件下用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分。接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子全部脱落至无菌滤纸上，再把来自于同一个蒴果的种子集中放置于已经高温灭菌的1mL的塑料离心管内，盖上盖子，再用透气膜密封离心管。在离心管上标示一个早定的编号，电脑文档上存储编号对应清楚该五唇兰种子的相关信息，再把离心管放置于分属或分种的塑料盒(25cm*10cm*5cm)内，存储10个蒴果的种子，此塑料盒装载的即是五唇兰的种子库。
4.低温保存：将存放了离心管的塑料盒子放置4℃冰箱条件下存储。
5.无菌播种：将存放冰箱一定时间(5～10年)的五唇兰种子取出，室温条件下放置两个小时至离心管内达到室温，然后于超净工作台上用无菌水将五唇兰种子制作成种子浓度为10-15粒/mL的接种用的种子悬浮液。无菌条件下用移液枪吸取接种用的种子悬浮液2mL至一次成苗培养基上并使种子均匀分布于该培养基上，每个兰花培养瓶中装有150mL该培养基、接种的种子数量20-30粒。经统计，保存5年后的五唇兰种子萌发率为74.8％。所用的一次成苗培养基：每升含花宝1号1g、花宝2号1g、蛋白胨0.5g、土豆泥40g、香蕉泥50g、苹果泥10g、活性碳500mg、肌醇80mg、甘氨酸1.5mg、盐酸硫胺素(VB1)0.05mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.4mg、烟酸0.4mg、6-苄基嘌呤0.05mg、萘乙酸(NAA)0.2mg、蔗糖15g和琼脂6g，pH 5.4；其配制方法是：将上述各组分混合均匀后，于1.06kg/cm2(121℃)条件下灭菌20min，待培养基冷却前进行无菌分装。
6.一次成苗培养：将接种好的五唇兰种子置于自然光照培养室中(26±2)℃培养，培养6～8个月后一次培养成苗。
实施例2：小花万代兰(Vanda coerulescens)种子的保存及育苗方法
1.人工授粉：小花万代兰于当年9月初开花时，选择生长健壮植株，于白天上午十时，以灭了菌的牙签为工具，挑取开放两天左右的花朵上的有活力花粉块，将其授于另外一朵开放两天左右的花朵的柱头上，共人工授粉20朵。授粉后摘除母本的唇瓣后套袋，约1星期后去袋，要挂上标签，标签上具有父、母本名称、杂交日期和授粉人等信息。
2.培育蒴果：成功进行人工授粉后，加强母本植株的肥水管理，保证人工授粉蒴果的正常发育直至成熟。
3.消毒蒴果及制作种子库：选取果龄为150天的蒴果(此时蒴果发育基本成熟而未开裂)，在体积分数70％乙醇溶液中浸泡15～30s，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒15～20min，无菌水冲洗4～5次，于超净工作台上无菌条件下用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分。接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子全部脱落至无菌滤纸上，再把来自于同一个蒴果的种子集中放置于已经高温灭菌的1mL的塑料离心管内，盖上盖子，再用透气膜密封离心管。在离心管上标示一个早定的编号，电脑文档上存储编号对应清楚该小花万代兰种子的相关信息，再把离心管放置于分属或分种的塑料盒(25cm*10cm*5cm)内，存储10个蒴果的种子，此塑料盒装载的即是小花万代兰的种子库。
4.低温保存：将存放了离心管的塑料盒子放置5℃冰箱条件下存储。
5.无菌播种：将存放冰箱一定时间(5～10年)的小花万代兰种子取出，室温条件下放置两个小时至离心管内达到室温，然后于超净工作台上用无菌水将小花万代兰种子制作成种子浓度为10-15粒/mL的接种用的种子悬浮液。无菌条件下用移液枪吸取接种用的种子悬浮液2mL至一次成苗培养基并使种子均匀分布于该培养基上，每个兰花培养瓶中装有150mL该培养基、接种的种子数量20-30粒。经统计，保存5年后的小花万代兰种子萌发率为75.2％。所用的一次成苗培养基：每升含花宝1号2g、花宝2号2g、蛋白胨2g、土豆泥80g、香蕉泥100g、苹果泥20g、活性碳1000mg、肌醇120mg、甘氨酸2.5mg、盐酸硫胺素(VB1)0.2mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.8mg、烟酸0.8mg、6-苄基嘌呤0.1mg、萘乙酸(NAA)2mg、蔗糖30g和琼脂7g，pH 5.6；其配制方法是：将上述各组分混合均匀后，于1.06kg/cm2(121℃)条件下灭菌20min，待培养基冷却前进行无菌分装。
6.一次成苗培养：将接种好的小花万代兰种子置于自然光照培养室中(26±2)℃培养，培养6～8个月后一次培养成苗。
实施例3：铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)种子的保存及育苗方法
1.人工授粉：铁皮石斛当年3月初开花时，选择生长健壮植株，于白天上午十时，以灭了菌的牙签为工具，挑取开放两天左右的花朵上的有活力花粉块，将其授于另外一朵开放两天左右的花朵的柱头上，共授粉20朵。授粉后摘除母本的唇瓣后套袋，约1星期后去袋，要挂上标签，标签上具有父、母本名称、杂交日期和授粉人等信息。
2.培育蒴果：成功进行人工授粉后，加强母本植株的肥水管理，保证人工授粉蒴果的正常发育直至成熟。
3.消毒蒴果及制作种子库：选取果龄为150天的蒴果(此时蒴果发育基本成熟而未开裂)，在体积分数70％乙醇溶液中浸泡15～30s，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒15～20min，无菌水冲洗4～5次，于超净工作台上无菌条件下用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分。接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子全部脱落至无菌滤纸上，再把来自于同一个蒴果的种子集中放置于已经高温灭菌的1mL的塑料离心管内，盖上盖子，再用透气膜密封离心管。在离心管上标示一个早定的编号，电脑文档上存储编号对应清楚该铁皮石斛种子的相关信息，再把离心管放置于分属或分种的塑料盒(25cm*10cm*5cm)内，存储10个蒴果的种子，此塑料盒装载的即是铁皮石斛的种子库。
4.低温保存：将存放了离心管的塑料盒子放置6℃冰箱条件下存储。
5.无菌播种：将存放冰箱一定时间(5～10年)的铁皮石斛种子取出，室温条件下放置两个小时至离心管内达到室温，然后于超净工作台上用无菌水将铁皮石斛种子制作成种子浓度为10-15粒/mL的接种用的种子悬浮液。无菌条件下用移液枪吸取接种用的种子悬浮液2mL至一次成苗培养基并使种子均匀分布于该培养基上，每个兰花培养瓶中装有150mL该培养基、接种的种子数量20-30粒。经统计，保存5年后的铁皮石斛种子萌发率为74.3％。所用的一次成苗培养基：每升含花宝1号2g、花宝2号2g、蛋白胨1.5g、土豆泥60g、香蕉泥80g、苹果泥20g、活性碳800mg、肌醇100mg、甘氨酸2mg、盐酸硫胺素(VB1)0.2mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.6mg、烟酸0.8mg、6-苄基嘌呤0.1mg、萘乙酸(NAA)2mg、蔗糖25g和琼脂7g，pH 5.6；其配制方法是：将上述各组分混合均匀后，于1.06kg/cm2(121℃)条件下灭菌20min，待培养基冷却前进行无菌分装。
6.一次成苗培养：将接种好的铁皮石斛种子置于自然光照培养室中(26±2)℃培养，培养6～8个月后一次培养成苗。