一种快速的胡萝卜组培体系的制作方法

本发明涉及胡萝卜快速组培体系的建立。该体系用于快速获得胡萝卜愈伤及组培苗。

背景技术：

胡萝卜(Daucus carrot L.)，伞形科胡萝卜属二年生草本植物，以肉质根作蔬菜食用，生产成本低且利于管理，是世界重要蔬菜作物之一。胡萝卜肉质根营养丰富，含有丰富的可溶性蛋白、水、糖，还含有大量的钾、钙、磷、铁等盐类。另外，胡萝卜富含维生素A前体类胡萝卜素和植物纤维，因而也是一种重要的营养保健品。

胡萝卜具有良好的组织培养和遗传转化基础，是组织培养和遗传转化研究中的经典材料。近年来，利用遗传工程进行胡萝卜改良育种工作已经取得了一定的进展，但对胡萝卜营养物质合成所涉及的基因功能没有得到更好的验证研究。组培是快速繁殖材料及转基因验证的基础，如何快速、简单、高效的建立胡萝卜组培体系，是胡萝卜基因研究的基础。为此，我们通过对胡萝卜进行组培体系的优化，建立一种快速胡萝卜组培体系。

技术实现要素：

1、对胡萝卜组织培养过程所涉及的步骤进行了完善和优化。

2、在优化胡萝卜组培步骤的基础上，建立了胡萝卜一种快速组培体系，该体系包括：胡萝卜种子催芽与无菌苗的获得、愈伤诱导、愈伤分化、生根以及炼苗。

附图说明

图1.胡萝卜种子催芽及无菌苗的获得

图2.胡萝卜无菌苗下胚轴形成的愈伤组织及分化芽

图3.胡萝卜芽苗的生根和炼苗

具体实施方式

1.胡萝卜种子预处理。胡萝卜种子因有绒刺，较难灭菌，而且不同的存储时间对种子的影响也不同，需要对胡萝卜种子进行预处理。处理方法为：种子60～80粒放置于2mL管内，先用自来水清洗5遍种子，室温下浸泡3h，期间偶尔搅动并除去漂浮物及发育不良的种子。移除水分。

2.胡萝卜种子消毒及催芽方法。预处理后的种子首先经70％酒精消毒2遍，然后用20％NaClO先冲洗1遍，再用20％NaClO消毒45min(每次均加满2mL管消毒试剂)，期间偶尔搅动使种子充分消毒。消毒后的种子用无菌水清洗3遍，最后用移液枪或者灭菌的滤纸吸去多余液体，平铺在不添加任何激素的1/2MS基本培养基上面催芽，种子30～40粒每皿，培养皿直径90mm。培养皿放置在光照培养箱中，光暗比为12h/12h，弱光下光密度为50μmol*(m²·s)^-1，25℃培养7～10d(图1)。

3.胡萝卜愈伤诱导。胡萝卜种子下胚轴剪成相同大小一致的小块(3mm～7mm，20～25个每培养皿)，平铺在愈伤诱导培养基上，25℃下暗培养，诱导时间为30d(图2)。形成的愈伤组织较为松散，生长力旺盛，愈伤诱导率为百分之百，并在下一步愈伤分化过程中分化率最高。愈伤诱导培养基为B5基本培养基，添加激素配比分别为2.0mg/L 6-BA+2.0mg/L 2，4-D和2.5mg/L 6-BA+2.5mg/L 2，4-D 2个浓度，pH为5.8，高温灭菌后使用。

4.胡萝卜分化诱导。挑选愈伤松散、色泽淡黄、生长旺盛的组织，接种于分化培养基上(15～20个每皿)，分化时间为30d。培养在光暗比为16h/8h，光密度约为300μmol*(m²·s)^-1，温度25℃条件 下的光照培养箱中。分化培养基为不添加任何激素的B5培养基。

5.胡萝卜生根诱导。将愈伤组织上分化出的不定芽或者胚状体用灭菌的镊子夹下，平铺在生根培养基中，使已分化的不定芽和胚状体生根再生(图3)。培养条件与分化诱导环境条件相同。生根培养基为不添加任何激素的B5培养基。

6.炼苗：植株长出6～7片叶并形成根系时，进行炼苗(图3)。炼苗条件与分化诱导环境条件相同。将植株转入已装有生根培养基的玻璃试管中，使芽苗粗壮。2周左右观察植株生长状况，生长良好的植株开启瓶盖，自来水轻轻冲洗除去根系上的培养基，栽种在装有1∶1蛭石和泥炭土的盆钵中，用塑料薄膜覆盖住盆口。一周后慢慢掀开塑料薄膜适当通风炼苗，待再生苗适应外部环境条件后，既可在培养室中进行常规栽培管理。

结果1：胡萝卜采用20％NaClO消毒45min可以彻底灭菌，同时出芽率较高，幼苗生长整齐、旺盛。

结果2：愈伤诱导与分化过程中，B5培养基添加2.0mg/L 2，4-D和2.0mg/L 6-BA激素下愈伤组织分化率为82％。

结果3：将愈伤组织的分化芽切下直接转移到B5培养基上，全部分化芽均能生根并继续正常生长。再生苗炼苗过程中，在玻璃试管中的炼苗2周左右较为合适。